一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]發(fā)菜(Ab1S1c flagelliforme),又稱發(fā)狀念珠藻,屬藍(lán)菌門(mén)念珠藻目，發(fā)菜主要產(chǎn)于中國(guó)西北部的干旱和半干旱地區(qū)，發(fā)菜是一種能固氮的光合原核生物，它的絲狀體中主要有兩種細(xì)胞:一種是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，呈綠色，進(jìn)行光合作用，吸收、釋放、合成有機(jī)物質(zhì)；另一種是異形細(xì)胞，體積較大，細(xì)胞壁較厚，顏色較淡，主要進(jìn)行固氮作用，把空氣中的氮?dú)膺€原成氨，合成氨基酸。
[0003]發(fā)菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，尤其是蛋白質(zhì)的含量較高，每千克發(fā)菜中含蛋白質(zhì)200?234.1克，還含有海膽酮、藍(lán)藻葉黃素、藻藍(lán)素和別藻藍(lán)素等，營(yíng)養(yǎng)成分高于同量的肉類與蛋類；發(fā)菜有較高的藥用價(jià)值，其性平，味甘淡，有平肝潛陽(yáng)、清腸止痢的功效；可清熱解毒、化痰止咳、涼血明目、通便利尿,對(duì)佝僂病、痢疾、高血壓、氣管炎、鼻出血、營(yíng)養(yǎng)不良等多種疾病都有一定療效，并且發(fā)菜中具有高氨基酸評(píng)分的氨基酸組成，因此測(cè)定發(fā)菜中蛋白質(zhì)的氨基酸的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)發(fā)菜的營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值有重要意義。
[0004]氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)并同生命活動(dòng)有關(guān)的最基本的物質(zhì)，與生物的生命活動(dòng)有著密切的關(guān)系，是生物體內(nèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分之一；研究一種操作簡(jiǎn)單、提取率高的從發(fā)菜中提取氨基酸的方法很有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、提取率高的從發(fā)菜中提取氨基酸的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸的提取方法，包括以下步驟:
步驟一:無(wú)菌條件下將發(fā)菜細(xì)胞接種到BG-1I液體培養(yǎng)基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期進(jìn)行25°C恒溫培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1800~2200LuX，恒溫培養(yǎng)15~20天后，得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液備用；
步驟二:將步驟一所得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液抽濾后，取濾渣用水洗去黏狀物質(zhì)，去除發(fā)菜中的膠質(zhì)，得發(fā)菜細(xì)胞，備用；
步驟三:將步驟二所得的發(fā)菜細(xì)胞于40~60°C條件下干燥至恒重，研磨粉碎，過(guò)40目篩網(wǎng)，得發(fā)菜細(xì)胞粉末備用；
步驟四:將步驟三所得的發(fā)菜細(xì)胞粉末按照1:20~1:50的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為30%~75%的乙醇水溶液，于水浴溫度為50~80°C條件下超聲提取30~75min，過(guò)濾，得發(fā)菜細(xì)胞提取液；
步驟五:將步驟四所得的發(fā)菜細(xì)胞提取液于3500~4500rpm條件下離心分離15~25min,取上清液，即得發(fā)菜氨基酸提取液；
所述步驟一中光照強(qiáng)度為2000LUX ； 所述步驟三中將所得的發(fā)菜細(xì)胞于50°C條件下干燥至恒重；
所述步驟四中將所得的發(fā)菜細(xì)胞粉末按照1:40的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，于水浴溫度為70°C條件下超聲提取60min，過(guò)濾，得發(fā)菜細(xì)胞提取液；
所述步驟五中將所得的發(fā)菜細(xì)胞提取液于4000rpm條件下離心分離20min，取上清液，即得發(fā)菜氨基酸提取液。
[0007]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供的懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸的提取方法，采用懸浮培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞，利用超聲波提取發(fā)菜中的氨基酸，不僅能有效破碎細(xì)胞，而且還具有操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、消耗溶劑低、得率高、無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn)，提取率可達(dá)到7.2%，為研究開(kāi)發(fā)具有高氨基酸評(píng)價(jià)分的產(chǎn)品做出了貢獻(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。
[0009]實(shí)施例1
一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸的提取方法，包括以下步驟:
