本發(fā)明涉及界面化學和細胞生物學領域，具體涉及一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基及其制備方法和應用。

背景技術：

1、過量的活性氧(ros)會對細胞必需成分造成氧化損傷，并導致各種人類疾病，如癌癥以及心血管、眼部和神經(jīng)退行性疾病。ros相關疾病通常用天然或人工化學抗氧化劑治療。然而，各種抗氧化劑未能顯示出對抗氧化應激的明顯臨床益處，尤其是對氧化損傷引起的慢性疾病?；瘜W抗氧化劑失敗的可能原因包括：1)無法進入組織/器官或氧化損傷部位，2)干擾正常水平的ros關鍵生理功能，以及3)毒性副作用。這些方面強調了對創(chuàng)新抗氧化方法的迫切需求。

2、超小納米氣泡(unb)具有獨特的物理化學性質，可以解決這些問題并為抗氧化提供一種新方法。unb是懸浮在水中的納米級(小于50納米)氣泡。我們最近的研究證明，氧和氮unb可以保護水溶液中的有機分子或金屬表面免受化學產(chǎn)生的ros的氧化損傷。unb的ros清除機制不同于化學抗氧化劑，如最近的一篇評論中所分類。這種方法已顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)化學抗氧化劑的明顯優(yōu)勢，包括可持續(xù)性、穩(wěn)定性和生物安全性。因此，如果unb能夠在細胞水平上發(fā)揮抗氧化作用，那么這些優(yōu)勢將被用于緩解生物體的氧化應激。正如barryhalliwell所指出的，許多抗氧化劑的體外和體內(nèi)效果并不總是一致的。例如，硫化氫和褪黑激素在體外表現(xiàn)出ros清除能力，但在體內(nèi)卻不能達到同等的抗氧化效果。同時，雖然抗壞血酸等化合物可以在體內(nèi)清除ros，但它們不一定能減少氧化損傷，因為必須考慮非局部作用和潛在的有毒副產(chǎn)物等因素。因此，體外抗氧化作用通常不會轉化為體內(nèi)作用。間充質干細胞(msc)因其分化成多種細胞類型的能力及其在再生醫(yī)學中的潛力，在醫(yī)學領域備受關注。其應用范圍涵蓋組織工程以及炎癥和自身免疫性疾病的治療。鑒于其治療潛力，對msc的需求不斷增加。為了滿足這一需求，體外大規(guī)模擴增msc至關重要。然而，在保持細胞質量和功能的同時實現(xiàn)大規(guī)模擴增面臨諸多挑戰(zhàn)。增加體外msc擴增的標準方法包括使用生物反應器、優(yōu)化培養(yǎng)基和生長因子。盡管這些方法取得了一定成功，但也存在局限性。生物反應器可能昂貴且復雜，優(yōu)化培養(yǎng)基可能并不總是支持長期細胞活力，而生長因子可能帶來變異性和潛在的安全問題。解決這些缺點對于推進基于msc的療法至關重要。需要持續(xù)研究和創(chuàng)新，以開發(fā)更高效、更具成本效益和更可靠的大規(guī)模msc擴增方法?？朔@些挑戰(zhàn)將釋放msc在醫(yī)療應用中的全部潛力，最終改善患者的治療效果并推動再生醫(yī)學的發(fā)展。

3、大規(guī)模msc擴增的一個重大挑戰(zhàn)是復制性衰老，即細胞在連續(xù)幾代中增殖和維持干性的能力逐漸下降。在導致復制性衰老的因素中，活性氧(ros)的積累是重要的因素之一。ros可引起氧化應激并損害細胞成分，進而影響細胞功能和加速衰老。為了減輕ros的影響并延長msc的復制壽命，研究人員使用外源性抗氧化劑來中和ros，從而減少氧化應激并可能增加msc在體外可以經(jīng)歷的細胞分裂次數(shù)。多項研究報告稱，使用抗氧化劑可以成功增強msc的增殖和壽命。然而，化學抗氧化劑有時會干擾正常的細胞信號通路，并且抗氧化劑對msc及其治療潛力的長期影響仍不明確。解決這些缺陷對于優(yōu)化體外msc擴增至關重要。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基及其制備方法和應用，從而解決現(xiàn)有技術中的化學抗氧化劑的效用低且存在多種風險的問題。

