專利名稱：基于核酸內(nèi)切酶消化的甲基化dna檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲基化DNA的檢測(cè)方法，尤其涉及一種不易受干擾的甲基化DNA 的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點(diǎn)的胞嘧啶(C)殘基的5，碳上被修飾了一個(gè)甲基。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修飾之一，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發(fā)生在DNA鏈上的CpG 二核苷酸的胞嘧啶殘基上，這常見(jiàn)于基因5’端表達(dá)調(diào)控序列。 DNA甲基化在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要作用，參與了動(dòng)物胚胎發(fā)育、基因印記和X染色體失活等過(guò)程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)互相作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個(gè)重要因素。CpG島局部甲基化水平的異常升高，可以導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和抑癌基因的不表達(dá)。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的機(jī)率就會(huì)提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在腫瘤的早期檢測(cè)中的應(yīng)用，因?yàn)檠芯勘砻鞅碛^遺傳的變化伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，檢測(cè)DNA甲基化的改變可以有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉有關(guān)。由于CpG島的局部高度甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此DNA甲基化的檢測(cè)可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測(cè)。CpG島甲基化的檢測(cè)方法眾多，其原理分別基于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化法和基于亞硫酸鈉修飾DNA的PCR檢測(cè)法。甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶/Southern法 (methyIation-sensitive restriction Endonuclease/Southern, MSRE- Southern)是比較傳統(tǒng)的方法，靈敏度低，樣品需要量大。甲基化DNA特異性PCR法(Methylation Specific PCR, MSP)及其衍生的甲基化DNA檢測(cè)方法，是目前檢測(cè)DNA甲基化的常用方法，具有高靈敏度的同時(shí)，假陽(yáng)性率也很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種甲基化DNA的檢測(cè)方法，能夠有效的分離出甲基化DNA和非甲基化DNA，并且解決了現(xiàn)有技術(shù)局限性大、方法復(fù)雜、需要樣本量大、容易被干擾、不適用混合樣本等缺點(diǎn)，可以在分析DNA甲基化時(shí)可以使用全自動(dòng)DNA序列分析儀，在維持其可靠性的同時(shí)，提高了檢測(cè)的靈敏度。并且由于這一技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因序列，使得檢測(cè)的速度得到提高。本發(fā)明甲基化DNA的檢測(cè)方法，步驟如下
步驟1，用亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA，和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA ； 步驟2，在要檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)，選擇含多個(gè)CpG位點(diǎn)的一段序列，以所選序列5’端的一部分的作為正向引物，以所選序列3’端的一段序列的互補(bǔ)序列作為反向引物；在正向引物的5’末端加上一段20個(gè)堿基長(zhǎng)度的T7啟動(dòng)子序列作為T(mén)7尾引物，在反向引物的5’末端加上一段20個(gè)堿基長(zhǎng)度的T3啟動(dòng)子序列作為T(mén)3尾引物；合成T3尾引物和T7尾引物， 并對(duì)T7尾引物進(jìn)行熒光標(biāo)記；
步驟3，亞硫酸鹽處理過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和非甲基化DNA作為PCR模板，加入DNA聚合酶、熒光染料，用所述正向和反向PCR引物在實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀中分別進(jìn)行擴(kuò)增，并測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)甲基化和非甲基化DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度；
步驟4，用所述PCR引物，在與步驟3相同的條件下對(duì)亞硫酸鹽處理過(guò)的待測(cè)DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；
步驟5，將步驟4所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行加熱，使其溫度高于非標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA相應(yīng)的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度，而低于標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度；
