本發(fā)明涉及分子生物，具體涉及一種taqman熒光定量rt-pcr試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，prrs），是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine?reproductive?and?respiratorysyndrome，prrsv）引起的豬繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)疾病的一種急性且具有高度傳染性的病毒性傳染病，是我國乃至全球規(guī)?；i場最常見的傳染病之一。

2、?prrsv?有10個開放閱讀框(open?reading?frame，orf)，包含 orf1a、 orf1b、 orf2a、orf2b、 orf3、orf4、orf5、orf5a、orf6和 orf7。其中， orf2-5?編碼結(jié)構(gòu)蛋白：gp2a、e、gp3、gp4、gp5、gp5a； orf6?編碼基質(zhì)蛋白(m)； orf7?編碼病毒核衣殼蛋白(n)； orf1?蛋白可以進一步水解成16種非結(jié)構(gòu)蛋白，包括?nsp1α、?nsp1β、?nsp2-6、?nsp?2n、?nsp2tf、?nsp7α、nsp7β和?nsp8-12；其中nsp2基因編碼最大的非結(jié)構(gòu)，在病毒復(fù)制中起著重要的作用，不同病毒株的nsp2基因長度之間存在差異，這使它成為了鑒別不同毒株的靶標(biāo)之一。

3、豬繁殖與呼吸綜合征中的經(jīng)典型毒株（c-prrsv）、高致病型毒株（hp-prrsv）和nadc-30like型毒株（nl-prrsv）在我國廣泛流傳；因此，需要對經(jīng)典型毒株（c-prrsv）、高致病型毒株（hp-prrsv）和nadc-30like型毒株（nl-prrsv）進行檢測。

4、目前，基于?pcr原理研發(fā)了一些?prrsv檢測方法，以提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性?，F(xiàn)有的prrsv檢測方法包括一步法多重?pcr（one-step?multiplex?pcr）、實時熒光定量pcr（real-time?fluorescence?quantitative?pcr）、巢式?pcr（nested?pcr）和逆轉(zhuǎn)錄?pcr（reverse?transcriptase?pcr）。

5、在prrsv?檢測方法研究中，以熒光定量?pcr?為代表的分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性強和時效性好的優(yōu)點，應(yīng)用廣泛。但現(xiàn)有方法仍存在不足，如：檢測方法能夠區(qū)分hp-prrsv和c-prrsv，但不能檢測prrsv-1或hp-prrsv和c-prrsv的合并感染。并且，雖然現(xiàn)有的taqman熒光定量?pcr檢測具有靈敏度高的優(yōu)點，但是，檢測下限基本在102copies/μl左右。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種taqman熒光定量rt-pcr試劑盒及其應(yīng)用，不僅能夠同時檢測出豬繁殖與呼吸綜合征的三種毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv，且具有特異性好、靈敏度高和重復(fù)性好的優(yōu)點，尤其是能夠大幅度降低檢測下限、提高靈敏度，三種毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的檢測下限在101copies/μl左右。

2、本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、一種taqman熒光定量rt-pcr試劑盒，所述taqman熒光定量rt-pcr試劑盒能夠同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征中的c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv；

4、所述taqman熒光定量rt-pcr試劑盒包括分別用于檢測c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的引物及探針；

5、用于檢測c-prrsv的上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，下游引物的核苷酸序列seq?id?no.2所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

6、用于檢測hp-prrsv的上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，下游引物的核苷酸序列seq?id?no.5所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

7、用于檢測nl-prrsv的上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，下游引物的核苷酸序列seq?id?no.8所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.9所示。

8、本發(fā)明通過對豬繁殖與呼吸綜合征的三種毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的nsp2?區(qū)域進行比對分析，分別設(shè)計特異性引物和探針；采用本發(fā)明試劑盒的特異性引物和探針進行taqman熒光定量rt-pcr檢測時，只能擴增出三種目的基因型（c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv）的特異性片段，特異性好；能夠大幅度降低檢測下限、提高靈敏度，三種毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的檢測下限在101copies/μl左右；組內(nèi)和組間變異系數(shù)在0.10%~2%之間，重復(fù)性好。

9、綜上，本發(fā)明的taqman熒光定量rt-pcr試劑盒不僅能夠同時檢測出豬繁殖與呼吸綜合征的三種毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv，且具有特異性好、靈敏度高和重復(fù)性好的優(yōu)點，尤其是能夠大幅度降低檢測下限、提高靈敏度。

