一種使用耐熱重組hnh型核酸內切酶切割dna的方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于基因工程技術領域，涉及基因工程技術，具體涉及構建能夠過量表達 耐熱HNH型核酸內切酶的基因工程菌、并將其應用在高溫條件下切割DNA的方法。
【背景技術】
[0002] 核酸酶是一類水解核酸磷酸二酯鍵的酶，存在幾乎在所有的生物體中。核酸酶在 遺傳機制的不同方面發(fā)揮重要的作用，例如避免突變、DNA修復、DNA復制和重組、為生長代 謝清除核苷和磷酸、宿主防御外源的核酸分子、病毒感染宿主的建立和細胞凋亡等。除此之 外，核酸酶還被廣泛應用于分子生物學的各種研究中，例如核酸結構的檢測、RNA的快速測 序、蛋白純化中去除核酸以及抗病毒試劑的應用等。
[0003] 根據(jù)核酸酶作用的方式，核酸酶可以分為核酸內切酶和核酸外切酶。核酸內切酶 從核酸的內部切開核酸，核酸外切酶從核酸的一端逐個切開核酸，作用時產(chǎn)生單核苷酸。此 外，也有少數(shù)既作用于鏈的內部又作用于鏈的外部的核酸酶，例如小球菌核酸酶。根據(jù)核酸 酶作用的底物，核酸酶可以分為RNA酶、DNA酶以及非特異性核酸酶。RNA酶只作用于RNA，DNA 酶只作用于DNA，非特異性核酸酶對RNA、DNA兩者均可切割。
[0004] HNH(Histine-Asparagine_Histine，組氨酸-天冬酰胺-組氨酸）型核酸內切酶具 有兩個高度保守的組氨酸(His)和一個高度保守的天冬酰胺(Asn)的結構域，該保守的結構 域約由35個氨基酸組成，如圖1所示。HNH型核酸內切酶包括大腸菌素 E7和E9、S1和S2膿菌素 和一些DNA限制性核酸內切酶，比如Kpnl，PacI和Hpy99I。目前，關于源自于噬菌體HNH型核 酸內切酶的報道，多數(shù)是從常溫菌中發(fā)現(xiàn)。這些源自常溫菌的HNH型核酸內切酶只能在常溫 條件例下切割DNA，不能在高溫條件下發(fā)揮切割核酸的功能，使其應用受到了限制?，F(xiàn)有技 術中，關于該高溫噬菌體HNH型核酸內切酶的表達及應用，尚未有研究和報道。
[0005] GVE2(Geobacillus virus E2)是從分離于自東太平洋深海熱液區(qū)的嗜熱菌 Geobacillus sp. 263分離出的一種高溫噬菌體。GVE2能夠生存在高溫環(huán)境(例如:生長溫度 為60°C，Liu B, Zhang X. Deep-sea thermophilic Geobacillus bacteriophage GVE2transcriptional profile and proteomic characterization of virions.Appl Microbiol Biotechnol .2008 80(4) :697-707)，是一個典型的Siphoviridae·菌體，與入口麓 菌體在形態(tài)上極其相似，但其基因組序列和預測的蛋白質序列與λ噬菌體同源性很低。目 前，GVE2基因組的測序已經(jīng)完成，其編碼一種ΗΝΗ型核酸內切酶。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于利用基因工程技術構建一株能夠過量表達GVE2HNH型核酸內切 酶的基因工程菌，通過誘導表達、熱處理和鎳離子親和柱純化等步驟，制備出可以在溫度高 于60°C的條件下高效切割雙鏈DNA的電泳級耐熱重組酶蛋白，以便于在高溫環(huán)境下有效切 害扣NA，可以應用于如分子生物學、疫苗工業(yè)、蛋白和多糖類制藥工業(yè)等涉及到核酸去除的 催化領域。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案具體如下：
[0008] 本發(fā)明提供了一種使用耐熱重組HNH型核酸內切酶切割DNA的方法，其特征在于， 包括以下步驟：
[0009] 1)利用具有如下核苷酸序列的擴增引物，以GVE2基因組為模板進行PCR擴增：
[0010] 正向引物為：5'-GGA ATT CCA TAT GCC AAG CAA ACC ACT GCG ACC-3'，
[0011] 反向引物為：5'-CCG CTC GAG CCC ΑΤΑ CCG TCG CTT ATC TTC CG-3'；
[0012] 2)對步驟1)中得到的PCR擴增產(chǎn)物和pET_30a載體進行Ndel和Xhol雙酶切反應；
[0013] 3)回收并純化步驟2)中所得的酶切后的PCR產(chǎn)物和pET-30a載體片段后，進行酶基 因與載體的連接反應；
[0014] 4)將步驟3)中所得的連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細胞中，隨后涂布在含有卡那霉素的 LB平板進行培養(yǎng)后挑取克隆，并提取質粒進行測序驗證；
[0015] 5)將步驟4)中獲得的基因序列正確的克隆質粒轉化到感受態(tài)細胞中進行誘導表 達；
[0016] 6)從步驟5)中所獲得的細胞中提取并純化該GVE2HNH型耐熱重組核酸內切酶；
