本發(fā)明涉及海洋微生物酶領(lǐng)域，特別是涉及海洋微生物菌株y112產(chǎn)生的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化淀粉制備α-環(huán)糊精的響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

環(huán)糊精(cd)是一類環(huán)狀低聚糖。一般常見的有α-、β-和γ-環(huán)糊精，分別由6，7，8個(gè)d-吡喃葡萄糖單元，以α-1,4糖苷鍵首尾相連而成。環(huán)糊精可以包埋眾多的形狀各異和適當(dāng)大小的疏水性客體分子，進(jìn)而改變它們的穩(wěn)定性、溶解度、揮發(fā)性及化學(xué)反應(yīng)性能等理化性質(zhì)。環(huán)糊精的化學(xué)性質(zhì)均比較穩(wěn)定，α-環(huán)糊精在體內(nèi)的代謝作用最慢且無毒。環(huán)糊精在藥品、食品、化妝品、環(huán)保、工業(yè)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有良好的應(yīng)用前景，而且作為一種新型的膳食纖維逐漸走入人們的視野。

環(huán)糊精的制備主要有兩種方法：化學(xué)合成法和生物酶轉(zhuǎn)化法，化學(xué)合成法因?yàn)檫^程復(fù)雜等原因已經(jīng)被淘汰，而生物酶轉(zhuǎn)化法的主要原理是利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cgtase)作用于淀粉或者底物生成環(huán)糊精。cgtases酶能催化轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)，包括環(huán)化，耦合，歧化和水解反應(yīng)，是一種多功能酶。大多數(shù)的cgtase生成的都是多種環(huán)糊精的混合體。bharat等利用來自肺炎克雷伯菌as-22分泌的cgtase酶生產(chǎn)α-環(huán)糊精，當(dāng)cgtase作用于溶解性較好的糊精時(shí)，轉(zhuǎn)化率只能達(dá)到10.9％。duan等以15％(w/v)馬鈴薯淀粉為底物，每克底物同時(shí)加入10u的α-cgtase和48u的異淀粉酶，加入5％的環(huán)化反應(yīng)促進(jìn)劑正癸醇，溫度30℃，ph5.6，反應(yīng)24h后cd的總產(chǎn)量達(dá)到84.6％(w/w)，比單獨(dú)使用α-cgtase的轉(zhuǎn)化率提高了31.2％，其中α-cd、β-cd、γ-cd的重量比1.00：0.05：0.01，這是所知的同時(shí)使用α-cgtase和異淀粉酶轉(zhuǎn)化cd的第一份報(bào)告，也是迄今為止環(huán)糊精生產(chǎn)效率最高的報(bào)道。隨著近年來的不斷研究，cd和cgtase的應(yīng)用越來越廣泛，但高成本和低產(chǎn)量依然是制約其應(yīng)用的關(guān)鍵問題，因此繼續(xù)研究提高環(huán)糊精產(chǎn)率的方法仍具有重要的意義。本發(fā)明對(duì)來自海洋芽孢桿菌y112生產(chǎn)的α-cgtase生產(chǎn)α-環(huán)糊精的條件進(jìn)行了優(yōu)化，使得α-環(huán)糊精的產(chǎn)量達(dá)到較高水平。

