本發(fā)明涉及藥物化學(xué)和藥物治療學(xué)領(lǐng)域，涉及一種no供體型齊墩果酸衍生物，具體涉及一種no供體舒張血管同cddo-me抑制血管重構(gòu)的聯(lián)合用藥策略、合成及抗肺動脈高壓活性評價。該類化合物可用于肺血管阻力增大而導(dǎo)致的肺動脈壓力升高。本發(fā)明還涉及這類化合物的制備方法以及含有它們的藥物組合。

背景技術(shù)：

肺動脈高壓(pulmonaryarterialhypertension，pah)是一類肺血管阻力增大，肺動脈壓力升高，最終導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡的惡性進展性疾病。近年來，隨著對pah發(fā)病機制的深入研究和相應(yīng)的治療藥物上市，pah患者的平均生存時間已由上世紀80年代的2.8年延長到現(xiàn)在的6.7年。但到目前為止pah的治療仍未取得突破性進展，較高的發(fā)病率和死亡率使其具有“心血管系統(tǒng)的惡性腫瘤”之稱，嚴重危害人類的生命和健康。

齊墩果酸(oleanolicacid，oa)及其衍生物是一類重要的五環(huán)三萜化合物，具有抗炎、抗腫瘤和抗病毒等多種生物活性。通過對oa進行結(jié)構(gòu)改造，合成了a環(huán)含α-氰基-α，β-不飽和酮(α-cyano-α，β-unsaturatedketone，cuk)的衍生物cddo、cddo-me以及cddo-im。

化合物cddo-me顯示了極強的生物活性，是一個半合成的齊墩果酸衍生物。臨床前研究發(fā)現(xiàn)，它通過抑制nf-κb通路不僅降低et-1的分泌以及eta受體表達而舒張血管，而且可促進肺動脈平滑肌細胞的凋亡，產(chǎn)生抑制肺動脈重構(gòu)的作用；更重要的是，cddo-me是nrf2的誘導(dǎo)劑，具有強效的抗炎、抗氧化作用，改善代謝紊亂，抑制血管增生，防止肺動脈血管重構(gòu)。美國reatapharmaceuticals公司近期已完成了cddo-me治療肺動脈高壓的ii期臨床研究?？诜ddo-me(2.5-10mg/天)能明顯改善pah病人癥狀。與安慰劑組相比，6mwd(6分鐘步行距離，用于臨床評價pah病人心肺功能的經(jīng)典方法)平均增加了21.4米；此外，cddo-me在臨床試驗中顯示了良好的耐受性，未見其治療糖尿病腎病iii期臨床試驗中出現(xiàn)的體液潴留及其它不良反應(yīng)。α，β-不飽和酮是許多活性天然產(chǎn)物和化學(xué)合成小分子中的藥效團，可以作為邁克爾受體與體內(nèi)多種生物大分子親核性基團(如半胱氨酸殘基的巰基)發(fā)生加成反應(yīng)，通過共價結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)眾多信號通路，發(fā)揮及其廣泛的生物學(xué)活性及疾病治療作用。研究表明，cddo-me通過激活are-nrf2-keap1信號通路產(chǎn)生抗炎活性，究其分子機理，主要是cddo-me的a環(huán)α-氰基-α，β-不飽和酮(α-cyano-α，β-unsaturatedketone，cuk)與keap1蛋白btb區(qū)域151位cys的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)所致。

藥理研究表明，cddo及其衍生物在pm-nm濃度下，抑制炎癥因子，保護正常細胞；在100-300nm濃度下，促進前癌/癌細胞分化，抑制腫瘤細胞生長；在0.02-2μm濃度下，抑制腫瘤細胞增殖；在1-5μm濃度下，能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，對正常細胞無顯著影響。cddo及其衍生物通過激活nrf2-are通路，對許多由炎癥和氧化應(yīng)激導(dǎo)致的疾病具有保護作用，主要包括腫瘤、阿爾茲海默病(alzheimer'sdisease，ad)、帕金森病(parkinson'sdisease，pd)、慢性梗阻性疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，copd)、哮喘、糖尿病及其并發(fā)癥、多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis，ms)、骨關(guān)節(jié)炎以及類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，ra)等。此外，這類化合物還對吸煙，紫外線，缺血再灌注等多種原因?qū)е碌难鄄繐p傷具有保護作用。除了這些涵蓋了主要臟器的慢/急性疾病，cddo及其衍生物還對輻射和化學(xué)試劑造成的傷害具有保護作用，同時還對免疫和代謝系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用。

