本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及基于基因甲基化檢測實現(xiàn)人t淋巴細(xì)胞計數(shù)的試劑盒。

背景技術(shù)：

1、淋巴細(xì)胞是人體抵御疾病、激起免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分，其在分化成熟過程中會表達(dá)分化抗原，即cd分子。根據(jù)表達(dá)cd分子的不同，淋巴細(xì)胞亞群主要包括t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞和nk細(xì)胞。t淋巴細(xì)胞起源于骨髓，然后轉(zhuǎn)移到胸腺中發(fā)育成熟。t淋巴細(xì)胞的特征標(biāo)記物包括cd3和t細(xì)胞受體（tcr），根據(jù)功能和表面分子不同，主要可分為cd4+?t細(xì)胞、cd8+?t細(xì)胞等其他類型。

2、淋巴細(xì)胞不同亞群的比例、數(shù)量以及功能會直接影響機(jī)體的免疫狀態(tài)，“淋巴細(xì)胞亞群”檢測是評估機(jī)體當(dāng)下免疫功能和平衡狀態(tài)的重要指標(biāo)，尤其對于免疫功能缺陷患者，是必不可少的診斷項目。正常情況下，淋巴細(xì)胞各亞群保持一定的比例和數(shù)量，協(xié)同合作，維持著機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。而在疾病過程中，免疫細(xì)胞的比例和數(shù)量會發(fā)生病理性的變化，導(dǎo)致免疫功能紊亂。淋巴細(xì)胞計數(shù)的應(yīng)用場景廣泛，主要可包括感染和惡性腫瘤患者淋巴細(xì)胞亞群總量異常的早期篩查，原發(fā)性免疫缺陷篩查后驗證，慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟ll）的輔助診斷，hiv陽性患者治療后檢測監(jiān)測，免疫和免疫重建監(jiān)測，如移植、自身免疫和其他免疫狀況的免疫抑制治療后及造血干細(xì)胞移植后免疫重建的評估等。

3、目前流式細(xì)胞術(shù)（flow?cytometry，fcm）是淋巴細(xì)胞亞群或是t淋巴細(xì)胞計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，它是利用不同單克隆抗體與淋巴細(xì)胞表面的cd抗原結(jié)合，再配合多色熒光染料，同時檢測幾種淋巴細(xì)胞的表面抗原，將t淋巴細(xì)胞從白細(xì)胞中分開，從而得到t淋巴細(xì)胞的數(shù)量和相對比例。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行t淋巴細(xì)胞計數(shù)存在以下幾方面的局限：其一，對樣本的要求較高，待檢測的細(xì)胞須是完整的，血樣要求“新鮮”，一般要求在8小時內(nèi)進(jìn)行檢測；其二，由于流式t淋巴細(xì)胞對樣本的要求較大，對于某些應(yīng)用場景如嬰幼兒的采血問題較大；其三，流式細(xì)胞術(shù)是檢測熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合細(xì)胞表面的抗原后復(fù)合物的熒光信號，需要確定陰陽性復(fù)合物之間的閾值，但對于不同細(xì)胞亞群的表面抗原來說，其表達(dá)不是有或無的過程，而是低、中、高不同的表達(dá)水平，因此，t淋巴細(xì)胞亞群可能由于閾值確定去準(zhǔn)確而導(dǎo)致計數(shù)不準(zhǔn)；其四，由于樣本、免疫學(xué)檢測技術(shù)和操作過程的差異，各實驗室檢測結(jié)果差異較大，流式t淋巴細(xì)胞計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化仍然是一個挑戰(zhàn)，標(biāo)準(zhǔn)化方案有待建立。

