一種離子液體反應(yīng)介質(zhì)中脂肪酶催化合成長(zhǎng)鏈殼聚糖酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物催化和合成領(lǐng)域，具體涉及一種離子液體反應(yīng)介質(zhì)中脂肪酶催化合成長(zhǎng)鏈殼聚糖酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]殼聚糖(ChitOsan，簡(jiǎn)稱CS)是甲殼素的脫乙酰化產(chǎn)物，是自然界中存儲(chǔ)量最大的堿性生物多糖殼聚糖，也是自然界中含量?jī)H次于纖維素的天然多糖，由2-胺基-2-脫氧-β-葡萄糖單元通過β(1_4)糖苷鍵鏈接而成。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與纖維素相似，唯一的區(qū)別就是葡萄糖單元C2上的羥基變?yōu)榘坊蛞阴０被?。由于分子鏈與分子間也存在著較強(qiáng)的氫鍵作用，導(dǎo)致可用于殼聚糖溶解及化學(xué)改性的溶劑很少，極大地限制了其應(yīng)用。目前，溶解甲殼素和殼聚糖的方法主要是通過破壞內(nèi)部氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使之溶解，而溶解殼聚糖的傳統(tǒng)溶劑體系(如:強(qiáng)堿溶液體系，鋰鹽-強(qiáng)極性非質(zhì)子極性溶劑體系等)具有毒性、強(qiáng)腐蝕性、后續(xù)處理麻煩等缺點(diǎn)，不利于綠色環(huán)保的工業(yè)化生產(chǎn)。因此尋找一類溫和的、并能均相溶解殼聚糖是拓展其應(yīng)用的重要內(nèi)容和方向。
[0003]離子液體與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，具有不揮發(fā)、不易燃、難氧化、強(qiáng)極性、強(qiáng)的溶解能力、組成可設(shè)計(jì)、電化學(xué)窗口寬等優(yōu)良特性，在天然高分子溶解、化學(xué)合成、電化學(xué)、萃取分離、材料制備等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用日益引起世人的關(guān)注。從目前的研究報(bào)道來看，能夠溶解殼聚糖的離子液體主要為咪唑類離子液體和甘氨酸類離子液體。Xie等最早進(jìn)行了殼聚糖在離子液體中的溶解，并研究其溶液用于CO2的吸附，110°C下制備了 10%的殼聚糖/[BMIM]C1離子液體溶液，朱慶松等比較了四種咪唑類離子液體對(duì)殼聚糖的溶解特性，不同的離子液體溶解能力:[EMM]AC> [BMIM]AC> [AMIM]C1 > [BMHCCl，尤其是[EMM]AC離子液體對(duì)殼聚糖的溶解能力達(dá)15%以上。
[0004]生物催化反應(yīng)因其具有條件溫和、無環(huán)境污染、速度快、選擇性高等特點(diǎn)、被廣泛應(yīng)用于各種有機(jī)反應(yīng)。自20世紀(jì)80年代中期Klibanov等發(fā)現(xiàn)酶可在接近無水的有機(jī)溶劑中起催化作用以來，非水生物催化得以迅速發(fā)展。非水生物催化使得許多在水中無法進(jìn)行的有機(jī)反應(yīng)在有機(jī)溶劑中完成。雖然非水生物催化反應(yīng)后處理方便，但有機(jī)溶劑自身的毒性、易燃性、揮發(fā)性等屬性、會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染并危害操作者健康，同時(shí)酶在有機(jī)溶劑中往往表現(xiàn)為活力下降，甚至喪失。
[0005]離子液體以其獨(dú)特的性質(zhì)也成為生物催化領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。脂肪酶(Lipase)在生物催化中有著廣泛的應(yīng)用，由于脂肪酶對(duì)有機(jī)溶劑具有強(qiáng)耐受性，故成為離子液體中的首選生物轉(zhuǎn)化酶。大部分脂肪酶在離子液體中進(jìn)行反應(yīng)有著良好的催化效果，其催化活性、立體選擇性和穩(wěn)定性明顯提高。例如KM等在離子液體中考察了幾種不同的仲醇與乙酸乙烯酯在脂肪酶催化下的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物ee(光學(xué)純度)值高達(dá)99.5%，脂肪酶可以附著在離子液體中，產(chǎn)物經(jīng)過分離后，脂肪酶/離子液體可以循環(huán)使用，盡管速率減慢，但是產(chǎn)物光學(xué)純度并不降低。ITOH等還考察了無水條件下，在離子液體[BMIM][PF6]或[BMIM][BF4]中，Novozym-435催化的5-苯基-1-戊稀-3-醇與甲酸酯的反應(yīng)，得到了較高的反應(yīng)速率和立體選擇性，所用的酶可以循環(huán)使用，但是所生成的乙醛低聚物在溶劑中的聚積又會(huì)使反應(yīng)速率顯著下降。當(dāng)把反應(yīng)條件改在40°C下減壓進(jìn)行時(shí)，酶循環(huán)使用就可以得到相應(yīng)的反應(yīng)速率和產(chǎn)物選擇性。
[0006]目前，殼聚糖酯化改性過程中用到的酸多為無機(jī)酸，例如殼聚糖的硫酸酯化改性以及磷酸酯化改性，且酯化過程中需要保護(hù)和脫除氨基，實(shí)驗(yàn)操作步驟復(fù)雜并且產(chǎn)生酸性廢液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種條件溫和、選擇專一性、產(chǎn)物易分離的離子液體反應(yīng)介質(zhì)中脂肪酶生物催化制備長(zhǎng)鏈殼聚糖酯的方法。
