一種水稻Bel基因的定點(diǎn)敲除系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻苯達(dá)松基因的定點(diǎn)敲除方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在野生型水稻上應(yīng)用的選擇性除草劑主要有兩類，一類是苯并噻二唑類(benzothiadiazole)除草劑，如苯達(dá)松，其有效成分能通過作物的根、葉吸收，它對豆科以外的絕大多數(shù)雙子葉植物和莎草科雜草有殺除作用，對禾本科植物無害。苯達(dá)松的除草機(jī)理是抑制植物光合作用中的希爾反應(yīng)。
[0003]TALENs (轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶)是近幾年出現(xiàn)的基因定點(diǎn)修飾新技術(shù)，在動物、植物和人類等領(lǐng)域都有廣泛的研宄和應(yīng)用。轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcript1n Activator-Like Protein Effector, TALE)是黃單胞菌屬病原菌分泌到宿主植物細(xì)胞中的一種毒性蛋白，可以識別植物DNA，驅(qū)動基因表達(dá)。TALENs就是利用TALE的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Fok I的DNA切割結(jié)構(gòu)域人工合成的核酸酶。兩個TALEN單體按照一定方式結(jié)合在DNA雙鏈上，形成有切割活性的二聚體將DNA切斷，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)，細(xì)胞啟動修復(fù)機(jī)制，通過非同源末端連接這種不精確的修復(fù)方式可以產(chǎn)生基因定點(diǎn)突變，通過同源重組(HR)方式修復(fù)可以實現(xiàn)精確的基因定點(diǎn)插入或基因替換。相比鋅指核酸酶(ZFNs)和Meganucleases技術(shù)，TALENs技術(shù)具有設(shè)計簡單，突變效率高和細(xì)胞毒性低等優(yōu)勢。TALENs的優(yōu)異性取決于TALE獨(dú)特的DNA識別特性。TALEN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含了一個由數(shù)量不等((1.5-33.5)的重復(fù)單元組成的串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域。每一個重復(fù)單元通常由33-35個氨基酸組成，重復(fù)單元的氨基酸高度保守，但是各個單元的第12和13位兩個相鄰氨基酸是可變的，這兩個氨基酸通常被稱為重復(fù)可變雙殘基(R印eat-variablediresidue, RVD)。每個RVD與核苷酸A、T、C、G存在簡單對應(yīng)的關(guān)系，最常見的識別密碼為NI識別結(jié)合A，HD識別結(jié)合C，NG識別結(jié)合T，和NN識別結(jié)合G (Moscou and Bogdanove.，2009)。
[0004]一般培育抗除草劑作物主要通過以下兩種方法:一是通過理化誘變，獲得抗除草劑作物的突變體；二是通過DNA重組技術(shù)，將抗除草劑基因?qū)氍F(xiàn)有的物種中，創(chuàng)造抗除草劑的新材料。由于理化誘變的方法靶向性不強(qiáng)，突變一個基因，需要處理大量實驗材料，為保證得到目的基因的突變體，需要做大量篩選工作，而且容易攜帶自己不需要的突變基因；DNA重組技術(shù)存在外源轉(zhuǎn)基因的情況，在育種時間或生物安全評價方面存在一定的問題。TALEN技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、方便并且可以得到不帶外源基因的突變體，而且突變體種類豐富，采用TALEN技術(shù)來獲得抗除草劑材料將成為一種技術(shù)發(fā)展趨勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種偏好于植物基因組DNA的TALEN定點(diǎn)突變系統(tǒng)，所述TALEN定點(diǎn)突變系統(tǒng)所包含的四個識別模塊的核苷酸序列分別如下:識別結(jié)合堿基A的NI模塊的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；識別結(jié)合堿基C的HD模塊的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；識別結(jié)合堿基T的NG模塊的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示；識別結(jié)合堿基G的NN模塊的核苷酸序列如SEQ ID N0:16所示。
[0006]本發(fā)明還提供了一種新的獲得苯達(dá)松敏感植物的方法，更具體的是提供一種在單子葉植物中，優(yōu)選在水稻中創(chuàng)制對苯達(dá)松敏感植株的方法。本方法以水稻Bel基因的第一個外顯子起始密碼子后邊的核苷酸序列作為靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ IDNO: 10所示，其中SEQ ID NO: 10的第17位至第34位的序列為間隔序列，兩側(cè)為TALENs的模塊識別序列(分別命名為L和R)。在本發(fā)明中，針對該靶序列的L端設(shè)計出來的TALEN-L包含TALE基因和Fokl融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；針對該靶序列的R端設(shè)計出來的TALEN-R包含TALE基因和Fokl融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。將該TALEN-L和TALEN-R的核苷酸序列構(gòu)建到同一個表達(dá)載體，在組成型表達(dá)啟動子的驅(qū)動下，轉(zhuǎn)入到水稻中后，可以有效的獲得Bel基因被突變的苯達(dá)松敏感植株。實現(xiàn)了對水稻Bel基因進(jìn)行準(zhǔn)確、高效地打靶的實際需求。
[0007]本發(fā)明還提供了一種植物表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有SEQ ID N0:6和/或SEQID N0:8所示的核苷酸序列。更具體地，所述構(gòu)建體的TALEN-L由Ubiquitin啟動子啟動表達(dá)，TALEN-R由35s啟動子驅(qū)動表達(dá)。
