專利名稱：一種用生物傳感器檢測脂酶非均相催化反應(yīng)過程的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應(yīng)過程的方法。
背景技術(shù)：
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物傳感器已經(jīng)成為生物質(zhì)技術(shù)必不可少的一種先進(jìn)的檢測方法與監(jiān)控方法，也是物質(zhì)分子水平的快速、微量分析方法，具有較高的選擇性和靈敏度生物傳感器是一種特殊的器件或裝置，應(yīng)用的是生物機(jī)理，與傳統(tǒng)的化學(xué)傳感器和離線分析技術(shù)落后相比，具有高選擇性、高靈敏度、較好的穩(wěn)定性、能在復(fù)雜體系中進(jìn)行快速在線監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)。基本工作原理是將生物敏感元件發(fā)生的特異性反應(yīng)及信號經(jīng)由物理元件——換能器，轉(zhuǎn)變?yōu)楣狻㈦?、聲等易檢測信號，從而可將反映程度用離散或連續(xù)的數(shù)字信號表達(dá)出來，間接地獲知待測物的有關(guān)信息。目前生物傳感器主要應(yīng)用于食物、農(nóng)業(yè)、 生物技術(shù)、藥物和軍事領(lǐng)域。但目前還沒有利用生物傳感器檢測脂肪酶催化反應(yīng)過程的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用生物傳感器檢測脂酶非均相催化反應(yīng)過程的方法，以解決目前還沒有利用生物傳感器檢測脂肪酶催化反應(yīng)過程的方法的問題，將固定化脂肪酶催化底物所產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移過程轉(zhuǎn)換成電流或電阻并輸出，從而判斷脂肪酶催化反應(yīng)的終點(diǎn)。使用本發(fā)明方法的裝置包括恒溫水浴鍋1、敞口玻璃容器2、圓柱形石墨體3、鉬片 4、玻璃板、離子交換膜5、陰極室7以及陰極室內(nèi)緩沖溶液、陽極室6以及陽極室內(nèi)緩沖液、 電流表8、電阻9、單片機(jī)10、仿真機(jī)11、PC機(jī)12、電路板13、5V電源14和鉬絲15 ；敞口玻璃容器2置于恒溫水浴鍋1中，圓柱形石墨體3和鉬片4分別置于陰極室7和陰極室6中，陰極室7和陽極室6之間由玻璃板隔斷，且陰極室6與陰極室7之間由安裝在玻璃板上的離子交換膜5相連通，圓柱形石墨體3與鉬片4之間由鉬絲15相連接，電流表8和電阻9串聯(lián)在鉬絲15上，電阻9的中間抽頭連接在單片機(jī)10的信號輸入端上，仿真機(jī)11的一個(gè)通信端口連接單片機(jī)10，仿真機(jī)11的另一個(gè)通信端口連接PC機(jī)12，5V電源14給單片機(jī)10 提供電源；本發(fā)明的步驟如下步驟一水浴溫度65°C，采用恒溫水浴控制；步驟二 制取陽極液PBS 稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別為1. 36g和1. 42g， 用200ml去離子水配制成濃度為0. lmol/L的緩沖溶液(PBS)；步驟三制取陰極液用去離子水將鐵氰化鉀配成過飽和溶液，陰極液為鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液；步驟四測試將緩沖溶液的PH分別調(diào)到6、7、8，再將Novozym 435固定化脂肪酶 0. 09g與甘油三酯快速混勻，置于陰極室內(nèi)；步驟五記錄電流強(qiáng)度采用靈敏電流表分別對三種不同PH環(huán)境下的電流強(qiáng)度進(jìn)行測試進(jìn)行測試，每隔半分鐘記錄一次數(shù)值；步驟六實(shí)驗(yàn)過程五中取不同反應(yīng)時(shí)間的混合液進(jìn)行離心分離，得到的上層液用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，從而驗(yàn)證電流值與脂肪酸和酯之間含量的對應(yīng)關(guān)系。本發(fā)明是以固定化脂肪酶作為生物元件，以甘油三酯為反應(yīng)底物，設(shè)計(jì)、研制了能將脂肪酶催化底物所產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)換為電流或電阻輸出的電化學(xué)生物傳感器，并研究了 PH變化對其輸出數(shù)據(jù)的影響。固定化脂肪酶生物傳感器能夠?qū)⒅久傅膶Ｒ恍?、靈敏性和電學(xué)的簡便、迅速巧秒地結(jié)合起來，可以在一個(gè)復(fù)雜的體系中，不受其他物質(zhì)干擾，快速準(zhǔn)確的測出某些物質(zhì)的含量，并可測定酶與底物反應(yīng)的程度。