2、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基，所述細胞培養(yǎng)基中含有粒徑小于50nm的超小粒徑納米氣泡，該超小粒徑納米氣泡在所述細胞培養(yǎng)基中的總濃度>1011個/毫升。

3、優(yōu)選地，所述超小粒徑納米氣泡在動態(tài)光散射技術(dls)測量中表現(xiàn)為粒徑分布范圍在1nm～50nm，更優(yōu)選為2nm～15nm。

4、根據(jù)本發(fā)明提供的超小粒徑納米氣泡細胞培養(yǎng)基，所述超小粒徑納米氣泡在納米粒子追蹤分析系統(tǒng)(nta)測量中表現(xiàn)為粒徑的大小在50nm以下，其中在動態(tài)光散射技術(dls)測量中10nm附近的氣泡數(shù)占據(jù)了總數(shù)的絕大部分。優(yōu)選地，動態(tài)光散射技術(dls)測量中粒徑分布范圍在1nm～15nm的氣泡數(shù)占據(jù)總數(shù)的99％以上。

5、優(yōu)選地，超小粒徑納米氣泡濃度高于動態(tài)光散射技術(dls)檢測限，所述納米氣泡的dls數(shù)量強度占比>99％。

6、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：s1：將需要引入超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基冷卻到-20℃～-80℃；s2：將冷卻后的細胞培養(yǎng)基放入到加壓裝置內(nèi)；s3：向所述加壓裝置中通入高壓氣體或采用機械力加壓，以增大加壓裝置內(nèi)部壓力；s4：維持高壓條件，持續(xù)一段時間；s5：緩慢釋壓至常壓狀態(tài)，即可制備得到一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)。

7、優(yōu)選地，步驟s1包括：將需要引入超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基冷卻至-20℃～-80℃。最優(yōu)選地，冷卻至-80℃。應當理解的是，將細胞培養(yǎng)基冷卻至-20℃～-80℃可以更好地引入超小粒徑納米氣泡。

8、步驟s1中的所述細胞培養(yǎng)基可以根據(jù)需要任意選擇，包含但不限于完全培養(yǎng)基、維持培養(yǎng)基、干細胞專用培養(yǎng)基、商用品牌細胞培養(yǎng)基等等。應當理解的是，本發(fā)明方法適用于任何細胞培養(yǎng)基，并不僅限于干細胞培養(yǎng)基，也不對細胞培養(yǎng)基的配方有任何限定要求。

9、優(yōu)選地，步驟s3包括：向所述加壓裝置中通入高壓氣體，根據(jù)不同需要選擇不同的氣體種類，包括氮氣、氧氣、氫氣、空氣等等。

10、優(yōu)選地，步驟s3、s4包括：所述高壓條件的壓力范圍為0.2mpa～1.2mpa，維持時間20min～60min。

11、進一步優(yōu)選地，步驟s4中的壓力范圍為0.4mpa～1.2mpa，維持時間40min～60min。

12、優(yōu)選地，步驟s5包括：釋壓過程采用氣體流量計控制釋氣速率。

13、優(yōu)選地，除了步驟s1之外，步驟s2～s5中不進行任何額外的升溫或降溫操作，保持細胞培養(yǎng)基溫度正常變化。

14、但是應當理解的是，本發(fā)明通過低溫加壓減壓法來制備含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基，首次發(fā)現(xiàn)低于50nm的納米氣泡具備抗衰老功效。其中，制備超小粒徑納米氣泡的方法是可替代的。換句話說，通過其他方法制備出的含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基，應該也具備相同的抗衰老功效。