步驟6，立即將步驟5中加熱的PCR產(chǎn)物進(jìn)行冷卻，加入單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行消化，得到消化產(chǎn)物；
步驟7，以步驟6所得的經(jīng)消化后的PCR產(chǎn)物為模板，加入T3尾引物和熒光標(biāo)記的T7 尾引物、DNA聚合酶進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增；用核酸分析儀測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段在毛細(xì)管電泳的遷移率；
步驟8，將步驟7所測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照，如果待測(cè)樣品中出現(xiàn)與甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品一致的遷移率信號(hào)，則存在甲基化DNA;反之，則不存在。所述步驟1中，亞硫酸鹽優(yōu)選為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA的處理步驟為，以0. 3M的NaOH變性待測(cè)DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌組成的pH值為5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時(shí)；脫硫并純化DNA。所述步驟2中，使所設(shè)計(jì)的PCR引物為1纊32堿基長(zhǎng)度，所述引物序列中CpG位點(diǎn)數(shù)量為(Γ3個(gè)，且所設(shè)計(jì)的引物的3’端的最后一個(gè)堿基不處于CpG的C的位置；并使PCR 擴(kuò)增后的DNA片段大小為8(Γ180堿基長(zhǎng)度，使PCR擴(kuò)增的序列中含有8 20個(gè)CpG位點(diǎn)。進(jìn)一步地，在引物序列所涉及的CpG位點(diǎn)的C位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G。其中，CpG指胞嘧啶(C)、鳥(niǎo)嘌呤(G)和連接二者的磷酸酯鍵(P)組成位點(diǎn)；T指胸腺嘧啶，A指腺嘌呤。 所述步驟6中，優(yōu)選為使用冰水浴降溫冷卻，所述單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶可以是為Τ7核酸內(nèi)切酶I、Sl核酸酶或綠豆核酸酶中的一種或幾種的混合。所述步驟7中，核酸分析儀為CEQ8000 DNA測(cè)序儀。上述檢測(cè)方法，其中，所用DNA聚合酶優(yōu)選為T(mén)aq DNA聚合酶；所述Τ7尾引物熒光標(biāo)記標(biāo)記優(yōu)選為D4。其中，所述待測(cè)DNA為從各種樣品中制備的人類基因組DNA，所述標(biāo)準(zhǔn)非甲基化 DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA為已確定的純的非甲基化人類基因組DNA和已確定的純的甲基化人類基因組DNA。其中，所述待測(cè)DNA樣品為人類正常DNA，癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、 血細(xì)胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。如
所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、 淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；
所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；
所述體液為血液、腦脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液或陰道分泌液。以亞硫酸鹽處理過(guò)的待測(cè)DNA中由于非甲基化的胞嘧啶(C)被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U) 而甲基化時(shí)GC位點(diǎn)的胞嘧啶(C)因甲基化而維持不變。由于Taq DNA聚合酶將U識(shí)別為 T，使得非甲基化DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的GC含量降低，相應(yīng)的解鏈溫度降低。利用這一特征， 在將PCR加熱到一個(gè)特定的溫度，使非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物先變性解鏈而被消化，使甲基化DNA相應(yīng)的PCR產(chǎn)物得以富集，從而使這一技術(shù)可以檢測(cè)到樣品中存在的甲基化DNA，甚至是低豐度的甲基化DNA。綜上所述，本發(fā)明提供的一種甲基化DNA檢測(cè)方法具有適用范圍大、方法簡(jiǎn)單、需要樣本量小、不易被干擾、適用混合樣本等優(yōu)點(diǎn)。在腫瘤早期檢測(cè)、個(gè)性化治療、病情判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。


圖1為本發(fā)明甲基化DNA檢測(cè)方法流程圖。
具體實(shí)施例方式參照?qǐng)D1，對(duì)本發(fā)明甲基化DNA檢測(cè)方法具體介紹如下 實(shí)施方式(一)
步驟1，用亞硫酸鹽處理和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA。其中，所述亞硫酸鹽具體為亞硫酸鈉；亞硫酸鹽處理的待測(cè)DNA可以具體為人類基因組基因。所述亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA的處理步驟為，以0. 3M NaOH變性待測(cè)DNA，加入含有5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌組成的pH值為5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時(shí)；脫硫并純化DNA。待測(cè)DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)通過(guò)上述處理過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)，甲基化的胞嘧啶(C)維持不變。