本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用及煙用香料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種利用微生物新種——洞穴動(dòng)球菌與特色植物原料——螃蟹腳共同發(fā)酵制備得到的煙用香料。同時(shí)，本發(fā)明還涉及所述的煙用香料在卷煙生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微生物種類豐富，長(zhǎng)期以來(lái)，人們利用純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行調(diào)查研究和開(kāi)發(fā)利用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微生物資源在科技研究及生物產(chǎn)業(yè)中的重要性日益凸顯。世界上許多國(guó)家都在搜集、保存各種微生物資源，其不斷豐富將為生物技術(shù)的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是有效提升卷煙抽吸品質(zhì)，形成卷煙特有風(fēng)格的有效手段之一。目前我國(guó)煙草中添加的煙用香料大多是采用傳統(tǒng)方法萃取再加以調(diào)配所得，雖然生產(chǎn)操作簡(jiǎn)單，但也存在香氣單調(diào)、改善卷煙抽吸效果不明顯等缺點(diǎn)。利用微生物對(duì)香原料進(jìn)行發(fā)酵，可以增加傳統(tǒng)提取香料中多種香氣物質(zhì)的含量，提升香氣豐富性。而現(xiàn)有工業(yè)產(chǎn)香微生物存在種類固化，發(fā)酵香料類型有限等問(wèn)題，迫切需要尋找并篩選新的能夠發(fā)酵產(chǎn)生特殊香氣的微生物菌株，以拓展煙用香料的豐富性，滿足卷煙生產(chǎn)需求。

“螃蟹腳”是一種寄生在樹(shù)齡較高的古喬木茶樹(shù)上的寄生物。綠色，曬干后為棕黃色，形狀像小珊瑚，因寄生枝桿節(jié)狀，帶毫，形如蟹腳，故此被當(dāng)?shù)厝朔Q為“螃蟹腳”?！绑π纺_”，拉丁文名：viscumliquidambaricolumhayata，桑寄生科、槲寄生屬植物。別名有螃蟹角、螃蟹夾、寄生包、楓葉寄生、風(fēng)飯寄生、路路通寄生、百子痰梗等，是云南民間常用的止咳祛痰藥。

國(guó)內(nèi)外煙草工作者在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)煙用香料方面已經(jīng)做了很多工作，但多限于產(chǎn)香酵母。本發(fā)明提供的洞穴動(dòng)球菌為首次被分離得到，經(jīng)鑒定為微生物新種，目前未有任何關(guān)于所述洞穴動(dòng)球菌及相關(guān)應(yīng)用的公開(kāi)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用微生物發(fā)酵螃蟹腳制備得到的煙用香料。

本發(fā)明的目的還在于提供所述的煙用香料在卷煙生產(chǎn)中的具體應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

一種利用微生物發(fā)酵螃蟹腳制備的煙用香料：以螃蟹腳為原料，用洞穴動(dòng)球菌(kineococcuscavernaesp).sysuzl-1進(jìn)行發(fā)酵，再由發(fā)酵液中提取致香成分即得產(chǎn)品；所述的洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2016年12月9日,保藏編號(hào)cctccm2016738。

所述的洞穴動(dòng)球菌(kineococcuscavernaesp)sysuzl-1，于煙田相鄰近的喀斯特洞穴土壤中分離得到，可在含有簡(jiǎn)單碳氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)生揮發(fā)性特殊香味氣息。經(jīng)過(guò)微生物學(xué)特性分析和16srrna基因序列分析表明該菌株是一種新的細(xì)菌。該菌株能夠產(chǎn)生苯甲醛及土味素、欖香烯、欖香醇、a-桉葉醇等幾類主要揮發(fā)性化合物。其中，苯甲醛具有香味氣息，微生物中較常見(jiàn)，但產(chǎn)量不高；土味素為放線菌產(chǎn)生的常見(jiàn)化合物，本身有腥味。欖香烯具有抑制癌細(xì)胞的作用，是目前一類上市抗癌藥中的主要成分，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，特別是微生物自主代謝產(chǎn)生。欖香醇常用作香精原料。桉葉醇本身具有一定香味，且可做定香劑來(lái)使用。利用該菌株發(fā)酵，能夠得到特殊香氣的煙用香料，此外，該菌株還具有開(kāi)發(fā)新型、高效、無(wú)毒天然藥物的巨大潛力。

所述的利用微生物發(fā)酵螃蟹腳制備的煙用香料，具體通過(guò)以下方法得到：

(1)斜面培養(yǎng)：接種洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1于斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間7d；所述的斜面培養(yǎng)基為：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸鈉0.3g，磷酸氫二鉀0.3g，硫酸鎂0.05g，瓊脂15g和蒸餾水1000ml，調(diào)ph值7.2；

(2)種子培養(yǎng)：從斜面挑取菌絲體接入種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)溫度28℃，得活化菌液；所述的種子培養(yǎng)基為：糊精120g，大豆粉40g，酵母膏2g，色氨酸0.5g，β-丙氨酸5g，硫酸鎂0.5g，磷酸銨0.2g和蒸餾水1000ml，調(diào)ph值7.2；

(3)發(fā)酵：將螃蟹腳粉碎后加入兩倍重量的水，混合均勻，按螃蟹腳重量的5％～20％接種洞穴動(dòng)球菌活化菌液，振蕩培養(yǎng)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間24～48h；