發(fā)明專利“海洋α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化淀粉制備α-環(huán)糊精的方法”(專利申請?zhí)?01610959716.3)公開了α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化淀粉制備α-環(huán)糊精的方法，但所述方法中添加了有機(jī)溶劑正癸醇，而這一有機(jī)溶劑在食品應(yīng)用中存在一定的限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種海洋微生物酶法轉(zhuǎn)化淀粉生成α-環(huán)糊精響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化方法及應(yīng)用，本發(fā)明是在所述專利(專利申請?zhí)?01610959716.3)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了部分反應(yīng)條件的優(yōu)化；所述方法對(duì)淀粉比例，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，酶添加量，特別是使用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化技術(shù)進(jìn)行了條件的優(yōu)化試驗(yàn)，去掉了有機(jī)溶劑正癸醇的添加，同時(shí)保證了轉(zhuǎn)化效率。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種海洋微生物酶法轉(zhuǎn)化淀粉生成α-環(huán)糊精響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，所述方法為確定影響α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化淀粉生成α-環(huán)糊精的主要影響因子為底物濃度、溫度和ph，以此3個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，做3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)、5個(gè)中心點(diǎn)的二次回歸正交組合試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)過二次回歸擬合后，得到轉(zhuǎn)化率對(duì)底物濃度a、溫度b和phc的二次多項(xiàng)回歸方程為：y＝+28.58-0.91a+0.28b-0.83c+0.012ab+0.57ac-0.13bc-1.30a²-2.30b²-2.76c²，利用軟件分析得到最大響應(yīng)值時(shí)a、b、c對(duì)應(yīng)的值即為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

進(jìn)一步，通過上述響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化出最佳條件為：淀粉種類為馬鈴薯淀粉，淀粉濃度為5％(w/v)，海洋微生物菌株y112產(chǎn)生的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶添加量為每克淀粉200u，ph值為8.4，溫度30攝氏度，轉(zhuǎn)速每分鐘200轉(zhuǎn)，反應(yīng)6小時(shí)。該條件下α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率為28.67％。

本發(fā)明還提供一種利用上述方法進(jìn)行α-環(huán)糊精的酶法制備方法，其特征在于包括下列步驟：

⑴取濃度為5％(w/v)的馬鈴薯淀粉，加熱溶解至100ml水溶液；

⑵取步驟⑴的淀粉水溶液冷卻至30℃，調(diào)整ph為8.4后，添加海洋微生物菌株y112產(chǎn)生的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶于淀粉水溶液中，添加比例為200u/g淀粉；

⑶取步驟⑵的酶淀粉水溶液置于振蕩器進(jìn)行反應(yīng)，振蕩器轉(zhuǎn)速為每分鐘200轉(zhuǎn)，反應(yīng)時(shí)間為6小時(shí)，既得α-環(huán)糊精水溶液。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

本發(fā)明通過轉(zhuǎn)化淀粉生成α-環(huán)糊精響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，得到轉(zhuǎn)化率對(duì)底物濃度a、溫度b和phc的二次多項(xiàng)回歸方程為：y＝+28.58-0.91a+0.28b-0.83c+0.012ab+0.57ac-0.13bc-1.30a²-2.30b²-2.76c²，利用軟件分析得到最佳實(shí)驗(yàn)條件。利用所述實(shí)驗(yàn)條件對(duì)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化淀粉生成α-環(huán)糊精，獲得了較高的α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率，可以達(dá)到28.67％，所述方法去掉了有機(jī)溶劑正癸醇的應(yīng)用，且該方法工藝簡單，快速效果好，用來轉(zhuǎn)化淀粉制備α-環(huán)糊精有效、可靠、經(jīng)濟(jì)。

附圖說明

圖1底物種類對(duì)α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響；

圖2底物濃度對(duì)環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響；

圖3α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率隨著加酶量的增加的變化趨勢；

圖4不同的溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響；

圖5不同作用時(shí)間對(duì)α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響；

圖6不同ph對(duì)α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響；

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例結(jié)合附圖來對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋，但本發(fā)的保護(hù)范圍不受實(shí)施例任何形式上限制。

實(shí)施例

一種海洋微生物酶法轉(zhuǎn)化淀粉生成α-環(huán)糊精響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，具體方法如下：