其中所述標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA指的是已知的純非甲基化DNA與甲基化DNA。步驟2，設(shè)計(jì)并合成PCR引物。在要檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)，選擇一段富含CpG位點(diǎn)的序列，以該序列5’端的部分作為正向引物，以該序列3’端的一段序列的互補(bǔ)序列作為反向引物；在正向引物的5’末端加上一段T7啟動(dòng)子序列作為T(mén)7尾引物序列，在反向引物的5’末端加上一段T3啟動(dòng)子序列作為T(mén)3尾引物序列。優(yōu)選地，在所要檢測(cè)的基因序列中，選擇富含CpG位點(diǎn)的一段序列作為目標(biāo)檢測(cè)序列，并以該段序列的5’端的一段序列作為正向PCR引物，以該段序列3’端的一段序列的互補(bǔ)序列作為反向PCR引物；并使所設(shè)計(jì)的PCR引物為18 32堿基長(zhǎng)度，引物序列中CpG位點(diǎn)數(shù)量為(Γ3個(gè)，且所設(shè)計(jì)的引物的3’端的最后一個(gè)堿基不處于CpG的C的位置；使PCR 擴(kuò)增后的DNA片段大小為8(Γ180堿基長(zhǎng)度，并使PCR擴(kuò)增的序列中含有8 20個(gè)CpG位點(diǎn)。并且，在引物序列所涉及的CpG位點(diǎn)的C位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G。在正向引物的5’末端加上一段20個(gè)堿基長(zhǎng)度的Τ7啟動(dòng)子序列作為Τ7尾引物，在反向引物的5’末端加上一段20個(gè)堿基長(zhǎng)度的T3啟動(dòng)子序列作為T(mén)3尾引物；合成T7和 T3尾引物，并使T7尾引物中帶有熒光標(biāo)記；其中，T7引物熒光標(biāo)記可以是D4。步驟3，亞硫酸鹽處理過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和非甲基化DNA作為PCR模板，加入DNA 聚合酶和熒光染料，用步驟2所述正向和反向PCR引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)甲基化和非甲基化DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度。其中，所述DNA模板包括甲基化和非甲基化DNA，用量為2. 5 10納克均可，在實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。其中所述的PCR操作過(guò)程，由正向和反向PCR引物、PCR擴(kuò)增緩沖液(Buffer)、 Taq DNA聚合酶、四種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNIPs)、所述亞硫酸鈉處理過(guò)的DNA模板 (Template)與純水組成的PCR體系，以熒光染料STOR Green I為指示劑，采用實(shí)時(shí)定量 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行解鏈溫度測(cè)定，分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA樣品的PCR產(chǎn)物的解鏈溫度。步驟4，將一定量的亞硫酸鈉處理過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA，與梯度稀釋的亞硫酸鈉處理過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA混合，作為待測(cè)樣品；在與步驟3相同條件的下對(duì)所述待測(cè)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，相同條件是指與步驟3相同濃度的PCR引物，PCR擴(kuò)增緩沖液(Buffer)、Taq DNA聚合酶和四種三磷酸脫氧核糖核苷酸，相同的PCR條件和PCR擴(kuò)增儀和相同的熒光染料，但不進(jìn)行解鏈溫度測(cè)定。步驟5，將步驟4中所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行加熱至一個(gè)特定溫度，使這一溫度高于非甲基化DNA相應(yīng)的PCR產(chǎn)物解鏈溫度，而低于甲基化DNA相應(yīng)的PCR產(chǎn)物的解鏈溫度。其中，特定溫度是指根據(jù)步驟2測(cè)定的甲基化DNA和非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，這一溫度高于非甲基化DNA相應(yīng)的PCR產(chǎn)物解鏈溫度，而低于甲基化DNA相應(yīng)的 PCR產(chǎn)物的解鏈溫度。加熱溫度在甲基化DNA和非甲基化DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度之間， 在此溫度下，可以使非甲基化DNA相應(yīng)的PCR產(chǎn)物解鏈成為單鏈而甲基化DNA相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物則維持雙鏈狀態(tài)。步驟6 立即冷卻降溫，冷卻方式優(yōu)選為冰水浴降溫。加入對(duì)單鏈DNA特異的核酸內(nèi)切酶并在適當(dāng)條件下進(jìn)行消化處理。所述對(duì)單鏈DNA特異的核酸內(nèi)切酶可以是T7核酸內(nèi)切酶I、Sl核酸酶或綠豆核酸酶，或者是上述幾種的混合。步驟7，以步驟6所得的消化產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，在與步驟4相同的條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行解鏈曲線測(cè)定和判斷檢測(cè)結(jié)果。其中，相同條件是指與步驟4相同濃度的PCR引物，PCR擴(kuò)增緩沖液(Buffer )、Taq DNA聚合酶和四種三磷酸脫氧核糖核苷酸，相同的PCR條件和PCR擴(kuò)增儀和相同的熒光染料。步驟8 判斷是否存在甲基化DNA。判斷方法為如果在待測(cè)DNA樣品中檢測(cè)到與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA相應(yīng)的PCR產(chǎn)物一致的電泳遷移率的信號(hào)，則表明待測(cè)樣品中存在甲基化DNA;反之，則不存在。