[0008]目前用TALEN方法得到的突變體材料篩選手段主要有:表型觀察，基因測序驗證等。對于表型不好觀察的材料只能進(jìn)行基因測序，由于后代材料較多，造成工作量巨大，成本增高。具體到苯達(dá)松敏感突變體，表型易觀察，但有表型植株會逐漸死亡而收不到種子，所以不能在TO代進(jìn)行苯達(dá)松敏感性篩選，而測序又存在嵌合體不容易測序，程序繁瑣，成本高等問題。
[0009]為解決上述問題，本發(fā)明還提供了一種篩選此類突變體的方法，具體的是對于轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因植株，通過高分辨率溶解曲線(HRM)的方法篩選到突變體植株。HRM(HighResolut1n Melt)，中文譯為“高分辨率熔解”是近幾年來在國際上興起的最新的SNP及突變研宄工具。這種檢測方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解，即可完成對樣品基因型的分析。本發(fā)明提供了一種特異的用于檢測水稻Bel基因突變情況的HRM引物Ben-F和Ben_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12 所示。
[0010]本發(fā)明依次通過下列步驟實現(xiàn):
[0011](I)單子葉植物密碼子的偏好性和水稻Bel基因序列對TALEN的核苷酸序列進(jìn)行改造，改造后的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示，將該序列交寶生物工程(大連)有限公司合成；
[0012](2)將合成得到的一對TALEN核苷酸片段分別連接于Pubi和P35S啟動子下游驅(qū)動表達(dá)；Pubi和P35S啟動子核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:2所不O
[0013](3)轉(zhuǎn)化植物，具體地，優(yōu)選轉(zhuǎn)化水稻；
[0014](4)以獲得的TO代轉(zhuǎn)基因水稻基因組為模板，進(jìn)行HRM分析。具體地設(shè)計一對PCR引物，使產(chǎn)物包括Bel基因靶序列片段，PCR產(chǎn)物長度為120bp左右，用Lightscanner (USIdaho)掃描獲得溶解曲線，通過比較轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株P(guān)CR產(chǎn)物解鏈溫度差異篩選可能的突變植株，利用此方法可方便快速大量篩選轉(zhuǎn)基因植株；
[0015](5)通過測序驗證篩選到的植株Bel基因突變情況。為驗證篩選得到的突變體植株Bel基因是否突變以及怎樣突變，通過PCR擴(kuò)增帶有靶序列的DNA片段，測序驗證其真實序列。
[0016](6)對篩選到的突變體進(jìn)行苯達(dá)松除草劑敏感性實驗。把篩選得到的Bel基因突變株和野生型植株同時栽到同一花盆中，待植株長到3葉一新，用1200mg/L的苯達(dá)松噴施，一周后調(diào)查植株葉子干枯情況，拍照(圖4)。
[0017]本發(fā)明所述的“啟動子”是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。
[0018]本發(fā)明所述的“核苷酸序列”是核酸(DNA和RNA)中核苷酸的排列順序。許多情況下，核苷酸序列決定核酸的高級結(jié)構(gòu)和生物功能，即不同序列有不同的高級結(jié)構(gòu)和不同的生物功能。
[0019]本發(fā)明所述的“植物表達(dá)載體”是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠在植物細(xì)胞中恒定表達(dá)外源基因的任何一種載體，如pCAMBIA1300，pBI121等。
[0020]本發(fā)明所述的“轉(zhuǎn)化”是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)胫参锛?xì)胞或植物組織的任何一種植物轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍等。
[0021]本發(fā)明所述的“轉(zhuǎn)基因植物”是指通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)獲得的整合有外源基因的植物個體。通常轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)基因植物基因組中穩(wěn)定帶有外源基因的核苷酸序列，可將該外源核苷酸序列穩(wěn)定地遺傳給下一代。
[0022]本發(fā)明與現(xiàn)有的創(chuàng)建苯達(dá)松敏感植物的技術(shù)相比，其優(yōu)勢在于方便、快速，用此技術(shù)可以一位科研人員在一年半的時間內(nèi)可以得到多個不同突變位點(diǎn)的純合突變體植株，大大節(jié)省人力、物力，而且得到的突變體不帶轉(zhuǎn)基因成分，消除人們對轉(zhuǎn)基因的顧慮，對植物基因工程創(chuàng)制新的種質(zhì)資源有重要意義。
【附圖說明】
[0023]圖1水稻Bel基因序列及本專利涉及到的TALEN靶序列位置，Exon I和Exon 2分別為水稻Bel基因的兩個外顯子I和2，靶序列L和靶序列R分別為TALEN蛋白的結(jié)合靶位點(diǎn)。
[0024]圖2用于轉(zhuǎn)化水稻的載體pOsBel示意圖。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；P35S為來自于煙草花葉病毒的組成型啟動子35S啟動子，Hyg為人工合成的潮霉素抗性基因；T35S為自于煙草花葉病毒的35S基因終止子；Pubi表示玉米泛素基因的啟動子，TALEN-L為人工合成的來自細(xì)菌的TALEN-L基因編碼區(qū)，Trbcs為來自于擬南芥Rbcs基因的終止子；TALEN-R為人工合成的來自于細(xì)菌的TALEN-R基因編碼區(qū)，Tnos表示胭脂堿合成酶(nos)基因的終止子。
[0025]圖3是HRM檢測轉(zhuǎn)基因水稻與野生型水稻Bel基因解鏈溫度峰圖比較圖；WT標(biāo)示的是野生型水稻Bel基因的解鏈峰圖，24和Mutants標(biāo)示的是Bel基因發(fā)生突變后的解鏈峰圖。
[0026]圖4獲得的突變體植株與野生型植株對苯達(dá)松類除草劑敏感性分析，左側(cè)為野生型植株，生長基本正常，