4、在t淋巴細(xì)胞的分化發(fā)育過程中，dna甲基化修飾發(fā)揮了重要作用，通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和關(guān)閉，從而提供了t淋巴細(xì)胞的特異性的甲基化標(biāo)志物，如某些參與t淋巴細(xì)胞分化發(fā)育的基因啟動子區(qū)，在t淋巴細(xì)胞中完全未甲基化，而在淋巴細(xì)胞之外的其他淋巴細(xì)胞亞群中高度甲基化，如b淋巴細(xì)胞、nk細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞如粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。這些未甲基化的cpg位點可以作為特異性的差異甲基化區(qū)域（dmr），即作為生物標(biāo)志物，用來鑒定t淋巴細(xì)胞，并用于外周血中t細(xì)胞的定量。這種t淋巴細(xì)胞的特征不是通過細(xì)胞形態(tài)或表面標(biāo)記物，而是通過表觀遺傳學(xué)手段，有望克服上述流式檢測方法的局限性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服上述問題，本發(fā)明提供一種基于基因甲基化檢測實現(xiàn)人t淋巴細(xì)胞計數(shù)的試劑盒，所述試劑盒是檢測樣本中bcl11b基因甲基化的試劑盒。

2、在一種實施方式中，所述試劑盒是用于檢測bcl11b基因上差異性甲基化區(qū)域hg38chr14:?99189637-99188739中片段的試劑盒。

3、在一種實施方式中，所述試劑盒是用于檢測bcl11b基因上差異性甲基化區(qū)域hg38chr14:?99189331-99189185的試劑盒。

4、在一種實施方式中，所述試劑盒是用于檢測包含bcl11b基因上差異性甲基化位點hg38?chr14:?99189256，hg38?chr14:?99189339，hg38?chr14:?99189410和hg38?chr14:99189483中至少一個的基因區(qū)域的試劑盒。

5、在一種實施方式中，所述試劑盒通過檢測內(nèi)參基因和bcl11b基因的拷貝數(shù)，從而計算出人的t細(xì)胞占人的白細(xì)胞比例。

6、在一種實施方式中，所述內(nèi)參基因是rpp30基因。

7、在一種實施方式中，所述試劑盒是測序試劑盒、定量pcr試劑盒或數(shù)字pcr試劑盒。

8、在一種實施方式中，所述試劑盒包括：用于檢測hg38?chr14:?99189331-99189185的區(qū)域中的cpg位點甲基化狀態(tài)的引物和探針以及用于檢測內(nèi)參基因拷貝數(shù)的引物和探針。

9、在一種實施方式中，所述試劑盒包括：上游引物seq?id?no.4:ggtagtttggttgtgtatttgggtattt，下游引物seq?id?no?.?5:aacctacaacacttctacaacactttac?，和探針seq?id?no?.?6:?ctaccaaaacataatcat。

10、在一種實施方式中，所述樣本選自體液，組織樣品和器官樣品。

11、在一種實施方式中，其中所述樣本選自外周血樣品、毛細(xì)管血樣品或靜脈血樣品或其亞組分、外周血單核細(xì)胞，血塊和干血斑。

12、基于以上現(xiàn)狀，為了克服當(dāng)前基于細(xì)胞學(xué)t淋巴細(xì)胞計數(shù)的技術(shù)局限性，并擴(kuò)大其適用性，本發(fā)明首先提出了bcl11b基因未甲基化基因區(qū)可作為t淋巴細(xì)胞鑒定的生物標(biāo)志物。

13、甲基化芯片中cpg位點的β值代表甲基化程度，比較各組樣本間相應(yīng)cpg點的β差值（δβ值）可以篩選差異性甲基化位點，δβ值的絕對值越大，表明該位點甲基化程度差異越大，位點的特異性越強(qiáng)。本發(fā)明在以上述原則篩選t淋巴細(xì)胞差異性cpg位點時，創(chuàng)造性設(shè)置另外一篩選條件：甲基化芯片中相鄰的4-5個cpg位點的δβ值都盡可能大，同時這幾個位點是連續(xù)的，且盡可能密集，這樣能保證由這4-5個甲基化位點構(gòu)成的基因片段具備最大的特異性，從而滿足潛在生物學(xué)標(biāo)志物的需要。按此篩查條件，本發(fā)明最終確定了bcl11b基因上δβ值較大且分布相對密集的4個差異性甲基化位點：cg07015803（hg38?chr14:99189256）、cg16452866（hg38?chr14:?99189339）、cg04712122（hg38?chr14:?99189410）和cg16147511（hg38?chr14:?99189483）。