以cddo為先導(dǎo)化合物，對其c28位羧基進行修飾，發(fā)現(xiàn)衍生物cddo-im抗炎活性比cddo和cddo-me提高了幾十乃至上百倍，化合物的臨床試驗主要針對胰腺癌、白血病、黑色素瘤等腫瘤疾病，以及ii型糖尿病并發(fā)的慢性腎病、吸煙引起的慢性炎癥疾病等。

no氣體也廣泛用于pah的治療。吸入的no從肺泡彌散至肺動脈平滑肌細胞，產(chǎn)生血管舒張作用，剩余的no可入血被血紅蛋白(hb)快速清除。因此，吸入no的優(yōu)勢在于其血管舒張活性很大程度上被限制在肺部。no吸入法已被美國fda以及歐洲藥品管理局批準用于臨床治療新生兒持續(xù)肺動脈高壓(ppnh)。此外，no吸入法也可用于穩(wěn)定心臟手術(shù)后的病人，治療急性呼吸衰竭和慢性pah等。但吸入no存在一些缺陷，限制了其廣泛應(yīng)用。例如，no起效快，清除率也快，需要多次吸入；過量的no入血后可和血紅蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥。與直接吸入no氣體不同，霧化吸入的no供體藥物能夠?qū)崿F(xiàn)緩慢、平穩(wěn)地釋放no，使降低肺動脈壓的作用更為持久，不易產(chǎn)生毒副作用。擴血管藥物在過去pah治療中發(fā)揮了主導(dǎo)作用，而近年來抑制肺動脈血管重構(gòu)研究加深了對pah發(fā)病機制的理解，并研發(fā)了一些相關(guān)藥物進入臨床研究。

有鑒于此，本發(fā)明提出具有舒張肺動脈血管和抑制肺血管重構(gòu)雙重作用的藥物比單一作用的藥物具有更好的pah治療效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

目的：本發(fā)明提供一種no供體型齊墩果酸衍生物及其制備方法和用途，舒張血管和抑制血管重構(gòu)的聯(lián)合用藥設(shè)計、合成及抗肺動脈高壓活性評價。藥理實驗證明，該類化合物具有良好的抗肺動脈高壓活性，因此，它們可用于預(yù)防和治療肺動脈高壓病。

技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明公開了一種no供體型齊墩果酸衍生物，其特征在于：通式i所示的化合物或其旋光異構(gòu)體，對映體、非對映體、外消旋體或外消旋混合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯：

其中：

r代表氫原子或c1-c10直鏈或支鏈烷基；

式i中標明的五個手性中心(分別用*1、*2、*3、*4和*5表示)為r構(gòu)型或s構(gòu)型。

進一步地，通式1所示的化合物，其特征在于：

r代表甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丁基、苯基、芐基；

式i中手性中心*1為s構(gòu)型，手性中心*2為r構(gòu)型，手性中心*3為s構(gòu)型，手性中心*4為s構(gòu)型，手性中心*5為r構(gòu)型；

具體來說，通式i所示化合物優(yōu)選自下列化合物：

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-乙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-羧酸甲酯(化合物編號：i1):

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-乙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-羧酸(化合物編號：i2):

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-丙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-羧酸(化合物編號：i3)

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-乙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-酰基咪唑(化合物編號：i4):

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-丙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-酰基咪唑(化合物編號：i5)

下面藥理實驗中化合物的代號等同于此處代號所對應(yīng)的化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明通式i所述化合物的制備方法，其特征為在于，包括如下步驟：

cddo-me經(jīng)dmf/堿處理，與單硝酸異山梨酯ii反應(yīng)得到烯醇化合物iii，烯醇iii與化合物iv反應(yīng)得到目標化合物i；合成路線如下：

作為優(yōu)選方案，所述通式i化合物的制備方法，

從化合物ii制備化合物iv的反應(yīng)中，溶劑選自無水乙腈，無水二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，重蒸丙酮，無水四氫呋喃，無水n,n-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或二氧六環(huán)中的一種或多種；堿選自碳酸鉀，碳酸鈉，碳酸氫鈉，氫氧化鈉，氫氧化鉀，吡啶，4-甲氨基吡啶，三乙胺，n,n-二異丙基甲胺；反應(yīng)溫度為-20℃至加熱回流；

