本發(fā)明涉及一種提高l-組氨酸產(chǎn)量的大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，屬于生物工程。

背景技術(shù)：

1、l-組氨酸(l-histidine)，也被稱為l-α-氨基-β-咪唑丙酸，是側(cè)鏈含有咪唑基的堿性氨基酸。分子式為c6h9n3o2，相對(duì)分子質(zhì)量155.16。

2、近些年來，l-組氨酸已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品以及飼料行業(yè)。l-組氨酸對(duì)生長、組織修復(fù)均有重要的作用，可以用于制備氨基酸輸液以及綜合氨基酸制劑，治療潰瘍、胃酸過多、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病。另外，l-組氨酸也可以作為多種藥物的合成前體。l-組氨酸可以與β-丙氨酸組成肌肽，可用于合成治療腎衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、老年性癡呆癥等多種疾病的藥物。

3、合成l-組氨酸的傳統(tǒng)方法主要是蛋白水解法，但其生產(chǎn)量取決于大豆、淀粉等富含天然蛋白質(zhì)的原料的可用性，生產(chǎn)量較低。微生物發(fā)酵法是目前生產(chǎn)l-組氨酸的主流方法，常用于生產(chǎn)l-組氨酸的微生物主要包括谷氨酸棒狀桿菌、大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌。大腸桿菌作為模式菌株，其遺傳背景清晰、生長較快且基因操作手段成熟。所以大腸桿菌可作為理想宿主來進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)l-組氨酸。

4、在大腸桿菌中，l-組氨酸的合成以葡萄糖為原料，以腺苷三磷酸(atp)和5-磷酸核糖焦磷酸(prpp)為前體物，通過十步催化反應(yīng)而合成。首先atp磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(由hisg基因編碼)催化prpp的c1與atp的n1相連，脫去焦磷酸后開環(huán)，分解，放出5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸(aicar)，用于嘌呤合成。留下的咪唑甘油磷酸經(jīng)氧化、轉(zhuǎn)氨、脫磷酸形成組氨醇，氧化生成組氨酸。由atp磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)是l-組氨酸合成路徑的限速步驟。

5、當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道l-組氨酸發(fā)酵法最高產(chǎn)量是天科大謝希賢老師2020年發(fā)表的文章，展示了通過基因改造野生型大腸桿菌提高組氨酸產(chǎn)量的工作。最終，改造后的菌株hw6-3能夠產(chǎn)生11.8g/l的組氨酸。并在5l發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵下生產(chǎn)出66.5g/l的組氨酸。

6、組氨酸生產(chǎn)菌b25是以bl21(de3)為出發(fā)菌，做了以下改造：用人工的開放閱讀框(hisl′-λattb′-trpe)替換了l-組氨酸操縱子的前導(dǎo)區(qū)hisl，解除了hisl的反饋抑制；過表達(dá)關(guān)鍵酶hisg(s.marcescens來源)；過表達(dá)prs(s.marcescens來源)，增強(qiáng)前體物質(zhì)prpp的合成。然而，在atp和prpp兩個(gè)前體物質(zhì)中，b25菌株的atp合成沒有被增強(qiáng)。而且在組氨酸發(fā)酵，尤其是大罐的生產(chǎn)中，溶氧條件是比較差的，氧氣的利用率較低，這又進(jìn)一步限制了atp的合成。

7、因此現(xiàn)有技術(shù)中，atp供應(yīng)不足和氧氣的利用率不高仍然是對(duì)l-組氨酸的合成產(chǎn)生限制的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明闡述了一種提高l-組氨酸產(chǎn)量的大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，目的在于通過過表達(dá)cgppk2和vhb來提高l-組氨酸產(chǎn)量。

2、本發(fā)明提供的第一個(gè)技術(shù)方案為一種大腸桿菌基因工程菌，所述基因工程菌是在大腸桿菌中過表達(dá)有谷氨酸棒桿菌來源的多聚磷酸激酶cgppk2和透明顫菌血紅蛋白vhb。

3、在某些實(shí)施方式中，所述cgppk2基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，所述vhb基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

4、在某些實(shí)施方式中，所述cgppk2基因和所述vhb基因分別整合在所述大腸桿菌的基因組ycgh和caib基因位點(diǎn)。

5、在某些實(shí)施方式中，所述大腸桿菌為大腸桿菌b25。

6、在某些實(shí)施方式中，所述大腸桿菌b25為以大腸桿菌bl21(de3)為出發(fā)菌株，用開放閱讀框(hisl′-λattb′-trpe)替換了l-組氨酸操縱子的前導(dǎo)區(qū)hisl，解除了hisl的反饋抑制；過表達(dá)關(guān)鍵酶hisg(s.marcescens來源)；過表達(dá)prs(s.marcescens來源)，增強(qiáng)前體物質(zhì)prpp的合成。