本發(fā)明一種甲基化DNA檢測(cè)方法，通過(guò)上述步驟檢驗(yàn)本發(fā)明的準(zhǔn)確度和靈敏度。實(shí)施方式(二)在實(shí)施方式(一)的基礎(chǔ)上，以實(shí)際臨床樣品提取的DNA為待測(cè)樣品，在與上述實(shí)施方式 (一)相同的條件下，檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)用性。其中，與上述在實(shí)施方式(一)相同的條件，指的是除以實(shí)際臨床樣品提取的DNA為待測(cè)樣品外，所有操作與上述在實(shí)施方式(一)相同。所述臨床提取的待測(cè)DNA樣品，為人類正常和癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、各種體液DNA或各種排泄物DNA的樣品。所述癌細(xì)胞可以是肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織可以是肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述各種體液可以是血液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。實(shí)施方式(三)
在實(shí)施方式(一)和(二)的基礎(chǔ)上，以P16基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的序列為例，具體PCR引物設(shè)計(jì)如下
P16基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的甲基化是肺癌等多種癌癥細(xì)胞具有的特征。P16基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的序列如下
Homo sapiens pl6 protein(CDKN2A)gene,CpG island and partial cds,DQ325544.1 CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCG GGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG 甲基化DNA序列，下劃線部分為要檢測(cè)的區(qū)域； CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCG GGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG 非甲基化DNA序列，下劃線部分為要檢測(cè)的區(qū)域； TGGATTGTGTGTGTTTGGTGGTTGTGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTG GGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTTTTTGGTTGATTGGTTGGTTATGGTTGTGGTTTGGGTTTGGGTAGAGGAGGTGT GGGTGTTGTTGGAGGTGGGGGTGTTGTTTAATGTATTGAATAGTTATGGTTGGAGGTTG 所設(shè)計(jì)的PCR引物
正向引物 5’ - GTTGYGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAG-3’ 反向引物 5，- TTAAACAACRCCCCCRCCTCCAACAA-3， 在正向和反向引物的5’端分別加上T7和T3引物作為尾引物。T7 尾引物5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3， T3 尾引物5’ -ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’
然后，按照實(shí)施方式(一)和(二)所述的方法，進(jìn)行檢測(cè)。上述內(nèi)容為本發(fā)明的具體實(shí)施例的例舉，對(duì)于其中未詳盡描述的試劑、設(shè)備、操作方法等，應(yīng)當(dāng)理解為采取本領(lǐng)域已有的普通及常規(guī)試劑、設(shè)備、操作方法等來(lái)予以實(shí)施。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于核酸內(nèi)切酶消化的甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，步驟如下 步驟1，用亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA，和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA ；步驟2，在要檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)，選擇一段含多個(gè)CpG位點(diǎn)的序列，以所選序列5’端的一部分的作為正向引物，以所選連續(xù)序列3’端的一段序列的互補(bǔ)序列作為反向引物；在正向引物的5’末端加上一段20個(gè)堿基長(zhǎng)度的T7啟動(dòng)子序列作為T(mén)7尾引物序列，在反向引物的5’末端加上一段20個(gè)堿基長(zhǎng)度的T3啟動(dòng)子序列作為T(mén)3尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并對(duì)T7尾引物進(jìn)行熒光標(biāo)記；步驟3，亞硫酸鹽處理過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和非甲基化DNA作為PCR模板，加入DNA聚合酶、熒光染料，用所述正向和反向PCR引物，在實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀中分別進(jìn)行擴(kuò)增，并測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)甲基化和非甲基化DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度；步驟4，用所述PCR引物，在與步驟3相同的條件下對(duì)亞硫酸鹽處理過(guò)的待測(cè)DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