脂肪酶變體的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明申請是基于申請日為2007年1月22日，申請?zhí)枮?00780002901.2(國際 申請?zhí)枮镻CT/US2007/060841)，名稱為"脂肪酶變體"的發(fā)明專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及脂肪酶變體。
【背景技術(shù)】
[0003] 脂肪酶是有用的，例如，作為洗涂劑酶用于從衣物和其它紡織品去除脂質(zhì)或 脂肪沾污，作為用于面包和其它烘賠產(chǎn)品的生面團(tuán)的添加劑。因此，源自細(xì)毛嗜熱霉 (ThermomycesIanuginosus)(同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉（Humicolalanuginosa)，EP258 068和EP305 216)的脂肪酶W商品名Lipoiase般（NovoNordiskA/S的產(chǎn)品）W洗涂劑 用途出售。WO0060063描述了細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶的變體，其在洗涂劑溶液中具有特別優(yōu)良 的初次洗涂性能（first-washperformance)。WO9704079、WO9707202 和WO0032758 也 公開了細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶的變體。
[0004] 在一些應(yīng)用中，感興趣的是將產(chǎn)生氣味的短鏈脂肪酸的形成降至最低。因此， 已知的是含有脂肪酶的洗衣洗涂劑有時(shí)可能在W牛奶污染的織物上留下殘留的氣味巧P 430315)。WO02062973公開了脂肪酶變體，其中通過附接（attaching)C末端延伸減少了氣 味的產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在脂肪酶的某些區(qū)/位置引入突變，可改進(jìn)脂肪酶的性質(zhì)或特 征。
[0006] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及用于洗涂劑具有改進(jìn)性能的脂肪酶。例如，本發(fā)明 通過在親本脂肪酶中鑒定的一個(gè)或多個(gè)區(qū)中引入突變而獲得的產(chǎn)生氣味的傾向降低的變 體。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供脂肪酶變體，與親本脂肪酶相比，其產(chǎn)生氣味的 可能降低而無C末端延伸的附接。
[0007] 在另外的方面中，本發(fā)明設(shè)及編碼本發(fā)明脂肪酶變體的DNA序列，攜帶所述DNA序 列的表達(dá)載體和包含DNA序列或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
[0008] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明脂肪酶變體的方法。
[0009] 具體地，本發(fā)明設(shè)及如下各項(xiàng)：
[0010] 1.親本脂肪酶的變體，其中變體包含至少=個(gè)選自下組的取代（使用SEQID N0:2編號(hào)）：
[0011] a)I區(qū)中的至少兩個(gè)取代，和
[0012] b)II區(qū)中的至少一個(gè)取代，和
[0013] C)III區(qū)中的至少一個(gè)取代，和
[0014]d)IV區(qū)中的至少一個(gè)取代；
[0015] 和其中所述變體具有脂肪酶活性。
[0016]2.項(xiàng)1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的I區(qū)中至少兩個(gè)取代包含在對(duì)應(yīng)于位置 231和233的位置的氨基酸的取代（使用SEQIDNO:2編號(hào)）。
[0017] 3.項(xiàng)2的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的I區(qū)中至少兩個(gè)取代包含在對(duì)應(yīng)于位置 231和233的位置的用氨基酸R的取代（使用SEQIDNO:2編號(hào)）。
[001引 4.根據(jù)項(xiàng)1的脂肪酶變體，其變體脂肪酶與SEQIDNO:2至少80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%相同。
[0019] 5.根據(jù)項(xiàng)1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶是具有SEQIDN0:2的氨基酸序列的 脂肪酶。
[0020] 6.根據(jù)項(xiàng)2的脂肪酶變體，其中所述脂肪酶在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO: 2的位置4和/ 或位置227的位置包含其它取代。
[002。 7.根據(jù)項(xiàng)6的脂肪酶變體，其中脂肪酶具有對(duì)應(yīng)于X4V和X227G的取代（使用SEQ IDNO:2 編號(hào)）。
[0022] 8.根據(jù)項(xiàng)1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的II區(qū)中至少一個(gè)取代包含如下取 代，其選自由在對(duì)應(yīng)于位置202、210、211、255和256的位置的取代組成的組（使用5601〇 N0:2編號(hào)）。
[0023] 9.根據(jù)項(xiàng)8的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶中至少一個(gè)取代選自下組：X202G、 X210K、X211L、X255Y/V和X256K(使用沈QIDN0:2 編號(hào)）。
[0024] 10.根據(jù)項(xiàng)1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的III區(qū)中至少一個(gè)取代包含如下取 代，其選自由在對(duì)應(yīng)于位置83、86和90的位置的取代組成的組（使用SEQIDN0:2編號(hào)）。 [00巧]11.根據(jù)項(xiàng)10的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶中至少一個(gè)取代選自下組：X83T、 X86V和X90A/R(使用沈QIDN0:2 編號(hào)）。
[0026]12.根據(jù)項(xiàng)1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的IV區(qū)中至少一個(gè)取代包含如下取 代，其選自由在對(duì)應(yīng)于位置27、58和60的位置的取代組成的組（使用SEQIDN0:2編號(hào)）。