步驟一:無(wú)菌條件下將發(fā)菜細(xì)胞接種到BG-1I液體培養(yǎng)基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期進(jìn)行25°C恒溫培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000LUX，恒溫培養(yǎng)18天，得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液備用;
步驟二:將步驟一所得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液抽濾后，取濾渣用水洗去黏狀物質(zhì)，去除發(fā)菜中的膠質(zhì)，得發(fā)菜細(xì)胞，備用；
步驟三:將步驟二所得的發(fā)菜細(xì)胞于50°C條件下干燥至恒重，研磨粉碎，過(guò)40目篩網(wǎng)，得發(fā)菜細(xì)胞粉末備用；
步驟四:將步驟三所得的發(fā)菜細(xì)胞粉末按照1:40的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇水溶液，于水浴溫度為70°C條件下超聲提取60min，過(guò)濾，得發(fā)菜細(xì)胞提取液；
步驟五:將步驟四所得的發(fā)菜細(xì)胞提取液于4000rpm條件下離心分離20min，取上清液，即得發(fā)菜氨基酸提取液。
[0010]實(shí)施例2
一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸的提取方法，包括以下步驟:
步驟一:無(wú)菌條件下將發(fā)菜細(xì)胞接種到BG-1I液體培養(yǎng)基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期進(jìn)行25°C恒溫培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為ISOOLux，恒溫培養(yǎng)20天，得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液備用;
步驟二:將步驟一所得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液抽濾后，取濾渣用水洗去黏狀物質(zhì)，去除發(fā)菜中的膠質(zhì)，得發(fā)菜細(xì)胞，備用；
步驟三:將步驟二所得的發(fā)菜細(xì)胞于40°C條件下干燥至恒重，研磨粉碎，過(guò)40目篩網(wǎng)，得發(fā)菜細(xì)胞粉末備用；
步驟四:將步驟三所得的發(fā)菜細(xì)胞粉末按照1:20的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，于水浴溫度為50°C條件下超聲提取30min，過(guò)濾，得發(fā)菜細(xì)胞提取液；
步驟五:將步驟四所得的發(fā)菜細(xì)胞提取液于3500rpm條件下離心分離25min，取上清液，即得發(fā)菜氨基酸提取液。
[0011]實(shí)施例3
一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸的提取方法，包括以下步驟:
步驟一:無(wú)菌條件下將發(fā)菜細(xì)胞接種到BG-1I液體培養(yǎng)基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期進(jìn)行25°C恒溫培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2200LUX，恒溫培養(yǎng)15天，得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液備用;
步驟二:將步驟一所得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液抽濾后，取濾渣用水洗去黏狀物質(zhì)，去除發(fā)菜中的膠質(zhì)，得發(fā)菜細(xì)胞，備用；
步驟三:將步驟二所得的發(fā)菜細(xì)胞于60°C條件下干燥至恒重，研磨粉碎，過(guò)40目篩網(wǎng)，得發(fā)菜細(xì)胞粉末備用；
步驟四:將步驟三所得的發(fā)菜細(xì)胞粉末按照1:50的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇，于水浴溫度為80°C條件下超聲提取75min，過(guò)濾，得發(fā)菜細(xì)胞提取液；
步驟五:將步驟四所得的發(fā)菜細(xì)胞提取液于4500rpm條件下離心分離15min，取上清液，即得發(fā)菜氨基酸提取液。
[0012]BG-1l 培養(yǎng)基=NaNO3 1.5g, K2HPO4.3H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.075g, CaCl2.2H200.036g 檸檬酸 0.006g，檸檬酸鐵銨 0.006g, EDTA 0.0Olg, Na2CO3 0.02g, A5 溶液 1000 XImL,蒸懼水 919mL。
[0013]氨基酸含量的測(cè)定
(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
配制0.1 mg / mL的標(biāo)準(zhǔn)L-谷氨酸溶液；
(2)測(cè)定波長(zhǎng)的選擇
準(zhǔn)確稱取發(fā)菜粉末0.20g于具塞試管中，加入60%乙醇8mL，于70°C、功率70%條件下超聲提取60 min后，于4000rpm條件下離心分離20min，取上清液定容至10mL，再取I mL樣品溶液稀釋至10mL，即為待測(cè)的氨基酸提取液；