圖1是本發(fā)明應(yīng)用的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一結(jié)合圖1說明，本實(shí)施方式如下使用本發(fā)明方法的裝置包括恒溫水浴鍋1、敞口玻璃容器2、圓柱形石墨體3、鉬片 4、玻璃板、離子交換膜5、陰極室7以及陰極室內(nèi)緩沖溶液、陽極室6以及陽極室內(nèi)緩沖液、 電流表8、電阻9、單片機(jī)10、仿真機(jī)11、PC機(jī)12、電路板13、5V電源14和鉬絲15 ；敞口玻璃容器2置于恒溫水浴鍋1中，圓柱形石墨體3和鉬片4分別置于陰極室7和陰極室6中，陰極室7和陽極室6之間由玻璃板隔斷，且陰極室6與陰極室7之間由安裝在玻璃板上的離子交換膜5相連通，圓柱形石墨體3與鉬片4之間由鉬絲15相連接，電流表8和電阻9串聯(lián)在鉬絲15上，電阻9的中間抽頭連接在單片機(jī)10的信號輸入端上，仿真機(jī)11的一個(gè)通信端口連接單片機(jī)10，仿真機(jī)11的另一個(gè)通信端口連接PC機(jī)12，5V電源14給單片機(jī)10 提供電源；步驟一恒溫水浴鍋1內(nèi)的水浴溫度為65°C，采用恒溫水浴控制；步驟二 制取陽極液PBS 稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別為1. 36g和1. 42g， 用200ml去離子水配制成濃度為0. lmol/L的緩沖溶液(PBS)；步驟三制取陰極液用去離子水將鐵氰化鉀配成過飽和溶液，陰極液為鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液；步驟四測試將溶液的pH分別調(diào)到6、7、8，再將固定化脂肪酶0.09g與甘油三酯快速混勻，置于陰極室內(nèi)；步驟五記錄電流強(qiáng)度采用靈敏電流表分別對三種不同PH環(huán)境下的電流強(qiáng)度進(jìn)行測試進(jìn)行測試，每隔半分鐘記錄一次數(shù)值；步驟六實(shí)驗(yàn)過程五中取不同反應(yīng)時(shí)間的混合液進(jìn)行離心分離，得到的上層液用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，從而驗(yàn)證電流值與脂肪酸和酯之間含量的對應(yīng)關(guān)系。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟一中恒溫水浴的溫度為50 70°C，其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟二中PBS的濃度為0. 01 lmol/L，其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟四中的PH為5 9，其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟四固定化脂肪酶加入量是甘油三酯的0. 1 0. 3%，其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟五中記錄時(shí)間為 1 60秒。其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。步驟一水浴溫度65°C，采用恒溫水浴控制；步驟二 陽極液PBS:稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別為1.36g和1. 42g，用 200ml去離子水配制成濃度為0. lmol/L的緩沖溶液液(PBS)；步驟三陰極液用去離子水將鐵氰化鉀配成過飽和溶液，陰極液為鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液；步驟四離子交換膜陽極室和陰極室之間安裝離子交換膜；步驟五按照說明書附圖連接反應(yīng)裝置；步驟六測試將溶液的pH分別調(diào)到6、7、8，再將固定化脂肪酶0. 09g與甘油三酯 3ml快速混勻，置于陰極室內(nèi)，分別對三種不同pH環(huán)境下的電流強(qiáng)度進(jìn)行測試；步驟七記錄電流強(qiáng)度采用靈敏電流表對電路中的電流強(qiáng)度進(jìn)行測試，每隔30 秒記錄一次數(shù)值；步驟八實(shí)驗(yàn)過程中將混合液進(jìn)行離心分離，得到的上層液用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，從而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。本實(shí)施方式中采用的主要設(shè)備為恒溫水浴鍋。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟一中恒溫水浴的溫度為50 70°C，其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟二中PBS的濃度為0. 01 lmol/L，其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟四中的pH為5 9，其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟四固定化脂肪酶加入量是甘油三酯的0. 1 0. 3%，其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同點(diǎn)在于步驟五中記錄時(shí)間為 1 60秒。其它組成和步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