；步驟5，將步驟4所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行加熱，使其溫度高于非標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA相應(yīng)的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度，而低于標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度；步驟6，立即將步驟5中加熱的PCR產(chǎn)物進(jìn)行冷卻，加入單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行消化，得到消化產(chǎn)物；步驟7，以步驟6所得的經(jīng)消化后的PCR產(chǎn)物為模板，加入T3尾引物和帶有熒光標(biāo)記的T7尾引物、DNA聚合酶進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增；用核酸分析儀測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段在毛細(xì)管電泳的遷移率；步驟8，將步驟7所測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照，如果待測(cè)樣品中出現(xiàn)與甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品一致的遷移率信號(hào)，則存在甲基化DNA;反之，則不存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，使所設(shè)計(jì)的PCR引物為1壙32堿基長(zhǎng)度，引物序列中CpG位點(diǎn)數(shù)量為(Γ3個(gè)，且所設(shè)計(jì)的引物的3’端的最后一個(gè)堿基不處于CpG 的C的位置；并使PCR擴(kuò)增后的DNA片段大小為8(Γ180堿基長(zhǎng)度，使PCR擴(kuò)增的序列中含有多個(gè)CpG位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在所述引物序列中所涉及的CpG位點(diǎn)的C位置，正向引物用C/T混合代替C，反向引物用G/A混合代替G。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟1中所述亞硫酸鹽具體為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA的處理步驟為以0. 3Μ的NaOH變性待測(cè)DNA，加入由5Μ亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌組成的pH值為5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時(shí)；脫硫并純化DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述單鏈DNA特異性核酸內(nèi)切酶為 T7核酸內(nèi)切酶I、Sl核酸酶或綠豆核酸酶中的一種或幾種的混合；所用DNA聚合酶為T(mén)aq DNA聚合酶；所述核酸分析儀為CEQ8000 DNA測(cè)序儀，所述T7尾引物熒光標(biāo)記標(biāo)記為D4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟6中，用冰水浴進(jìn)行冷卻。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)DNA為人類基因組DNA，所述標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA為于待測(cè)DNA相匹配的、已確定的純的非甲基化人類基因組DNA和已確定的純的甲基化人類基因組DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)DNA樣品為人類正常DNA， 癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
9.根據(jù)全力要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、 淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液為血液、腦脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液或陰道分泌液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甲基化DNA檢測(cè)方法，步驟包括步驟1，亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA和標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和非甲基化DNA；步驟2，合成帶有尾引物序列的PCR引物；步驟3，擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和非甲基化DNA樣品，并測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度；步驟4，擴(kuò)增待測(cè)DNA樣品；步驟5，對(duì)待測(cè)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行加熱至一特定溫度；步驟6，進(jìn)行消化；步驟7，以帶有熒光標(biāo)記的尾引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增；步驟8，測(cè)定電泳遷移率，判定樣品中是否含有甲基化DNA。本發(fā)明甲基化DNA檢測(cè)方法，具有適用范圍大、方法簡(jiǎn)單、需要樣本量小、不易被干擾、適用混合樣本等優(yōu)點(diǎn)，在多種腫瘤疾病的早期檢測(cè)、個(gè)性化治療、病情判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/44GK102399861SQ201010283090
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者王建 申請(qǐng)人:上海迦美生物科技有限公司