⑴底物種類：取5％濃度的玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、麥芽糊精和可溶性淀粉溶液各100ml加熱溶解，待冷卻后，溫度30℃，ph值為9，加酶量200u/g淀粉，200r/min，6h取出煮沸滅活測α-cd產(chǎn)量。底物種類對(duì)α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響如附圖1所示。由圖中可以看出，可溶性淀粉的環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率最高，麥芽糊精的轉(zhuǎn)化率最低。馬鈴薯淀粉的轉(zhuǎn)化率略低于可溶性淀粉。馬鈴薯淀粉的價(jià)格比較低，使得生產(chǎn)環(huán)糊精的成本降低，因此馬鈴薯淀粉在此試驗(yàn)是適合生產(chǎn)環(huán)糊精的底物。

⑵底物濃度：分別取3％、5％、8％、10％、15％、20％濃度的馬鈴薯淀粉溶液各100ml加熱溶解，待冷卻后，溫度30℃，ph值為9，加酶量200u/g淀粉，200r/min，6h取出煮沸滅活測α-cd產(chǎn)量。底物濃度對(duì)環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響如附圖2所示。由圖可以看出當(dāng)?shù)矸蹪舛?％時(shí)，α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率為25.9％，當(dāng)?shù)矸蹪舛壬?0％時(shí)，α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率和5％時(shí)相比下降50％，兩者相差較大，繼續(xù)增大底物濃度，轉(zhuǎn)化率降低越明顯。相反底物濃度越小，環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率越高，但是成本升高，總的產(chǎn)量過低，綜合考慮，選用5％的馬鈴薯淀粉作為生產(chǎn)α-環(huán)糊精的淀粉濃度。

⑶加酶量：5％濃度的馬鈴薯淀粉溶液100ml，溫度為30℃，ph值為9，分別加入100、150、200、250、300u/g馬鈴薯淀粉的α-cgtase進(jìn)行反應(yīng)，200rpm搖床反應(yīng)6h后滅活測α-cd產(chǎn)量。在一定范圍內(nèi)，α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率隨著加酶量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，見附圖3。當(dāng)加酶量在200u/g時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高。

⑷反應(yīng)溫度：5％濃度的馬鈴薯淀粉溶液100ml、ph值為9、加酶量200u/g馬鈴薯淀粉、分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃反應(yīng)，200r/min搖床反應(yīng)6h后煮沸滅活測定α-cd產(chǎn)量。從附圖4可以看出，不同的溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響比較明顯，轉(zhuǎn)化率在30℃時(shí)最高，之后隨著溫度的繼續(xù)升高，α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率降低幅度增大。該酶的最適反應(yīng)溫度是55℃，在40℃以下穩(wěn)定，高于50℃對(duì)酶活影響較大，與試驗(yàn)結(jié)果基本保持一致，在不失活的狀態(tài)下，30℃時(shí)最有利于α-環(huán)糊精的生產(chǎn)。

⑸作用時(shí)間：5％濃度的馬鈴薯淀粉溶液100ml加熱溶解，待冷卻后，溫度為30℃，ph值為9，加酶量為200u/g馬鈴薯淀粉，200r/min，反應(yīng)分別進(jìn)行1、2、4、6、8、10、12、24h后煮沸滅活測定α-cd產(chǎn)量。由附圖5可知，α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高點(diǎn)的時(shí)間為6h，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，轉(zhuǎn)化率并沒有增高，反而有明顯的降低趨勢。隨著反應(yīng)時(shí)間的加長，酶的其他作用增強(qiáng)，造成α-環(huán)糊精的分解。另一方面，反應(yīng)時(shí)間的減少，更有利于節(jié)約成本。

⑹作用ph：5％濃度的馬鈴薯淀粉溶液100ml、溫度30℃、加酶量200u/g馬鈴薯淀粉、分別在ph值為6、7、8、9、10條件下反應(yīng)，200r/min搖床反應(yīng)6h后煮沸滅活，測定α-cd產(chǎn)量。結(jié)果(見附圖6)顯示，初始ph值為9時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，此時(shí)即為α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化的最適反應(yīng)ph。