分別取標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品液各2mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸緩沖液ImL和茚三酮顯色液2mL,混勻后于100°C沸水浴中加熱15min后冷卻,放置5min后,加311^60%乙醇稀釋,搖勻后在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，每種液體平行做3次，取平均值，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和樣品溶液在570nm處均有最大吸收,最后選擇570 nm為本試驗(yàn)的最佳測(cè)定波長(zhǎng);
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
分別取20ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL于試管中，用水補(bǔ)足至2mL。各加入ImL pH5.4，2mol/L醋酸緩沖液；再加入2mL茚三酮顯色液，充分混勻后，蓋住試管口，在100°C水浴中加熱15min后冷卻，放置5min后，加入3mL 60%乙醇稀釋，充分搖勻，用分光光度計(jì)測(cè)定A957tol。(脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)呈黃色，應(yīng)測(cè)定fl944tol)。以X表示谷氨酸體積分?jǐn)?shù)，Y表示相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的吸光度值，得出標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=0.0377X+0.0054 (R2=0.9999)；
(4)氨基酸含量的測(cè)定
將待測(cè)的氨基酸提取液加入ImL pH5.4,2mol/L醋酸緩沖液；再加入2mL茚三酮顯色液，充分混勻后，蓋住試管口，在100°C水浴中加熱15min后冷卻，放置5min后，加入3mL60%乙醇稀釋，充分搖勻，用分光光度計(jì)測(cè)定A^57tol，將得到的吸光值代入回歸方程，測(cè)得氨基酸的含量為7.2%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:無(wú)菌條件下將發(fā)菜細(xì)胞接種到BG-1I液體培養(yǎng)基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期進(jìn)行25°C恒溫培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1800~2200LuX，恒溫培養(yǎng)15~20天后，得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液備用； 步驟二:將步驟一所得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液抽濾后，取濾渣用水洗去黏狀物質(zhì)，去除發(fā)菜中的膠質(zhì)，得發(fā)菜細(xì)胞，備用； 步驟三:將步驟二所得的發(fā)菜細(xì)胞于40~60°C條件下干燥至恒重，研磨粉碎，過(guò)40目篩網(wǎng)，得發(fā)菜細(xì)胞粉末備用； 步驟四:將步驟三所得的發(fā)菜細(xì)胞粉末按照1:20~1:50的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為30%~75%的乙醇水溶液，于水浴溫度為50~80°C條件下超聲提取30~75min，過(guò)濾，得發(fā)菜細(xì)胞提取液； 步驟五:將步驟四所得的發(fā)菜細(xì)胞提取液于3500~4500rpm條件下離心分離15~25min,取上清液，即得發(fā)菜氨基酸提取液。
2.如權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸提取方法，其特征在于:所述步驟一中光照強(qiáng)度為2000LUX。
3.如權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸提取方法，其特征在于:所述步驟三中將所得的發(fā)菜細(xì)胞于50°C條件下干燥至恒重。
4.如權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸提取方法，其特征在于:所述步驟四中將所得的發(fā)菜細(xì)胞粉末按照1:40的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，于水浴溫度為70°C條件下超聲提取60min，過(guò)濾，得發(fā)菜細(xì)胞提取液。
5.如權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸提取方法，其特征在于:所述步驟五中將所得的發(fā)菜細(xì)胞提取液于4000rpm條件下離心分離20min，取上清液，即得發(fā)菜氨基酸提取液。
【專利摘要】本發(fā)明提供的懸浮培養(yǎng)發(fā)菜氨基酸的提取方法，采用懸浮培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞，利用超聲波提取發(fā)菜中的氨基酸，不僅能有效破碎細(xì)胞，而且還具有操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、消耗溶劑低、得率高、無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn)，提取率可達(dá)到7.2%，為研究開(kāi)發(fā)具有高氨基酸評(píng)價(jià)分的產(chǎn)品做出了貢獻(xiàn)。
【IPC分類】C12R1-01, C12P13-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104593438
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510024997
【發(fā)明人】郭金英, 胡娟娟
【申請(qǐng)人】河南科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年1月19日