[0008]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種離子液體反應(yīng)介質(zhì)中脂肪酶催化合成長(zhǎng)鏈殼聚糖酯的方法，包括如下步驟:
(1)將殼聚糖粉末經(jīng)研磨、烘干處理后放入干燥器中備用；
(2)在容器中加入3-10g離子液體反應(yīng)介質(zhì)，加入步驟(I)處理后的殼聚糖，再通入氮?dú)獠⒃谟驮″佒屑訜釘嚢瑁瑴囟葹?0-120 °C；
(3)待殼聚糖完全溶解后，冷卻至20-70°C，加入酰基供體0.1 g-5 g，同時(shí)加入脂肪酶0.01 g-0.2 g，繼續(xù)通氮?dú)鈹嚢?-8 h；
(4)將步驟(3)所得產(chǎn)物用無水乙醇洗凈后，于40-80°C抽真空干燥；
(5)將步驟(4)所得產(chǎn)物在堿性條件下皂化，測(cè)定酯化反應(yīng)的取代度DS。
[0009]進(jìn)一步地，步驟(2)所述的離子液體反應(yīng)介質(zhì)為1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽([EMIMlAc), 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM] [BF4])和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMHC [PF6])中的一種或一種以上。
[0010]進(jìn)一步地，步驟(3)所述的?；w為月桂酸乙烯酯、月桂酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯中的任意一種。
[0011 ] 進(jìn)一步地，步驟(3)所述的脂肪酶為固定化Novozyme-435，是一種由B脂肪酶Candida antarctic得到的脂肪酶；固定化Novozyme-435由經(jīng)過基因改性的米曲霉微生物進(jìn)行深層發(fā)酵并吸附在大孔性樹脂上而制成。
[0012]進(jìn)一步地，步驟(5)測(cè)得酯化產(chǎn)物的取代度為0.01-2.00。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
(1)采用高效、高穩(wěn)定性的生物催化劑固定化脂肪酶來催化殼聚糖合成長(zhǎng)鏈殼聚糖酯，克服了現(xiàn)有技術(shù)中酶容易失活，反應(yīng)效率低的缺點(diǎn)；反應(yīng)過程簡(jiǎn)單可控、產(chǎn)物易分離，且固定化酶可反復(fù)使用，降低生產(chǎn)成本；
(2)固定化脂肪酶的選擇專一性，省去了化學(xué)法中合成殼聚糖酯保護(hù)和脫去氨基的步驟，簡(jiǎn)化反應(yīng)操作過程；
(3)利用了非水相酶催化的新技術(shù)，采用離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)，未反應(yīng)的酰基供體可用無水乙醇溶解洗滌除去，簡(jiǎn)化了產(chǎn)物分離步驟，得到的產(chǎn)品雜質(zhì)少;洗滌的乙醇可以回收重復(fù)利用，降低了生產(chǎn)成本；
(4)反應(yīng)條件溫和，無化學(xué)法的含酸廢液排放，環(huán)境友好。
【具體實(shí)施方式】
[0014]為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表示的范圍。
[0015]實(shí)施例1
在25 ml三口燒瓶中加入5 g 1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽([EMIM]Ac)離子液體，再將0.161 g殼聚糖粉末經(jīng)研磨、烘干處理后放入三口燒瓶中，通入氮?dú)獠⒃谟驮″佒屑訜釘嚢?，溫度?0 °C。用偏光顯微鏡觀察殼聚糖完全溶解后，冷卻至30 °C，加入5 ml的月桂酸乙稀酯，同時(shí)加入0.15 g固定化Novozyme-435，繼續(xù)通氮?dú)夥磻?yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去固定化Novozyme-435，并用無水乙醇洗去離子液體和未反應(yīng)的月桂酸乙稀酯。所得產(chǎn)物60 °C下真空干燥24 h后在堿性條件下皂化，測(cè)得取代度為0.135。
[0016]實(shí)施例2
在25 ml三口燒瓶中加入3 g 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM][BF4])和3 g 1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽([EMIM]Ac)的混合離子液體，將0.161 g殼聚糖粉末經(jīng)研磨、烘干處理后放入三口燒瓶中，通入氮?dú)獠⒃谟驮″佒屑訜釘嚢瑁瑴囟葹?0 °C。用偏光顯微鏡觀察殼聚糖完全溶解后，冷卻至40 °C，加入5 ml的月桂酸甲酯，同時(shí)加入0.15 g固定化Novozyme-435，繼續(xù)通氮?dú)夥磻?yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去固定化Novozyme-435，并用無水乙醇洗去離子液體和未反應(yīng)的月桂酸甲酯。所得產(chǎn)物60 °C下真空干燥24 h后在堿性條件下皂化，測(cè)得取代度為0.415。
[0017]實(shí)施例3
在25 ml三口燒瓶中加入I gl-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIM][PF6])和4 gl_乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽([EMIM]Ac)的混合離子液體，將0.161 g殼聚糖粉末經(jīng)研