[0027] 13.根據(jù)項(xiàng)1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的IV區(qū)中至少一個(gè)取代包含選自下 組的取代：X27R、X58N/A/G/P/T和X60S/V/G/N/R/K/A/L(使用SEQIDN0:2 編號(hào)）。
[0028] 14.根據(jù)項(xiàng)1的脂肪酶變體，其中脂肪酶變體還包含親本脂肪酶中的至少一個(gè)取 代，其選自由在對(duì)應(yīng)于如下位置的位置的取代組成的組：位置81、147、150、227和249 (使用 沈QIDNO:2編號(hào)）。
[0029] 15.根據(jù)項(xiàng)1的脂肪酶變體，其中所述脂肪酶變體還包含選自下組的至少一個(gè)取 代：X81Q/E、X147M/Y、X150G和X249R/I/U使用沈QID側(cè):2編號(hào)）。
[0030] 16.項(xiàng)1的脂肪酶變體，其中所述脂肪酶包含選自下組取代的取代：
[0038]h)S58N+V60S+L147M+F211L巧231R+N233R
[0039]i)Q4V+S58A+V60S+S83T+I86V+A150G巧210K+L227G巧231R+N233R+P25服
[0040]j)S58N+V60S+I86V+A150G+L227G巧231R+N233R+P25服
[0041] 17.編碼項(xiàng)1-16的脂肪酶變體的DNA序列。
[004引18.攜帶項(xiàng)17的DNA序列的表達(dá)載體。
[004引19.包含項(xiàng)17的DNA序列的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
[0044] 20.產(chǎn)生脂肪酶變體的方法，所述方法包含在利于產(chǎn)生脂肪酶變體的條件下培養(yǎng) 項(xiàng)19的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，和從得到的培養(yǎng)液中回收脂肪酶變體。
[0045] 21.沈QIDN0:2 的變體，其包含Q4V、S58N/A/G/P/T、I90R或Q249I/L中的至少一 個(gè)突變。
[0046] 附圖簡述
[0047] 圖1顯示脂肪酶的比對(duì)。
[004引序列表
[0049]SEQIDNO: 1顯示編碼來自細(xì)毛嗜熱霉的脂肪酶的DNA序列。
[0050]SEQIDN0:2顯示來自細(xì)毛嗜熱霉的脂肪酶的氨基酸序列。
[0051]SEQIDNO:3顯示來自曲柄準(zhǔn)頭霉（AbsidiarefIexa)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0052]SEQIDNO:4顯示來自傘狀準(zhǔn)頭霉（Absidiacorymbifera)的脂肪酶的氨基酸序 列。
[005引SEQIDNO:5顯示來自曼赫根毛霉（RhizmucormieheU的脂肪酶的氨基酸序列。
[0054]SEQIDN0:6顯示來自米根霉她izopuscxryzae)的脂肪酶的氨基酸序列。
[005引SEQIDNO:7顯示來自黑曲霉（Aspergillusniger)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0056] 沈QIDN0:8顯示來自塔賓曲霉（Aspergillustubigensis)的脂肪酶的氨基酸序 列。
[0057]SEQIDN0:9顯示來自尖鑲抱（化sariumO巧sporum)的脂肪酶的氨基酸序列。
[005引SEQIDNO: 10顯示來自異抱鑲抱（Fusariumheterosporum)的脂肪酶的氨基酸序 列。
[0059]SEQIDNO: 11顯示來自米曲霉（Aspergilluscxryzea)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0060]SEQIDNO: 12顯示來自沙口柏干酪青霉（Peniciliumcamembertii)的脂肪酶的 氨基酸序列。
[0061] 沈QIDNO: 13顯示來自臭曲霉（Aspergillusfoeti化S)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0062]SEQIDNO: 14顯示來自黑曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
[0063]SEQIDNO: 15顯示來自米曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
[0064] 沈QIDNO: 16顯不來自Landerinapenisapora的脂肪酶的氨基酸序列 [00財(cái)發(fā)明詳述
[0066] 親本脂肪酶
[0067] 可W使用任何合適的親本脂肪酶。在優(yōu)選實(shí)施方案中，親本脂肪酶可W是真菌脂 肪酶。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，親本脂肪酶可W與SEQIDN0:2中所示的細(xì)毛嗜熱霉的序 列具有至少 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100% 的同源性，所述同源性如"同源性和比對(duì)"部分所定義。
[0068] 親本脂肪酶可W是酵母多版，例如念珠菌屬（Camiida)、克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)、畢赤酵母屬巧ichia)、酵母屬（Saccharomyces)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)或西萍著霉屬（Yarrowia)多版；或更優(yōu)選是絲狀真菌多版， 例如枝頂抱霉屬（Acremonium)、曲霉屬（Aspergillus)、短梗霉屬（Aureobasidium)、 隱球菌屬（Cryptococcus)、Filobasidium、鑲抱屬（F'usarium)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、 梨抱菌屬（Magnaporthe)、毛霉屬（Mucor)、毀絲霉屬（Myceliophthora)、新考瑪脂 霉屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、擬青霉屬巧aeciIomyces)、青霉 屬巧enicillium)、瘤胃壺菌屬（Piromyces)、裂權(quán)菌屬（Schizophyllum)、躁節(jié)菌 屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭抱殼屬（Thielavia)、彎頸霉屬 (Tolypocladium)或木霉屬（Trichoderma)多版D
[0069]在優(yōu)選的方面，親本脂肪酶是卡爾酵母（Saccharomycescarlsbergensis)、釀 酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母（Saccharomycesdiastaticus)、道格控 氏酵母（Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母（Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母 (Saccharomycesnorb