(4)香料提?。喝〔襟E(3)所得發(fā)酵液回流提取3h，過(guò)濾除渣，取上清液，50℃減壓濃縮成浸膏，即得所需煙用香料。

所述的煙用香料在卷煙生產(chǎn)中的應(yīng)用，具體為：將所得煙用香料稀釋后均勻地噴灑在煙絲上，煙用香料的添加量為煙絲重量的0.2％～0.6％。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明首次將洞穴動(dòng)球菌應(yīng)用于煙用香料制備領(lǐng)域。所述的洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1為微生物新種，該菌株和螃蟹腳共同發(fā)酵后與未處理對(duì)照相比，在保持原有螃蟹腳特征氣息的同時(shí)，增加了特殊酸香，生津效果明顯。

(2)本發(fā)明成本低廉，操作簡(jiǎn)單，便于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用前景良好。

保藏生物材料的說(shuō)明

本發(fā)明的菌株，已于2016年12月9日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，該中心地址：中國(guó)湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)，該菌株分類命名為：洞穴動(dòng)球菌(kineococcuscavernaesp)sysuzl-1，保藏編號(hào)cctccno：m2016738。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但實(shí)施例并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的限定。

實(shí)施例1

1、洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1菌株培養(yǎng)

(1)斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)基：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸鈉0.3g；磷酸氫二鉀0.3g；硫酸鎂0.05g；瓊脂15g；蒸餾水1000ml，ph7.2；取洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1接種于斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為7d。

(2)種子培養(yǎng)：從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28℃，得活化菌液。種子培養(yǎng)基：糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，ph7.2。

2、洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1菌株發(fā)酵制備煙用香料

將螃蟹腳粉碎后加入兩倍重量的水，混合均勻，接種洞穴動(dòng)球菌活化菌液，振蕩培養(yǎng)進(jìn)行發(fā)酵，接種量為螃蟹腳重量的15％，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間36h。

3、香料提取

將上述發(fā)酵液回流提取3h，過(guò)濾除渣，取上清液，50℃減壓濃縮至浸膏狀，即得所需煙用香料。為防止變質(zhì)，按發(fā)酵香料重量的5％添加丙二醇。

4、產(chǎn)品特征及理化性質(zhì)

所得發(fā)酵煙用香料為黃褐色液體，不澄清。產(chǎn)品理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1發(fā)酵香料的理化指標(biāo)

5、卷煙加香實(shí)驗(yàn)

取發(fā)酵煙用香料0.1g，稀釋50倍后，均勻噴灑在50g未加香葉組中，裝入干凈的密封袋內(nèi)，于室溫下放置2h后，將煙絲于120℃烘箱中烘干，使水分含量達(dá)到11％-13％。將處理后的煙絲及對(duì)照放入恒溫恒濕箱中，在溫度22℃、濕度60％條件下平衡24h，手工卷制成卷煙，由評(píng)吸專家組成的評(píng)吸小組進(jìn)行感官評(píng)吸。以未發(fā)酵螃蟹腳提取物及枯草芽孢桿菌發(fā)酵螃蟹腳香料為對(duì)照。加香結(jié)果表明，螃蟹腳洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1發(fā)酵香料與對(duì)照區(qū)別明顯，在原有螃蟹腳特征氣息保持的同時(shí)，增加了特殊酸香，生津效果明顯。評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2螃蟹腳發(fā)酵香料評(píng)吸結(jié)果

實(shí)施例2

重復(fù)實(shí)施1，有以下不同點(diǎn)：洞穴動(dòng)球菌活化菌液添加量為螃蟹腳重量的5％，發(fā)酵時(shí)間24h。

1、產(chǎn)品特征及理化性質(zhì)

所得發(fā)酵煙用香料為黃褐色液體，不澄清。產(chǎn)品理化性質(zhì)見(jiàn)表3。

表3洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1發(fā)酵螃蟹腳香料的理化指標(biāo)

2、卷煙加香實(shí)驗(yàn)

取發(fā)酵煙用香料0.2g，稀釋50倍后，均勻噴灑在50g未加香葉組中。

加香結(jié)果表明，螃蟹腳洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1發(fā)酵香料與對(duì)照區(qū)別明顯，具有豐富香氣，生津作用。評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4螃蟹腳發(fā)酵香料評(píng)吸結(jié)果

實(shí)施例3

重復(fù)實(shí)施1，有以下不同點(diǎn)：洞穴動(dòng)球菌活化菌液添加量為螃蟹腳重量的20％，發(fā)酵時(shí)間48h。

1、產(chǎn)品特征及理化性質(zhì)

所得發(fā)酵煙用香料為黃褐色液體，不澄清。產(chǎn)品理化性質(zhì)見(jiàn)表5。

表5洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1發(fā)酵螃蟹腳香料的理化指標(biāo)

2、卷煙加香實(shí)驗(yàn)

取發(fā)酵煙用香料0.3g，稀釋50倍后，均勻噴灑在50g未加香葉組中。

加香結(jié)果表明，螃蟹腳洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1發(fā)酵香料與對(duì)照區(qū)別明顯，酸香突出，具有特殊的香氣。評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6螃蟹腳發(fā)酵香料評(píng)吸結(jié)果