本發(fā)明屬于免疫學(xué)和基因工程，具體涉及能夠特異性識(shí)別丙型肝炎病毒（hcv）core蛋白的人源化單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、丙型肝炎病毒（hepatitis?c?virus，hcv），感染人體后，會(huì)引起機(jī)體的急性（短期）和慢性（長期）的病毒性肝炎，主要通過血液接觸傳播，此外還可以通過性接觸、母嬰垂直等方式傳播。hcv急性感染，通常沒有癥狀，但約70%的感染者會(huì)發(fā)展為慢性hcv感染。慢性hcv感染可能會(huì)發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等嚴(yán)重的肝臟疾病。目前，暫時(shí)沒有針對(duì)hcv的疫苗，但可以使用抗病毒藥物治療hcv感染，因此，hcv?感染的及時(shí)檢測、診斷與治療，是減少?hcv?血液傳播、防治丙肝的關(guān)鍵。

2、hcv為單股正鏈?rna病毒，基因組大小約為9500~10000bp?，包含一個(gè)大的編碼開放閱讀框架，編碼了約3000個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體。該蛋白前體在細(xì)胞和病毒自身編碼的蛋白酶作用下，形成成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，即核心蛋白（core）和包膜糖蛋白（e1、e2）等結(jié)構(gòu)蛋白，p7、ns2蛋白酶、ns3-4a復(fù)合物、ns4b、ns5a和ns5b等非結(jié)構(gòu)蛋白。目前，國內(nèi)外臨床上最常用的hcv感染特異性診斷方法是抗hcv和hcv?rna檢測?？筯cv檢測因其成本低、操作簡單，更適合大規(guī)模篩查試驗(yàn)；hcv?rna檢測則對(duì)hcv的確診和指導(dǎo)hcv抗病毒治療具有重要意義。

3、抗hcv檢測，是采用基因工程技術(shù)，表達(dá)hcv基因中部分結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白作為包被抗原，來建立的檢測方法。目前，已經(jīng)研制出四代抗-hcv檢測試劑。第一代抗hcv檢測，使用ns4區(qū)編碼的重組抗原c100-3；第二代，使用了core區(qū)的c22-3重組抗原，ns3區(qū)的c33c重組抗原和ns4區(qū)的c100-3；第三代，增加了ns5區(qū)的重組抗原，并重新配置core區(qū)和ns3區(qū)的重組抗原，提高了試劑靈敏度；第四代，加入了生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem，bas），進(jìn)一步提高了試劑的靈敏度。

4、抗hcv檢測技術(shù)的發(fā)展和大規(guī)模應(yīng)用，對(duì)hcv流行病學(xué)調(diào)查、獻(xiàn)血員篩查、高危人群監(jiān)測和臨床hcv患者的診斷都有著重要的意義，更是為hcv感染的早發(fā)現(xiàn)、早治療，提供了堅(jiān)實(shí)可靠的依據(jù)，因此，為了監(jiān)測和評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)室抗hcv檢測的水平、質(zhì)量，室內(nèi)質(zhì)控品和室間質(zhì)評(píng)樣品得到大規(guī)模的應(yīng)用。而現(xiàn)有的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品、室間質(zhì)評(píng)樣品，多為臨床強(qiáng)陽性血清/血漿樣品制備而來，涉及生物安全和倫理問題，難以獲取。此外，樣品成分復(fù)雜，原料批間差異難以控制，導(dǎo)致質(zhì)控產(chǎn)品的批間質(zhì)量差異較大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)抗hcv質(zhì)控產(chǎn)品的原料來源問題，本發(fā)明的目的在于提供能特異性識(shí)別hcvcore蛋白的人源化抗hcv單克隆抗體及其作為抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品的應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供的人源化抗hcv單克隆抗體其特征在于：所述抗體能夠特異性識(shí)別hcvcore蛋白，包括輕鏈和重鏈，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列見seq?id?no.1，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列見seq?id?no.2。

3、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了針對(duì)人源化抗hcv單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

4、（1）選取hcv?core蛋白，分別免疫balb/c小鼠，得到經(jīng)過免疫處理的小鼠；

5、（2）基于步驟（1）所述免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，并通過有限稀釋法和elisa法篩選高效價(jià)的特異性單抗；

6、（3）將步驟（2）中所述單抗進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞可變區(qū)基因測序，得到基因序列，并將該基因序列與人igg1基因架構(gòu)結(jié)合，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒；

7、（4）將步驟（3）中所述真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cho-s細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并使用該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株表達(dá)、制備人源化單克隆抗體。

8、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品，采用人源化抗hcv單克隆抗體為原料，制備成均勻性好、穩(wěn)定性好、互通性好的室內(nèi)質(zhì)控品，實(shí)現(xiàn)了所述人源化單克隆抗體的初步應(yīng)用。

9、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品，包含人源化抗hcv單克隆抗體、人血清基質(zhì)、氯化鈉、蛋白保護(hù)劑、防腐劑等組分。所述人源化抗hcv單克隆抗體為特異性識(shí)別hcvcore蛋白的人源化單克隆抗體，所述防腐劑為proclin300和proclin950種的一種或兩種。