權(quán)利要求
1.一種用生物傳感器檢測脂酶非均相催化反應(yīng)過程的方法，其特征在于在陰極室的緩沖液鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液中，固定化脂肪酶催化底物產(chǎn)生離子，離子通過離子交換膜進(jìn)入陽極室，在石墨和鉬片之間形成了循環(huán)電路，因此，電子轉(zhuǎn)移過程轉(zhuǎn)換成電流或電阻輸出。本方法基于下述裝置實(shí)現(xiàn)一種在線監(jiān)控脂酶非均相催化反應(yīng)生物傳感器裝置，其特征在于所述一種監(jiān)測固定化脂肪酶水解過程的生物傳感器裝置，將敞口玻璃容器置于恒溫水浴鍋中，而圓柱形石墨和鉬片又分別置于陰極室和陽極室中，且陰極室與陽極室之間由離子交換膜相連通，石墨與鉬片之間由鉬絲相連接，電阻R和電源與之串聯(lián)。在電阻R上連一單片機(jī)，單片機(jī)又分別于5V電源、電路板和仿真機(jī)連接最后仿真機(jī)連接于PC 機(jī)上。此過程通過以下步驟實(shí)現(xiàn)步驟一水浴溫度65°C，采用恒溫水浴控制；步驟二 陽極液PBS 稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別為1. 36g和1. 42g，用200ml去離子水配制成濃度為0. lmol/L的緩沖溶液液(PBS)；步驟三陰極液用去離子水將鐵氰化鉀配成過飽和溶液，陰極液為鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液；步驟四離子交換膜陽極室和陰極室之間安裝離子交換膜；步驟五按照說明書附圖連接反應(yīng)裝置；步驟六測試將溶液的PH分別調(diào)到6、7、8，再將固定化脂肪酶0. 09g與甘油三酯快速混勻，置于陰極室內(nèi)，分別對三種不同PH環(huán)境下的電流強(qiáng)度進(jìn)行測試；步驟七記錄電流強(qiáng)度采用靈敏電流表對電路中的電流強(qiáng)度進(jìn)行測試，每隔半分鐘記錄一次數(shù)值；步驟八實(shí)驗(yàn)過程中將混合液進(jìn)行離心分離，得到的上層液用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，從而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應(yīng)過程的方法，其特征在于步驟一中恒溫水浴的溫度為50 70°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應(yīng)過程的方法，其特征在于步驟二中PBS的濃度為0. 1 lmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用生物傳感器檢固定化測脂酶非均相催化反應(yīng)過程的方法，其特征在于步驟六中的pH為5 9。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應(yīng)過程的方法，其特征在于步驟六固定化脂肪酶加入量是甘油三酯的0. 01 0. 3%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應(yīng)過程的方法，其特征在于步驟七中記錄時(shí)間為1 60秒。
全文摘要
一種脂酶非均相催化反應(yīng)的生物傳感器的研究方法。本發(fā)明將固定化脂肪酶催化底物所產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移過程轉(zhuǎn)換成電流或電阻并輸出，從而判斷脂肪酶催化反應(yīng)的終點(diǎn)。本發(fā)明的步驟如下首先按照說明書附圖連接裝置，然后將PBS放入陽極室內(nèi)；PBS和鐵氰化鉀過飽和溶液的混合液放入陰極室內(nèi)。將底物和固定化脂肪酶快速混勻，置于陰極室內(nèi)進(jìn)行測試。用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，測出相對誤差僅為4.7％，驗(yàn)證了本發(fā)明可快速準(zhǔn)確地測定酶與底物反應(yīng)過程中發(fā)生的酯鍵斷裂程度。本發(fā)明以固定化脂肪酶作為生物元件，將脂肪酶的專一性、靈敏性和電學(xué)的簡便、迅速巧秒地結(jié)合起來，可準(zhǔn)確輸出電學(xué)信號，推算出反應(yīng)底物的自重，從而決定反應(yīng)終點(diǎn)。
文檔編號G01D5/12GK102212609SQ20111008150
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者于殿宇, 孔慶明, 富校軼, 張佳寧, 張敏, 時(shí)敏, 李振嵐, 李越, 王妍, 王玉, 王立琦, 王雪, 齊穎 申請人:哈爾濱商業(yè)大學(xué)