10、在具體實施時，taqman熒光定量rt-pcr試劑盒還包括反應(yīng)液，反應(yīng)液包括緩沖液（2x?one?step?rt-pcr?buffer）和反轉(zhuǎn)錄酶（takara?ex?taq?hs）。

11、在具體實施時，taqman熒光定量rt-pcr試劑盒還包括陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品，陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品包括c-prrsv質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、hp-prrsv質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和nl-prrsv質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

12、其中，c-prrsv質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的核苷酸序列如seq?id?no.10所示；hp-prrsv質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的核苷酸序列如seq?id?no.11所示；nl-prrsv質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。

13、在具體實施時，還包括陰性對照液，所述陰性對照液為去rna酶水（rnase?freeh2o）。

14、一種taqman熒光定量rt-pcr試劑盒在豬繁殖與呼吸綜合征檢測中的應(yīng)用，檢測的毒株包括c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv。

15、采用上述試劑盒進行taqman熒光定量rt-pcr檢測時，rt-pcr反應(yīng)程序為：預(yù)變性95?℃，10?s；變性?95?℃，10?s；退火延伸?55~58?℃，30?s，40個循環(huán)。

16、在一種優(yōu)選方式中，rt-pcr反應(yīng)程序為：預(yù)變性?95?℃，10?s；變性?95?℃，10?s；退火延伸?57?℃，30?s，40個循環(huán)。

17、采用上述試劑盒進行taqman熒光定量rt-pcr檢測時，rt-pcr反應(yīng)體系為：用于檢測c-prrsv的上游引物和下游引物的濃度均為10?μmol/l、體積均為0.2~1.2μl，用于檢測c-prrsv的探針濃度為10?μmol/l、體積為0.1~1μl；用于檢測hp-prrsv的上游引物和下游引物的濃度均為10?μmol/l、體積均為0.2~1.2μl，用于檢測hp-prrsv的探針濃度為10?μmol/l、體積為0.2~1.2μl；用于檢測nl-prrsv的上游引物和下游引物的濃度均為10?μmol/l、體積均為0.1~0.6μl，用于檢測nl-prrsv的探針濃度為10?μmol/l、體積為0.2~1.2μl。

18、在一種優(yōu)選方式中，用于檢測c-prrsv的上游引物和下游引物的濃度均為10?μmol/l、體積均為1.0μl，用于檢測c-prrsv的探針濃度為10?μmol/l、體積為0.4μl；用于檢測hp-prrsv的上游引物和下游引物的濃度均為10?μmol/l、體積均為0.6μl，用于檢測hp-prrsv的探針濃度為10?μmol/l、體積為0.8μl；用于檢測nl-prrsv的上游引物和下游引物的濃度均為10?μmol/l、體積均為0.2μl，用于檢測nl-prrsv的探針濃度為10?μmol/l、體積為0.6μl。

19、本發(fā)明基于設(shè)計的特異性引物和探針，對rt-pcr反應(yīng)體系中特異性引物和探針的濃度以及rt-pcr反應(yīng)程序進行優(yōu)化，設(shè)計出與試劑盒中的特異性引物和探針最匹配的rt-pcr反應(yīng)程序，能夠進一步降低taqman?熒光定量pcr的檢測限，使三種毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的檢測下限在101copies/μl左右，相比現(xiàn)有的taqman?熒光定量?pcr的檢測限為102copies/μl左右，實現(xiàn)了檢測下限的大幅度降低，進而大幅度提高了試劑盒用于taqman?熒光定量?pcr檢測的靈敏度，可以是用于豬繁殖與呼吸綜合征的痕量分析，且痕量分析的準(zhǔn)確度高。

20、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：

21、本發(fā)明通過對豬繁殖與呼吸綜合征的三種毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的nsp2?區(qū)域進行比對分析，分別設(shè)計特異性引物和探針，taqman熒光定量?rt-pcr?檢測法只能擴增出三種目的基因型的特異性片段，特異性好；且根據(jù)設(shè)計的特異性引物和探針，優(yōu)化了rt-pcr反應(yīng)體系中特異性引物和探針的濃度，并優(yōu)化了rt-pcr反應(yīng)程序；能夠大幅度降低c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv檢測下限、提高試劑盒的檢測靈敏度；c-prrsv、hp-prrsv、nl-prrsv?的檢測下限分別在10.1、11.1、9.1?copies/μl，組內(nèi)和組間變異系數(shù)在0.10%~2%之間，重復(fù)性好。