技術(shù)領(lǐng)域：
：：本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及具有pin1抑制活性的18β-甘草次酸衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽，該類衍生物的制備方法，以該衍生物為活性成分的藥物組合物，以及在制備pin1抑制劑，用于制備治療和/或預(yù)防各種癌癥的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：：：惡性腫瘤嚴重危害人類健康，其發(fā)病率和死亡率不斷上升。在眾多的癌癥治療手段中，化學(xué)治療仍是目前治療腫瘤的有效方法之一。傳統(tǒng)化療藥物已遠遠不能滿足臨床需要。近幾年抗腫瘤靶向藥物的研究取得了突破性的進展，減輕了癌癥患者在疾病治療過程中的痛苦。蛋白質(zhì)中絲/蘇氨酸-脯氨酸(ser/thr-pro)序列的磷酸化是一個非常重要的信號傳導(dǎo)機制，它可以調(diào)控正常細胞的增殖與分化及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。pin1(proteininteractionwithnima1)是一種新的肽脯氨酰異構(gòu)酶，通過參與多條致癌信號通路，調(diào)控細胞周期蛋白的表達。大量分子生物學(xué)研究表明，pin1是一個潛在抗腫瘤藥物靶標。本發(fā)明人設(shè)計并合成了一系列18β-甘草次酸衍生物，經(jīng)細胞水平和分子水平活性評價，所合成的化合物具有較好的pin1酶抑制活性以及抗腫瘤細胞增殖活性。技術(shù)實現(xiàn)要素：：本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供18β-甘草次酸衍生物及其制備方法，及其作為pin1抑制劑在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及通式ⅰ所示的衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽：其中r為c1-c4的飽和及不飽和脂肪酸，5-6元芳環(huán)羧酸，5-6元芳雜環(huán)羧酸，所述芳雜環(huán)羧酸含有1-3個n、o或s原子；x為c＝o，ch2，ch；y為ch，c＝o；n為1～4的整數(shù)。優(yōu)選為：其中，r為丙酸，丙烯酸，苯甲酸，噻唑-4-羧酸；x為c＝o，ch2，ch；y為ch，c＝o；n為1～4的整數(shù)。進一步優(yōu)選為：其中，r為丙酸，丙烯酸，苯甲酸，噻唑-4-羧酸；x為c＝o，ch2，ch；y為ch；n為1～4的整數(shù)。進一步優(yōu)選為：其中，r為丙酸；當x為c＝o時，y為ch；當x為ch2時，y為ch；當x為ch2時，y為c＝o；當x為ch時，y為c＝o；當x為ch時，y為ch；n為1～4的整數(shù)。更進一步優(yōu)選為：其中，r為丙酸；當x為c＝o時，y為ch；當x為ch2時，y為ch；當x為ch2時，y為c＝o；當x為ch時，y為c＝o；當x為ch時，y為ch；n為1～2的整數(shù)。特別優(yōu)選的化合物包括：3-(1-(2-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸3-(1-(2-((18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸3-(1-(2-((12-氧代-18β-齊墩果烷-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸3-(1-(2-((12-氧代-18β-齊墩果烷-9(11)-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸3-(1-(2-((18β-齊墩果烷-9(11),12-二烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸3-(1-(3-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸3-(1-(3-((18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸3-(1-(3-((12-氧代-18β-齊墩果烷-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸3-(1-(3-((12-氧代-18β-齊墩果烷-9(11)-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸3-(1-(3-((18β-齊墩果烷-9(11),12-二烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸4-(1-(2-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)苯甲酸(e)-3-(1-(2-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙烯酸2-(1-(2-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)噻唑-4-羧酸除非另外指出，本發(fā)明所用的術(shù)語“脂肪酸”是指直鏈或支鏈的脂肪酸。