14、鑒于對基因發(fā)揮調(diào)控作用或是用于甲基化檢測的是一段基因序列，須由上述篩查的差異性甲基化位點再確定一段差異性甲基化區(qū)域（dmr），用作區(qū)分t淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。同時，甲基化芯片中探針覆蓋的cpg位點也非連續(xù)，本發(fā)明以篩選的4個差異性甲基化位點為基點，通過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和pcr擴(kuò)增后的sanger測序，驗證在其前后約500bp的序列中所含的44個cpg位點的甲基化狀態(tài)，在t淋巴細(xì)胞中這些位點均為未甲基化狀態(tài)，而在其它亞群中這些cpg位點均為甲基化狀態(tài)，與篩查出的4個差異性甲基化位點的甲基化狀態(tài)完全一致，從而確定了一段約900bp由44個甲基化位點構(gòu)成的差異性甲基化區(qū)域（hg38chr14:?99189637-99188739），作為t淋巴細(xì)胞的特異性未甲基化區(qū)域。

15、在上述驗證的約900bp差異性甲基化區(qū)域中，選擇cpg位點相對集中，同時覆蓋不同甲基化位點的多個擴(kuò)增子檢測片段，如amp9543、amp8974和amp9324，設(shè)計相應(yīng)甲基化轉(zhuǎn)化后片段的引物和探針，通過熒光定量pcr（qpcr）結(jié)果比較候選擴(kuò)增子的δct值（ct陰性-ct陽性），δct值越高，表明針對t淋巴細(xì)胞的特異性越好，從而優(yōu)選出bcl11b基因上對應(yīng)擴(kuò)增子amp9324的一段147bp的差異性甲基化區(qū)域（hg38?chr14:?99189331-99189185），具有更好的特異性和靈敏度，可作為t淋巴細(xì)胞鑒定的生物標(biāo)志物。

16、本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：首先，對待測樣本的gdna進(jìn)行提取，提取后的gdna經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后作為dna模板。然后，使用bcl11b靶基因的擴(kuò)增子特異的引物探針以及內(nèi)參基因rpp30特異的引物探針，進(jìn)行雙重qpcr擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在qpcr儀器上運(yùn)行，擴(kuò)增結(jié)果以熒光曲線的形式給出，選取純化的t淋巴細(xì)胞為參照體系，依據(jù)擴(kuò)增曲線和2-δδct的方法，可計算得出t淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞中的相對含量。此外，也可采用數(shù)字pcr檢測平臺，直接通過檢測bcl11b靶基因和rpp30內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，依據(jù)內(nèi)參基因拷貝數(shù)和細(xì)胞數(shù)的對應(yīng)關(guān)系（rpp30的拷貝數(shù)：細(xì)胞數(shù)=2：1），利用公式：t淋巴細(xì)胞的相對含量（%）=?bcl11b靶基因的拷貝數(shù)/內(nèi)參基因的拷貝數(shù)╳100，可計算出t淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞中的相對含量。本發(fā)明所選的rpp30內(nèi)參基因檢測片段，在所有白細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，且序列中的胞嘧啶均為未甲基化狀態(tài)。

17、本發(fā)明檢測的靶標(biāo)是樣本中白細(xì)胞dna的甲基化水平，能適用各種類型的樣本，包括新鮮或冷凍的血液、分離的pbmc細(xì)胞、干血斑等，對樣本的要求大大降低，對樣本的保存狀態(tài)沒有要求；其次，dna擴(kuò)增檢測對樣本的需求量少，微量dna可以滿足檢測要求；再者，通過pcr獲得的檢測信號是數(shù)字的，它們表示每個細(xì)胞一個陽性或陰性值，而不是像流式細(xì)胞術(shù)方法那樣任意定義的“陽性”閾值；最后，基于表觀遺傳qpcr能夠以自動化、獨(dú)立于操作者的方式進(jìn)行，并降低對試劑變異性的敏感性。本發(fā)明試劑盒不僅是傳統(tǒng)流式細(xì)胞學(xué)檢測的有益補(bǔ)充，還可服務(wù)于新生兒重癥聯(lián)合免疫缺陷（scid）篩查。