從化合物iv制備化合物i的反應(yīng)中，溶劑選自無水乙腈，無水二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，重蒸丙酮，無水四氫呋喃，無水n,n-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或二氧六環(huán)中的一種或多種；堿選自碳酸鉀，碳酸鈉，碳酸氫鈉，氫氧化鈉，氫氧化鉀，吡啶，4-甲氨基吡啶，三乙胺，n,n-二異丙基甲胺；反應(yīng)溫度為-20℃至加熱回流。

作為更優(yōu)選，所述通式i化合物的制備方法，

從化合物ii制備化合物iv的反應(yīng)中，溶劑選擇無水n,n-二甲基甲酰胺，堿選擇碳酸鉀，反應(yīng)溫度為室溫；

從化合物iv制備化合物i的反應(yīng)中，溶劑選擇無水n,n-二甲基甲酰胺，堿選擇碳酸鉀，反應(yīng)溫度為室溫。

這些化合物可按照常規(guī)分離技術(shù)加以純化。

本發(fā)明的再一目的是提供本發(fā)明化合物i在制備預(yù)防或治療肺動脈高壓病中的應(yīng)用。

本文采用聯(lián)合用藥策略，通過霧化吸入給藥使其分布在肺部，在肺部賴氨酰氧化酶(lox)或酯酶作用下釋放cddo-me和適量no，舒張肺動脈血管，同時抑制nf-κb通路和激活nrf2通路，產(chǎn)生抗炎、抗氧化以及抑制肺動脈血管重構(gòu)的作用，達到聯(lián)合用藥的目的。

有益效果：本發(fā)明提供no供體型齊墩果酸衍生物聯(lián)合治療已成功應(yīng)用于高血壓，例如pah這種高度復(fù)雜且進行性進展的疾病，沒有一種單一藥物一直被證明是有效的。為此，幾種臨床試驗結(jié)合起來，已經(jīng)顯示出增加的功效和改善的結(jié)果。本發(fā)明設(shè)計、合成了no供體型齊墩果酸衍生物，一種新一代的一氧化氮供體和二氫睪酮甲基化合物，被證明可以分解成肺組織中的cddo類化合物和no氣體，產(chǎn)生雙重抗炎，預(yù)防氧化應(yīng)激和擴張肺血管的作用。含有目標化合物的藥用組合物以及它們的醫(yī)藥用途，特別是在預(yù)防和治療肺動脈高壓相關(guān)的疾病中，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：(a)為血清饑餓模型；(b)為缺氧的血清饑餓模型；

圖2：cddo-no以及cddo-me對pasmcs增殖的抑制作用

圖3：為平均肺動脈壓的變化情況；

圖4：為右心室收縮壓的變化情況；

圖5：為右心肥厚指數(shù)的變化情況；

圖6：為he染色的肺部纖維組織圖片以及肺動脈內(nèi)側(cè)厚度(pamt)(a)為he染色的肺部纖維組織圖片；(b)肺動脈內(nèi)側(cè)厚度。

具體實施方式

為了進一步闡明本發(fā)明，下面給出一系列實施例，這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明具體描述，不應(yīng)當理解為對本發(fā)明的限制。

本發(fā)明化合物i抗肺動脈高壓的藥理實驗方法與結(jié)果如下：

cddo類化合物對paec損傷具有保護作用

研究了i1對肺動脈內(nèi)皮細胞(paec)損傷的保護作用。如圖1a所示，在血清饑餓模型中，發(fā)現(xiàn)i1濃度在≤0.5μm濃度時對血清饑餓誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用。i1在≤0.25μm時，保護作用與藥物濃度呈正相關(guān)，并在24h時保護作用最明顯。在乏氧模型中(圖1b)，i1在≤0.125μm濃度時對乏氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷細胞具有保護作用，保護作用與藥物濃度呈正相關(guān)。

cddo類化合物體外對pasmc增殖具有明顯抑制作用

研究了化合物對人肺動脈平滑肌細胞(pasmc)增殖的影響。發(fā)現(xiàn)i1與cddo-me在>0.75μm濃度下，在24h和48h均能顯著抑制pasmc的增殖(圖2)。

