液體培養(yǎng)2d的菌液離心取菌體，加入ImL 溶菌酶，37°C處理lh，再加入裂解液，裂解液組成為：50mM Tris，20mM EDTA，NaCl 500mM， 2% SDS (w/v)，ρΗ8· 0, 70°C水浴裂解 lh，每隔 IOmin 混勾一次，在 4°C 下 1000 Orpm離心 5min。 取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后， 4°C下1000 Orpm離心10min。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗絳兩次，真空干燥，加入適量TE 溶解，置于-20 °C備用。
[0040] 用超聲打斷儀Biorupter將5 μ g的Massilia sp. RBM26的基因組打斷為 400_600bp的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration試劑盒對(duì)打斷的DNA片段進(jìn)行純 化，純化后用TureseqTM DNA Sample Preparation Kit進(jìn)行DNA片段的末端補(bǔ)平、3'端加 A堿基和加接頭、及DNA片段的PCR擴(kuò)增（操作按試劑盒說明書進(jìn)行）。用MiSeq基因組測(cè) 序儀（Illumima公司）對(duì)上述制備好的文庫(kù)進(jìn)行基因組測(cè)序。
[0041] 基因組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)讀碼框預(yù)測(cè)和本地BLAST比對(duì)，得到木聚糖酶基因 XynRBM26,該基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0042] 實(shí)施例2:重組木聚糖酶XynRBM26的制備
[0043] 以 5 ' ATGACATCTCGACGCGATAC3 ' 和 5 ' GGCTTTACGCATCGGCATCG3 ' 為引物對(duì)，Mas s i I i a sp. RBM26基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 30S，72°C退火 30S，72°C延伸 lmin30S，共 20 個(gè)循環(huán)；94°C變性 30S，52°C退火 30S，72°C延伸 lmin30S，共10個(gè)循環(huán)；72°C擴(kuò)增后延伸7min ;其中從72°C到52°C每個(gè)循環(huán)溫度下降1°C。 PCR結(jié)果得到木聚糖酶基因 XynRBM26,并在該基因3'端引入突出的A堿基。將木聚糖酶基 因 XynRBM26和表達(dá)載體pEasy-E2通過T-A方式相連接，獲得含有XynRBM26的重組表達(dá)質(zhì) 粒pEasy-E2-XynRBM26,將pEasy-E2-XynRBM26轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿 菌菌株 BL21 (DE3) /XynRBM26。
[0044] 取含有重組質(zhì)粒pEasy-E2-XynRBM26的重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3) /XynRBM26 和只含有pEasy-E2 (+)空質(zhì)粒的BL21 (DE3)菌株，以0. 1 %的接種量接種于LB (含100 μ g Hir1Amp)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩16h。然后將此活化的菌液以1 %接種量接種到新鮮的 LB (含100 μ g Inr1Amp)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2-3h (0D600達(dá)到0. 6-1. 0)后，加入終濃 度0. 7mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于20°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h或26°C振蕩培養(yǎng)約8h。12000rpm 離心5min，收集菌體。用適量的pH7. OMcIlvaine緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲 波破碎菌體，破碎后經(jīng)13,OOOrpm離心10min，吸取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE 結(jié)果（圖1)表明，在大約45kDa的位置，經(jīng)500mM的咪唑洗脫后，產(chǎn)物為單一條帶。同 時(shí)，含有載體pEasy_E2 (+)的大腸桿菌菌體破碎上清液無(wú)木聚糖酶酶活，而含有重組載體 pEasy-E2-XynRBM26的大腸桿菌菌體破碎上清液有木聚糖酶酶活。以上結(jié)果說明重組木聚 糖酶XynRBM26在大腸桿菌中得到了表達(dá)。
[0045] 實(shí)施例3 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的性質(zhì)測(cè)定
[0046] 1、純化的重組木聚糖酶XynRBM26的活性分析
[0047] 活性測(cè)定方法采用3, 5 -二硝基水楊酸（DNS)法：將底物溶于0.1 M緩沖液中，使 其終濃度為0.5% (w/v);反應(yīng)體系含100 μ L適量酶液，900 μ L底物；底物在反應(yīng)溫度下預(yù) 熱5min后，加入酶液后再反應(yīng)lOmin，然后加 I. 5mL DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min，冷卻至室 溫后在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。1個(gè)酶活單位（U)定義為在一定的條件下每分鐘分解底物 產(chǎn)生1 μ mol還原糖（以木糖計(jì)）所需的酶量。
[0048] 2、純化的重組木聚糖酶XynRBM26的pH活性和pH穩(wěn)定性測(cè)定：
[0049] 酶的最適pH測(cè)定：將木聚糖酶XynRBM26在37 °C下和0.1 M pH3. 0-12. 0的緩 沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定：將酶液置于0.1 M pH3. 0-12. 0的緩沖液中， 在37°C下處理lh，然后在pH5. 5及37°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對(duì)照。緩 沖液為：〇· IM McIlvaine (ρΗ3· 0-8.0)，0· IM Tris/HCl(pH8. 0-9.0)和 0· IM glycine/ Na0H(pH9. 0-12. 0)。以山毛櫸木聚糖為底物，反應(yīng)lOmin，測(cè)定純化的XynRBM26的酶學(xué)性 質(zhì)。結(jié)果表明：XynRBM26的最適pH為5. 5,在pH5. 0-9. 0的范圍內(nèi)維持50%以上的酶活性 (圖2);經(jīng)ρΗ5· 0-10. 0的緩沖液處理lh，該酶酶活力剩余82%以上（圖3)。