10、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品的制備方法，包括以下步驟：

11、（1）將人血清基質(zhì)放入（2~8）℃環(huán)境中，至完全溶解。再經(jīng)過60℃處理60分鐘，除菌過濾后，得到經(jīng)處理的人血清基質(zhì)。

12、（2）在攪拌的情況下，依次往步驟（1）經(jīng)過處理的人血清基質(zhì)中加入人源化抗hcv單克隆抗體、氯化鈉、蛋白保護(hù)劑和防腐劑，再使用經(jīng)過處理的人血清基質(zhì)定容至目標(biāo)配制體積，充分混合均勻，得到抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品半成品。

13、（3）使用elisa試劑盒，測定步驟（2）中的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品半成品，判斷質(zhì)控品濃度是否符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。符合標(biāo)準(zhǔn)的，即為合格的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品半成品。

14、（4）步驟（3）中，合格的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品半成品，根據(jù)需求的裝量進(jìn)行分裝，貼標(biāo)簽，得到成品的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品。質(zhì)控品在-20℃條件下保存。

15、相對(duì)于現(xiàn)有的技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下：

16、1、本發(fā)明提供了特異性識(shí)別hcv?core蛋白的人源化抗hcv單克隆抗體，并公開了所述人源化抗hcv單克隆抗體的氨基酸序列。本發(fā)明提供的人源化抗hcv單克隆抗體，特異性識(shí)別的hcv結(jié)構(gòu)蛋白，均為抗hcv檢測試劑盒常用的包被和/或標(biāo)記原料，且經(jīng)過人源化改造，還能特異性結(jié)合抗人igg抗體，兼容多種夾心法、間接法等方法學(xué)原理的商業(yè)化抗hcv免疫檢測試劑盒。此外，人源化抗hcv單克隆抗體便于放大生產(chǎn)、批間差異小、成本低廉，將其作為抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品、室間質(zhì)評(píng)樣品的材料，具有廣大的應(yīng)用前景。

17、2、本發(fā)明提供的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品，采用了人源化抗hcv單克隆抗體，可兼容多種夾心法、間接法等方法學(xué)原理的商業(yè)化抗hcv免疫檢測試劑盒，是真正的第三方質(zhì)控品。此外，抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品使用人血清基質(zhì)作為質(zhì)控基質(zhì)，與臨床樣本的基質(zhì)相近，大大提高了室內(nèi)質(zhì)控品的互通性，更能滿足各實(shí)驗(yàn)室對(duì)監(jiān)測和評(píng)價(jià)抗hcv試驗(yàn)質(zhì)量的要求。

技術(shù)特征：

1.一種人源化抗hcv單克隆抗體，其特征在于：所述抗體能夠特異性識(shí)別hcv?core蛋白，包括輕鏈和重鏈，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列見seq?id?no.1，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列見seq?id?no.2。

2.權(quán)利要求1所述的人源化抗hcv單克隆抗體，其特征在于，其制備方法，包括以下步驟：

3.一種抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品，其特征在于：含有權(quán)利要求1所述的人源化抗hcv單克隆抗體、人血清基質(zhì)、氯化鈉、蛋白保護(hù)劑、防腐劑。

4.權(quán)利要求3所述的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品，其特征在于：按濃度計(jì)，人源化抗hcv單克隆抗體含量為1.0-200?ng/ml；按重量百分比計(jì)，氯化鈉含量為0.5-1.2%，蛋白保護(hù)劑含量為0.1%-5%，防腐劑含量為0.02%-0.3%；按體積算，人血清基質(zhì)定容至目標(biāo)配制體積。

5.權(quán)利要求3或4所述的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品，其特征在于，所述防腐劑為proclin300和proclin950。

6.權(quán)利要求3或4所述的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品，其特征在于，所述質(zhì)控品為液體。

7.權(quán)利要求3或4所述的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

8.權(quán)利要求3或4所述的抗hcv室內(nèi)質(zhì)控品，其特征在于，在-20℃條件下能穩(wěn)定保存不低于2年；在（2~8）℃條件下能穩(wěn)定保存不低于1年。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種人源化抗丙型肝炎病毒（HCV）單克隆抗體，其中所述抗體命名為C00012，為特異性結(jié)合HCV?Core蛋白，所述抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列依次見SEQ?ID?NO.1，所述抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列依次見SEQ?ID?NO.2。本發(fā)明還公開了所述人源化抗HCV單克隆抗體在制備抗HCV室內(nèi)質(zhì)控品中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的人源化抗HCV單克隆抗體，能特異識(shí)別HCV的Core蛋白，且能被抗人IgG抗體結(jié)合，兼容夾心法、間接法等方法學(xué)原理的抗HCV免疫檢測試劑盒。由其制備的抗HCV室內(nèi)質(zhì)控品，均有均勻性好、穩(wěn)定性好、互通性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)抗HCV的試驗(yàn)質(zhì)量控制，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：高旭年,華文浩,李爾華,林健聰,吳淑賢,孫潔華
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州邦德盛生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6