15、根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基在延緩間充質干細胞體外復制性衰老的應用。

16、根據(jù)本發(fā)明的第四方面，還提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基在緩解細胞氧化應激中的應用。

17、根據(jù)本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，超小粒徑納米氣泡具備延緩間充質干細胞衰老的功效，因此含有該超小粒納米氣泡的超小粒徑納米氣泡細胞培養(yǎng)基也具有延緩間充質干細胞衰老的功效。根據(jù)本發(fā)明的研究還發(fā)現(xiàn)，超小粒徑納米氣泡具備緩解細胞氧化應激的功效，因此含有該超小粒納米氣泡的超小粒徑納米氣泡細胞培養(yǎng)基也具有緩解細胞氧化應激的功效。

18、鑒于化學抗氧化劑的局限性，超小粒徑納米氣泡已成為降低細胞內(nèi)ros水平的有希望的替代方案。這些納米氣泡具有獨特的特性，可直接降低細胞內(nèi)的ros，從而保護細胞內(nèi)生物大分子的穩(wěn)定性并保持細胞活力。鑒于這些優(yōu)勢，本發(fā)明制備了一種原位引入超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基，并將其用于小鼠間充質干細胞的體外擴增和培養(yǎng)。結果表明超小粒徑納米氣泡的存在顯著延緩了msc的衰老并在保持其干細胞特性的同時增加了細胞分裂次數(shù)。這表明本發(fā)明制備的含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基可以減緩msc的體外擴增導致的衰老。本發(fā)明為優(yōu)化干細胞培養(yǎng)條件提供了新的見解和方法，最終有助于再生醫(yī)學和治療應用的發(fā)展。

19、根據(jù)本發(fā)明提供的這樣一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基，與中國發(fā)明專利申請“一種小粒徑納米氣泡水及其制備方法以及應用”相比，不同之處主要包括以下幾點：

20、首先，超小粒徑納米氣泡存在的介質不同，本發(fā)明首次制備出了這樣一種原位引入超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基，截止到目前為止，現(xiàn)有技術從未公開過本發(fā)明這樣一種采用細胞培養(yǎng)基低溫加壓減壓制備含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基的方法；

21、其次，本發(fā)明還首次發(fā)現(xiàn)這樣一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基具有延緩間充質干細胞衰老以及緩解細胞氧化應激的效果；

22、再次，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基中超小粒徑納米氣泡的總濃度更高，本發(fā)明要求超小粒徑納米氣泡在細胞培養(yǎng)基中的總濃度>1011個/毫升，而在先專利申請中公開的小粒徑納米氣泡水僅要求濃度>107個/毫升。其原因在于，根據(jù)本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，如果濃度低于1011個/毫升(比如，107個/毫升～1011個/毫升之間)，可能無法產(chǎn)生延緩間充質干細胞體外復制性衰老的技術效果，參見本發(fā)明各實施例中的nnbs組。

23、根據(jù)本發(fā)明提供的一種含有超小粒徑納米氣泡的細胞培養(yǎng)基及其制備方法以及應用，其相對現(xiàn)有技術的優(yōu)越性在于：

24、1)不添加外源抗氧化劑的情況下，即可制備出一種具有抗衰老和抗氧化功效的超小粒徑納米氣泡細胞培養(yǎng)基，其中的絕大多數(shù)納米氣泡大小在10納米附近；

25、2)通過低溫冷凍后細胞培養(yǎng)基進行先加壓、后減壓，提供了一種向細胞培養(yǎng)基中原位引入超小粒徑納米氣泡的方法；

26、3)通過本發(fā)明制備的超小粒徑納米氣泡細胞培養(yǎng)基的抗衰老功效不依賴于額外添加還原劑，因此能夠避免上述化學還原劑的缺陷；

27、4)本發(fā)明提供的這樣一種超小粒徑納米氣泡細胞培養(yǎng)基的制備方法不僅可用于延緩間充質干細胞體外復制性衰老，還有望應用于生物醫(yī)學、醫(yī)療美容、健康增壽等領域。