本發(fā)明包括藥物組合物，該組合物含有通式(i)或(ii)的18β-甘草次酸衍生物，及其藥物上可接受的賦型劑。所述藥物上可接受的賦型劑是指任何可用于藥物領(lǐng)域的稀釋劑、輔助劑和/或載體。本發(fā)明的衍生物可以與其他活性成分組合使用，只要它們不產(chǎn)生其他不利的作用，例如過敏反應(yīng)。本發(fā)明的藥物組合物可配制成若干種劑型，其中含有藥物領(lǐng)域中常用的一些賦型劑，例如，口服制劑(如片劑，膠囊劑，溶液或混懸液)；可注射的制劑(如可注射的溶液或混懸液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制劑(例如軟膏或溶液)。用于本發(fā)明藥物組合物的載體是藥物領(lǐng)域中可得到的常見類型，包括：口服制劑用的粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、色素、矯味劑等；可注射制劑用的防腐劑、加溶劑、穩(wěn)定劑等；局部制劑用的基質(zhì)、稀釋劑、潤滑劑、防腐劑等。藥物制劑可以經(jīng)口服或胃腸外方式(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或局部)給藥，如果某些藥物在胃部條件下是不穩(wěn)定的，可將其配制成腸衣片劑。通過體外抑酶試驗篩選，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明衍生物可抑制pin1酶活力，因此，本發(fā)明衍生物可用于與pin1酶活性異常表達相關(guān)的疾病中的應(yīng)用，如各種癌癥。通過體外活性篩選，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明衍生物具有抗腫瘤活性，因此本發(fā)明衍生物可以用于制備治療和/或預(yù)防各種癌癥的藥物，如乳腺、肺、結(jié)腸、直腸、胃、前列腺、膀胱、子宮、胰腺和卵巢的癌。本發(fā)明活性化合物可作為唯一的抗癌藥物使用，或者與一種或多種其它抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。聯(lián)合治療通過將各個治療組分同時、順序或隔開給藥來實現(xiàn)。下文中提供的實施例和制備例進一步闡明和舉例說明本發(fā)明化合物及其制備方法。應(yīng)當理解，下述實施例和制備例的范圍并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。合成路線一：合成路線二：合成路線三：合成路線四：合成路線五：具體實施方式：實施例旨在闡述而不是限制本發(fā)明的范圍。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實施例1：3-(1-(2-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備步驟a：將甘草次酸甲酯(2.00g，4.13mmol)溶于70ml干燥二氯甲烷中，加入三乙胺(2.00ml)，冰浴下滴加2-氯乙酰氯(2.00ml，25.36mmol)，室溫反應(yīng)，tlc監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，加水淬滅，分離有機相，水相用二氯甲烷萃取3次。合并有機相，無水硫酸鈉干燥，柱層析純化。收率約為68％。步驟b：將鄰苯二胺(5.00g,46mmol)置于250ml茄形瓶中，室溫下加入110ml二氧六環(huán)，攪拌溶解后加入丁二酸酐(5.55g,55.5mmol)。轉(zhuǎn)移至油浴中，80℃反應(yīng)4小時，tlc監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫析出大量固體，抽濾，濾餅依次用二氧六環(huán)、水、乙醚各洗兩遍，烘干得白色固體。收率為50％～57％。步驟c：將3-(1h-苯并咪唑-2-基)丙酸(1.00g,5.26mmol)溶于20mldmf中，加入0.50g(3.68mmol)研磨烘干的碳酸鉀，繼續(xù)攪拌0.5小時。室溫下緩慢滴加0.72ml(6.32mmol)氯化芐，繼續(xù)反應(yīng)24小時，tlc監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)完成后，倒入50ml冰水中，劇烈攪拌后析出大量固體，抽濾，濾餅用水洗至中性，烘干后得淡黃色固體。收率為61％。步驟d：將a(0.10g,0.30mmol)溶于50ml乙腈中，加入碳酸銫(0.195g,0.60mmol)攪拌30分鐘，加入3-(1h-苯并咪唑-2-基)丙酸芐酯(0.17g,0.30mmol)，加熱至80℃反應(yīng)，tlc監(jiān)測。反應(yīng)完全后，蒸干乙腈，加入適量水，二氯甲烷萃取3次。合并有機相，無水硫酸鈉干燥。柱層析純化，收率77％。步驟e：將b(0.2g,0.25mmol)溶于20ml干燥二氯甲烷中，加入ticl4(0.5ml,4.55mmol)，室溫反應(yīng)，tlc監(jiān)測。反應(yīng)完全后，加入適量水淬滅，二氯甲烷萃取。合并有機層，無水硫酸鈉干燥。柱層析純化，收率為60％。實施例2：3-(1-(2-((18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備按照實施例1的制備方法，制備標題化合物。實施例3：3-(1-(2-((12-氧代-18β-齊墩果烷-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備按照實施例1的制備方法，制備標題化合物。