[0017] 7)使用步驟6)中獲得的GVE2HNH型核酸內切酶切割DNA:切割反應溫度大于60°C， 切割反應pH值大于5.5。
[0018] 優(yōu)選地，步驟7)中所述的切割反應溫度為60-70°C。
[0019] 優(yōu)選地，步驟7)中所述切割反應pH值為大于7.5。
[0020] 優(yōu)選地，步驟7)中所述切割反應中加入Fe2+，Zn2+，Mn 2+，Mg2+，Ca2+，Ni2+或者Co2+，以 不同程度促進該酶切割DNA，其中，Mn 2+是該酶切割反應的最佳金屬離子。
[0021] 優(yōu)選地，步驟7)中所述切割反應中不使用鹽，高鹽會抑制該酶切割DNA的能力。
[0022] 可選地，步驟6)中所述的提取并純化處理方法為對所述細胞進行超聲波破碎、熱 處理和鎳離子親和柱純化。
[0023] 可選地，步驟7)中使用GVE2HNH型核酸內切酶切割DNA的反應體系為20yL: 200ng質 粒pET-30a DNA或者XDNA、20mM Tris-HCl pH 8.0、lmM DTT、100nM GVE2HNH型核酸內切酶、 2mM MnCl2、0.1mg/ml BSA和10%甘油;切割反應時間為15分鐘。
[0024]本發(fā)明達到了如下的有益效果：
[0025] (1)利用基因工程技術，構建了 一種表達耐熱GVE2HNH型核酸內切酶的基因工程 菌，該基因工程菌能夠高效的表達GVE2HNH型核酸內切酶，且后續(xù)的純化步驟簡單易行，很 容易得到大量的該耐熱重組酶蛋白（每升發(fā)酵液可得到2mg耐熱重組酶蛋白）；
[0026] (2)該耐熱重組核酸內切酶分子量為16 · 78kDa，活力高，具有非特異切害UDNA的能 力，能夠在高溫條件(大于60 °C )下無特異性地切割DNA，能夠作為培養(yǎng)細胞上清和細胞裂解 液去粘度的首選酶制劑，在分子生物學、疫苗工業(yè)、蛋白和多糖類制藥工業(yè)等涉及到核酸去 除的催化領域有著廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0027]圖1是部分HNH型核酸內切酶的氨基酸序列比對。HNH型核酸內切酶源自于高溫噬 菌體GVE2和常溫菌體：Bacillus phage gamma，Bacillus phage phi 105，Clostridium phage phi3626，Enterobacteria phage HK97。保守的氨基酸殘基加粗表示。
[0028]圖2是誘導前、誘導后、超聲波破碎細胞、熱處理和鎳離子親和純化等步驟的SDS-PAGE結果圖。
[0029]圖3是GVE2HNH型核酸內切酶的質譜分析結果。
[0030]圖4是反應溫度對GVE2HNH型核酸內切酶切割DNA影響的電泳凝膠圖。
[0031]圖5是GVE2HNH型核酸內切酶熱穩(wěn)定性的電泳凝膠圖。
[0032]圖6是酶量對GVE2HNH型核酸內切酶切割DNA影響的電泳凝膠圖。
[0033]圖7是反應時間對GVE2HNH型核酸內切酶切割DNA影響的電泳凝膠圖。
[0034]圖8是反應pH對GVE2HNH型核酸內切酶切割DNA影響的電泳凝膠圖。
[0035] 圖9是金屬離子(Fe2+、Zn2+、Mn2+和Cu2+)對GVE2HNH型核酸內切酶切害UDNA影響的電 泳凝膠圖。
[0036] 圖10是金屬離子(Mg2+、Ca2+、Ni2+和Co2+)對GVE2HNH型核酸內切酶切害UDNA影響的電 泳凝膠圖。
[0037]圖11是鹽濃度對GVE2HNH型核酸內切酶切割DNA影響的電泳凝膠圖。
【具體實施方式】
[0038]為了闡明本發(fā)明的技術方案及技術目的，下面結合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明 做進一步的介紹。
[0039] 實施例1
[0040]本實施例中，利用基因工程技術構建能夠過量表達GVE2HNH型核酸內切酶的基因 工程菌，通過誘導表達、熱處理和鎳離子親和柱純化等步驟，制備出可以在高溫條件下高效 切割雙鏈DNA的電泳級耐熱重組酶蛋白，并將該耐熱重組HNH型核酸內切酶用于切割DNA時， 包括以下步驟：
[0041 ] 1、GVE2HNH型核酸內切酶基因的克隆：
[0042] 1)從GenBank中下載GVE2HNH型核酸內切酶的基因序列，自行設計含有兩個不同限 制性核酸內切酶一對引物：
[0043] 正向引物序列為：5'-GGA ATT CCA TAT GCC AAG CAA ACC ACT GCG ACC-3'，其中 下劃線序列為Nde頂每的酶切位點；
[0044] 反向引物序列為:5'-CCG CTC GAG CCC ΑΤΑ CCG TCG CTT ATC TTC CG-3'，其中 下劃線序列為Xho頂每的酶切位點；
[0045] 2)PCR擴增該酶基因：
[0046] a)利用該對引物，以GVE2基因組為模板進行PCR擴增；
[0047] 其中，PCR反應體系為50yL，包括：5yL 10x PCR buffer(Mg2+plus)、4yL 2.5mM dNTP、2yL ΙΟμΜ正向引物、2yL ΙΟμΜ反向引物、lOOng GVE2基因組DNA以及0.5μ1 Pfu DNA聚