cddo類化合物體內(nèi)抗肺動脈高壓活性

實驗方法：采用雄性sprague-dawley(sd)大鼠(重量在200-250g之間)，mct按60mg/kg劑量腹腔內(nèi)一次性注射(模型組)，同時設(shè)立mct的媒介(溶媒組)，及不注射任何溶劑作為空白對照組(空白組)。造模期間，間隔一日記錄大鼠體重及死亡情況。i1按低、中、高三個劑量組經(jīng)霧化吸入給藥，體重在250-400g之間的sd大鼠清醒狀態(tài)下放入scireq專用口鼻暴露限制裝置桶內(nèi)，大鼠可以自由呼吸。藥物通過超聲霧化器霧化給予，大鼠僅口鼻暴露于霧化藥物中。超聲霧化器霧化效率調(diào)整為60％，霧化流速調(diào)整為每分鐘2l，藥物霧化前使用雙蒸水稀釋至總體積為1ml，霧化時間15分鐘。霧化給藥濃度計算公式如下：霧化給藥濃度＝藥物母濃度×藥物稀釋前體積/(2l×15min)，動物吸入肺內(nèi)藥物劑量＝動物分鐘通氣量×15min×霧化給藥濃度。對照組為cddo-me口服組，cddo-me霧化組，no供體片段霧化組，cddo-me口服+no供體片段霧化聯(lián)合用藥組，以及cddo-me霧化+no供體片段霧化聯(lián)合用藥組。此外，還利用現(xiàn)有治療pah的一線藥物如萬他維等(吸入)作為陽性對照藥。檢測各個給藥組的急性效應(yīng)和慢性效應(yīng)，前者主要指急性血流動力學(xué)檢測，包括平均肺動脈壓(mpap)、右心室收縮壓力(rvsp)、心輸出量、肺血管阻力(pvr)和心率等指標。后者主要指給藥后對肺動脈、心肺組織結(jié)構(gòu)的影響，包括測定右心室與左心室+室間隔重量比(rv/lv+s，反應(yīng)右心室肥厚程度)。

應(yīng)用2％戊巴比妥鈉，按50mg/kg體重給藥，使大鼠充分麻醉。分離右側(cè)頸外靜脈，插入充滿肝素生理鹽水的微型導(dǎo)管(pe10，bectondickinson，usa)，在壓力波形的引導(dǎo)下，經(jīng)右側(cè)頸外靜脈、右心房、右心室至肺動脈，導(dǎo)管的另一端與壓力傳感器(tsd104a血壓換能器，biopacsystems，usa)相連接，應(yīng)用16通道生理信號記錄分析系統(tǒng)(mp100，biopacsystems，usa)測定右心室收縮壓(rvsp)(圖3)及肺動脈壓力，并計算肺動脈平均壓(mpap)(圖4)。完成mpap和rvsp測定后處死大鼠，留取血標本，分離右肺固定、制作石蠟切片待后續(xù)組織病理檢查。分離左肺放入液氮中快速冷凍后放置-80℃冰箱待后續(xù)實驗使用。將心臟取下，分離右心室(rightventricular，rv)和左心室和室間隔(leftventricular+septum，lv+s)，計算i1和各對照組的右心肥厚指數(shù)(rv/lv+s)(圖5)。

cddo類化合物改善mct誘導(dǎo)的肺血管重構(gòu)(pvr)

肺動脈血管重構(gòu)(pvr)是肺動脈高壓的主要標志，其呈現(xiàn)肺動脈壁厚度的增加，肺部組織異常肌肉化和纖維化。與對照組比較，mct誘導(dǎo)的pah大鼠其肺動脈壁平均厚度明顯增加(圖6a)(p<0.01)。值得注意的是，cddo-no可顯著減輕肺動脈高壓大鼠肺中的血管周圍纖維化以及異常肌肉化(圖6a)(p<0.01)；類似地，cddo-no也能減少肺動脈高壓(pah)中的肺動脈平均厚度(pamt)(圖6b)(p<0.01)?？偠灾?，cddo-no在體內(nèi)明顯改善mct誘導(dǎo)的肺動脈高壓(pah)中的肺動脈血管重構(gòu)。

以上藥理學(xué)數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明涉及的一種有關(guān)no供體化合物舒張血管和cddo類化合物抑制肺血管重構(gòu)的重組化合物i能夠發(fā)揮顯著的抗肺動脈高壓作用，通過一系列體內(nèi)體外的實驗表明其效果比同等條件下其他對照組的效果都顯著。