⑺響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)，確定影響酶轉(zhuǎn)化淀粉生成α-環(huán)糊精的主要影響因子為底物濃度、溫度和ph。以此3個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素又選擇3個(gè)水平，以轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，做3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))二次回歸正交組合試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。對(duì)表1中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)過二次回歸擬合后，得到轉(zhuǎn)化率對(duì)底物濃度(a)、溫度(b)和ph(c)的二次多項(xiàng)回歸方程為：y＝+28.58-0.91a+0.28b-0.83c+0.012ab+0.57ac-0.13bc-1.30a²-2.30b²-2.76c²。

表1box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用design-expert8.06軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合(表2)，發(fā)現(xiàn)該模型是顯著的，f值為506.71表示僅有0.01％的可能是由噪音引起的，其中a、b、c、ac、a²、b²、c²的p值均小于0.05是顯著模型項(xiàng)，失擬f值為0.96(p＝0.4921)表示該模型的失擬不顯著，因此該模型是合適的。方程的r²等于0.9985，說明α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的實(shí)測值與預(yù)測值的擬合度較好，該模型能較好的解釋環(huán)糊精產(chǎn)率的變化。f值越大，表明影響因子對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。由方差分析表可得出，fa＝369.36，fc＝303.67，fb＝33.64，即各因素對(duì)產(chǎn)物制備的影響程度大小順序?yàn)榈孜餄舛?gt;ph>溫度。

表2回歸模型系數(shù)的顯著性

注：“**”表示極顯著(p<0.01)

軟件分析得到最大響應(yīng)值(產(chǎn)量)時(shí)a、b、c對(duì)應(yīng)的最佳實(shí)驗(yàn)條件為:底物濃度為4.61、溫度30.2℃、ph8.40，反應(yīng)時(shí)間6h，α-環(huán)糊精最大預(yù)測轉(zhuǎn)化率為28.84％。按照試驗(yàn)篩選出的最佳條件，為方便實(shí)驗(yàn)操作，在底物濃度5％，溫度30℃，ph8.40，加酶量200u/g，反應(yīng)6h條件下進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)際轉(zhuǎn)化率為28.67％與理論值接近。

本實(shí)施例所用到的α-cgtase酶活力的測定方法：取4g水溶性淀粉，用配制好的ph8.5的0.2mol/l的naoh-甘氨酸緩沖液100ml(現(xiàn)用現(xiàn)配)溶解并進(jìn)行加熱糊化作為底物，待其冷卻后取0.9ml液體在試管中，放入50℃水浴鍋中預(yù)熱5min，然后加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)的粗酶液0.1ml混合均勻，50℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)4min，取出迅速加入1ml鹽酸溶液(1mol/l)終止反應(yīng)，最后加入4ml稀釋4倍的甲基橙溶液，混勻，室溫靜置20min。對(duì)照組為取底物0.9ml于試管中，預(yù)熱5min。隨實(shí)驗(yàn)組一起放入水浴反應(yīng)4min后，加入1ml鹽酸溶液混合均勻后再加入與實(shí)驗(yàn)組相同的粗酶液，其它處理與實(shí)驗(yàn)組相同。最后用分光光度計(jì)在507nm下測定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光度。酶活定義為一個(gè)單位上述條件下生成1μgα-環(huán)糊精所需要的酶量。

本實(shí)施例所用到的α-環(huán)糊精含量測定方法：取一支試管，分別加入1ml梯度濃度的α-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)溶液和1ml1mol/l的鹽酸，再加入4ml稀釋4倍的甲基橙溶液于試管中，搖勻，室溫靜置20min，在507nm處測吸光度。其中，空白不含α-環(huán)糊精，其余操作相同。以環(huán)糊精濃度為橫坐標(biāo)，吸光度差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度差值(△od)＝空白溶液吸光度-樣品吸光度。將待測溶液按照上述步驟進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到α-環(huán)糊精的濃度，然后得出α-環(huán)糊精的含量值。