[0050] 3、純化的重組木聚糖酶XynRBM26的熱活性及熱穩(wěn)定性測(cè)定：
[0051] 酶的最適溫度測(cè)定：在pH5. 5的緩沖液中，于0-70°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn)定 性測(cè)定：將同樣酶量的酶液置于37°C、45°C、50°C和55°C中，處理O-Ih后，在pH5. 5及45°C 進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對(duì)照。以山毛櫸木聚糖為底物，反應(yīng)l〇min，測(cè)定純化 的XynRBM26的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：XynRBM26的最適溫度為45°C，在30-50°C的范圍內(nèi)可 以保持62%以上的酶活，在50°C以后酶活隨溫度升高迅速下降（圖4);該酶在37°C、45°C、 50°C下處理lh，剩余酶活分別為95. 6%、81. 2%和59. 7% ;在55°C條件下耐受20min，酶活 迅速損失約至11% (圖5)。
[0052] 4、純化的重組木聚糖酶XynRBM26的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定：
[0053] 酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)一級(jí)反應(yīng)時(shí)間測(cè)定：在ρΗ5· 5及45°C下，以0· 5% (w/v)的山毛櫸 木聚糖為底物，依次在酶促反應(yīng)的I-IOmin內(nèi)終止反應(yīng)并測(cè)定酶活性，計(jì)算出酶活性與反 應(yīng)時(shí)間的比值，若在一定時(shí)間內(nèi)該比值保持穩(wěn)定，則此時(shí)間為一級(jí)反應(yīng)時(shí)間。用0. 05-2. O% (w/v)的山毛櫸木聚糖為底物，在pH5. 5、45°C和一級(jí)反應(yīng)時(shí)間下，根據(jù)Lineweaver-Burk方 法測(cè)定Km、Vmax和kcat。經(jīng)測(cè)定，在45°C及pH5. 5條件下，XynRBM26對(duì)山毛櫸木聚糖的 Km、Vmax 和 kcat 分別為 9. 5mg mL \65. 8 μ mol min 1Iiig 1 和 47. 3S、
[0054] 5、不同金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)純化的重組木聚糖XynRBM26活力的影響：
[0055] 在酶促反應(yīng)體系中分別加入19種不同的金屬離子及化學(xué)試劑（終濃度為ImM和 IOmM)，研宄其對(duì)酶活性的影響。在45°C及pH5. 5條件下，以山毛櫸木聚糖為底物測(cè)定酶活 性（同樣條件下以未加金屬離子及化學(xué)試劑的酶促反應(yīng)作為對(duì)照）。表1顯示所測(cè)定的19 種不同金屬離子及化學(xué)試劑在兩種濃度下對(duì)重組木聚糖酶XynRBM26的影響，即使在ImM的 濃度下，Ag+、SDS、Hg 2+也完全抑制XynRBM26的酶活性。在IOmM的濃度下，Pb 2+完全抑制 XynRBM26的酶活性，Mn2+、Fe2+對(duì)該酶的抑制較強(qiáng)，Co 2+、Fe3+、Cu2+對(duì)該酶的抑制較弱；而其 余金屬離子及化學(xué)試劑及對(duì)該酶活性無(wú)影響或影響微弱。
[0056] 表1 19種不同金屬離子及化學(xué)試劑在兩種濃度下對(duì)重組木聚糖酶XynRBM26的影 響
[0057]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種木聚糖酶的編碼基因XynRBM26,其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
2. -種包含權(quán)利要求1所述的木聚糖酶基因XynRBM26的重組載體。
3. -種包含權(quán)利要求2所述的木聚糖酶基因XynRBM26的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞 所得的重組菌株。
4. 一種木聚糖酶XynRBM26,其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
5. -種木聚糖酶XynRBM26的制備方法，包括： 1) 用權(quán)利要求2所述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶基因XynRBM26表達(dá)； 3) 回收并純化所表達(dá)的木聚糖酶XynRBM26。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種木聚糖酶XynRBM26及其編碼基因、重組載體和重組菌。本發(fā)明提供了一種木聚糖酶XynRBM26，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明以山毛櫸木聚糖為底物的木聚糖酶XynRBM26最適pH為5.5，最適溫度為45℃，在反應(yīng)體系中加入5M的NaCl仍然具有86％的酶活，酶經(jīng)2M NaCl在37℃下處理1h，活性高達(dá)120％；該酶能有效地水解燕麥木聚糖、山毛櫸木聚糖，而不能水解羧甲基纖維素鈉、昆布多糖和β-葡聚糖、微晶纖維素、p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，可廣泛應(yīng)用于飼料、食品和生物燃料等行業(yè)。
【IPC分類】C12N15-56, C12N1-21, C12N9-42, C12N15-70, C12N9-24
【公開號(hào)】CN104726434
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510139942
【發(fā)明人】許波, 戴利銘, 黃遵錫, 李俊俊, 唐湘華, 周峻沛, 楊云娟, 丁俊美
【申請(qǐng)人】云南師范大學(xué)
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年3月27日