7、本發(fā)明提供的第二個(gè)技術(shù)方案為一種大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，所述方法是以大腸桿菌為出發(fā)菌株，在所述出發(fā)菌株中過表達(dá)了谷氨酸棒桿菌來源的多聚磷酸激酶cgppk2和透明顫菌血紅蛋白vhb。

8、在某些實(shí)施方式中，所述cgppk2基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，所述vhb基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

9、在某些實(shí)施方式中，所述cgppk2基因和所述vhb基因分別整合在所述大腸桿菌的基因組ycgh和caib基因位點(diǎn)。

10、優(yōu)選地，所述cgppk2基因和所述vhb基因分別采用crispr介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)整合至所述大腸桿菌的基因組上。

11、在某些實(shí)施方式中，所述cgppk2基因和所述vhb由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)；可選地，所述強(qiáng)組成型啟動(dòng)子為啟動(dòng)子trc，核苷酸序列如seq?id?no:3。

12、本發(fā)明提供的第三個(gè)技術(shù)方案為一種生產(chǎn)組氨酸的方法，所述方法是利用第一個(gè)技術(shù)方案所述的基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵，合成組氨酸。

13、在某些實(shí)施方式中，所述方法是將第一個(gè)技術(shù)方案所述的基因工程菌的活化液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵制備組氨酸。

14、在某些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖30-40g/l、酵母膏1-5g/l、(nh4)2so410-20g/l、k2hpo4·3h2o?1-5g/l、mnso4·5h2o?1-10mg/l、feso4·7h2o?1-10mg/l、caco320-30g/l、六偏磷酸鈉1-10g/l、mgso4·7h2o?1-5g/l。

15、在某些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵參數(shù)為：在溫度35.0-40.0℃、200-250rpm的條件下發(fā)酵36-40h。

16、本發(fā)明提供的第四個(gè)技術(shù)方案為第一個(gè)技術(shù)方案所述的基因工程菌，或者第二個(gè)技術(shù)方案所述的方法，或者第三個(gè)技術(shù)方案所述的方法在制備組氨酸或含組氨酸產(chǎn)品中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明的技術(shù)效果如下：

18、本發(fā)明通過在大腸桿菌中過表達(dá)cgppk2和vhb基因，既保證了充足的atp供應(yīng)，又能從分子水平上提高vhb基因克隆菌對(duì)氧氣的利用率，進(jìn)而提升基因工程菌的l-組氨酸的產(chǎn)量，產(chǎn)量最終達(dá)到2.76g/l，相比于出發(fā)菌株提高了52.49％。

技術(shù)特征：

1.一種大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大腸桿菌中過表達(dá)有谷氨酸棒桿菌來源的多聚磷酸激酶cgppk2和透明顫菌血紅蛋白vhb，所述cgppk2基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，所述vhb基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌為大腸桿菌b25。

3.一種大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法是以大腸桿菌為出發(fā)菌株，在所述出發(fā)菌株中過表達(dá)了谷氨酸棒桿菌來源的多聚磷酸激酶cgppk2和透明顫菌血紅蛋白vhb，所述cgppk2基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，所述vhb基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述cgppk2基因和所述vhb基因分別整合在所述大腸桿菌的基因組ycgh和caib基因位點(diǎn)。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述cgppk2基因和所述vhb由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)；可選地，所述強(qiáng)組成型啟動(dòng)子為啟動(dòng)子trc。

6.一種生產(chǎn)組氨酸的方法，其特征在于，所述方法是利用權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵，合成組氨酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是將權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌的活化液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵制備組氨酸。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖30-40g/l、酵母膏1-5g/l、(nh4)2so4?10-20g/l、k2hpo4·3h2o?1-5g/l、mnso4·5h2o?1-10mg/l、feso4·7h2o?1-10mg/l、caco3?20-30g/l、六偏磷酸鈉1-10g/l、mgso4·7h2o?1-5g/l。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵參數(shù)為：在溫度35.0-40.0℃、200-250rpm的條件下發(fā)酵36-60h。

10.權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，或者權(quán)利要求3～5任一項(xiàng)所述的方法，或者權(quán)利要求6～9任一項(xiàng)所述的方法在制備組氨酸或含組氨酸產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種提高L?組氨酸產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。以大腸桿菌為出發(fā)菌株在其基因組上整合和過表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因，以增強(qiáng)氧氣和ATP的有效供應(yīng)，提高L?組氨酸的產(chǎn)量。該基因工程菌用于發(fā)酵法生產(chǎn)L?組氨酸，在搖瓶發(fā)酵48h，L?組氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高2.76g/L，相較于出發(fā)菌株，產(chǎn)量提高了52.49％。

技術(shù)研發(fā)人員：史一婷,周建龍,張玉華
受保護(hù)的技術(shù)使用者：無錫晶海氨基酸股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6