實施例1

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-乙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-羧酸甲酯

將cddo-me(100mg,0.2mmol)溶解于2.5ml的無水dmf中，加入單硝酸異山梨酯(57.3mg,0.3mmol)，k2co3(41mg,0.3mmol)室溫攪拌過夜，第二天早上加入化合物v(23.6mg,0.3mmol)繼續(xù)攪拌6h，反應(yīng)液加入適量二氯甲烷(50ml)稀釋，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水各洗滌3次。有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得白色固體，經(jīng)快速硅膠柱層析制得白色固體i1(35mg,35％)。

mp:247-248℃；1hnmr(300mhz,cdcl3,25℃,tms):δ5.84(s,1h),4.69(s,1h),4.53(s,1h),4.21(d,j＝10.2hz,2h),4.05(q,2h),3.86(d,j＝4.8hz,2h),3.61(s,3h),2.97(d,j＝13.5hz,1h),2.85(s,1h),2.25(s,3h),2.00(d,j＝18.3hz,3h),1.80(d,j＝13.2hz,3h),1.45(m,10h),1.26,1.21,1.19,1.14,1.05,0.97,0.86(s,each3h)ppm；13cnmr(cdcl3,25℃,tms):δ198.7,177.8,170.7,170.6,169.9,166.6,124.4,116.1,100.8,86.8,82.5,81,80.8,80.4,78.6,72.8,68.2,59.5,51.3,49.3,46.8,45.0,43.8,41.3,39.5,35.3,34.0,32.7,32.3,31.0,30.2,30.0,29.7,29.1,27.9,26.8,23.4,22.9ppm；eims(70ev)m/z:739.5[m+h]⁺,761.5[m+na]⁺；hrms(m/z):[m+na]⁺calculatedc40h54n2o11761.3728found:761.3637,ppmerror5.0.

實施例2

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-乙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-羧酸

將cddo(100mg,0.2mmol)溶解于2.5ml的無水dmf中，加入單硝酸異山梨酯(57.3mg,0.3mmol)，k2co3(41mg,0.3mmol)室溫攪拌過夜，第二天早上加入化合物v(23.6mg,0.3mmol)繼續(xù)攪拌6h，反應(yīng)液加入適量二氯甲烷(50ml)稀釋，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水各洗滌3次。有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得白色固體，經(jīng)快速硅膠柱層析制得白色固體i2(35mg,35％)。

實施例3

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-丙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-羧酸

將cddo(100mg,0.2mmol)溶解于2.5ml的無水dmf中，加入單硝酸異山梨酯(57.3mg,0.3mmol)，k2co3(41mg,0.3mmol)室溫攪拌過夜，第二天早上加入化合物v(27.8mg,0.3mmol)繼續(xù)攪拌6h，反應(yīng)液加入適量二氯甲烷(50ml)稀釋，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水各洗滌3次。有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得白色固體，經(jīng)快速硅膠柱層析制得白色固體i3(35mg,35％)。

實施例4

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-乙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-酰基咪唑

將cddo-im(100mg,0.2mmol)溶解于2.5ml的無水dmf中，加入單硝酸異山梨酯(57.3mg,0.3mmol)，k2co3(41mg,0.3mmol)室溫攪拌過夜，第二天早上加入化合物v(23.6mg,0.3mmol)繼續(xù)攪拌6h，反應(yīng)液加入適量二氯甲烷(50ml)稀釋，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水各洗滌3次。有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得白色固體，經(jīng)快速硅膠柱層析制得白色固體i4(35mg,35％)。

實施例5

1-單硝酸異山梨酯-2-氰基-3-丙酰氧基-12-氧代齊墩果烷-2(3),9(11)-雙烯-28-?；溥?/p>

將cddo-im(100mg,0.2mmol)溶解于2.5ml的無水dmf中，加入單硝酸異山梨酯(57.3mg,0.3mmol)，k2co3(41mg,0.3mmol)室溫攪拌過夜，第二天早上加入化合物v(27.8mg,0.3mmol)繼續(xù)攪拌6h，反應(yīng)液加入適量二氯甲烷(50ml)稀釋，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水各洗滌3次。有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得白色固體，經(jīng)快速硅膠柱層析制得白色固體i5(35mg,35％)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。