實施例4：3-(1-(2-((12-氧代-18β-齊墩果烷-9(11)-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備按照實施例1的制備方法，制備標題化合物。實施例5：3-(1-(2-((18β-齊墩果烷-9(11),12-二烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備按照實施例1的制備方法，制備標題化合物。實施例6：3-(1-(3-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備按照實施例1的制備方法，制備標題化合物。實施例7：3-(1-(3-((18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備按照實施例1的制備方法，制備標題化合物。實施例8：3-(1-(3-((12-氧代-18β-齊墩果烷-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備按照實施例1的制備方法，制備標題化合物。實施例9：3-(1-(3-((12-氧代-18β-齊墩果烷-9(11)-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備按照實施例1的制備方法，制備標題化合物。實施例10：3-(1-(3-((18β-齊墩果烷-9(11),12-二烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-3-氧代丙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙酸的制備按照實施例1的制備方法，制備標題化合物。實施例11：4-(1-(2-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)苯甲酸的制備步驟a：室溫下，將鄰苯二胺(1.08g,10mmol)溶于50ml混合溶劑中(vdmf:vh2o＝2:1)，加入4-甲?；郊姿崞S酯(2.4g,10mmol)，升溫至80℃反應(yīng)4小時，tlc監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液倒入100ml冰水中，析出大量固體，抽濾得淺黃色固體4-(1h-苯并咪唑-2-基)苯甲酸芐酯，無需純化可直接用于下一步反應(yīng)。收率85％。步驟b：按照實施例1中步驟d和步驟e的制備方法，制備標題化合物。實施例12：(e)-3-(1-(2-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)丙烯酸的制備步驟a：(1h-苯并咪唑-2-基)甲醇的制備室溫下，將鄰苯二胺(10.0g,92.6mmol)和乙醇酸(20.0g,263.0mmol)置于250ml茄形瓶中，加入80ml4mol/l的鹽酸，100℃回流4h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，用氫氧化鉀調(diào)ph至8.0，析出大量固體，過濾收集固體，用水進行重結(jié)晶。收率為85％。步驟b：(1h-苯并咪唑-2-基)甲醛的制備將上述所得固體(1h-苯并咪唑-2-基)甲醇(34mmol)溶于250ml二氯甲烷中，攪拌下加入二氧化錳(0.68mmol)。升溫至40℃繼續(xù)攪拌2小時，tlc監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)完全后，蒸干二氯甲烷，加入150ml四氫呋喃。直接進行下一步反應(yīng)。步驟c：3-(1h-苯并咪唑-2-基)丙烯酸甲酯的制備將膦酰基乙酸甲酯二乙酯(7.77g,0.037mmol)、碳酸鉀(9.38g,0.068mmol)溶于100ml四氫呋喃中，室溫攪拌半個小時后緩慢滴加到上述四氫呋喃溶液中。升溫至66℃繼續(xù)攪拌24小時。反應(yīng)完成后，過濾，減壓蒸去大部分的四氫呋喃，加入300ml乙酸乙酯，水洗一次，飽和氯化鈉溶液洗一次，無水硫酸鈉干燥過夜。過濾，減壓濃縮溶劑，柱層析得到淡黃色固體，收率為65％。步驟d：按照實施例1中步驟d和步驟e的制備方法，制備標題化合物。實施例13：2-(1-(2-((11-氧代-18β-齊墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯)-3β-氧)-2-氧代乙基)-1h-苯并咪唑-2-基)噻唑-4-羧酸的制備步驟a：1h-苯并咪唑-2-甲酸的制備室溫下，將6.0g(1h-苯并咪唑-2-基)甲醇、4.3g碳酸鉀和6.4g高錳酸鉀置于250ml茄型瓶中，加入150ml水，100℃下回流反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后趁熱過濾，濾液用2m鹽酸調(diào)ph至7，析出大量淡黃色固體，過濾收集固體，干燥。收率為50％。步驟b：1h-苯并咪唑-2-甲酰胺的制備室溫下，將3.0g(18.6mmol)1h-苯并咪唑-2-甲酸置于100ml茄型瓶中，加入30ml氯化亞砜，79℃回流反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后蒸干溶劑。加入30ml氨水，70℃反應(yīng)5h，冷卻反應(yīng)液，過濾得黃色固體，干燥。收率為55％。步驟c：1h-苯并咪唑-2-硫代甲酰胺的制備室溫下，將3.0g(18.6mmol)1h-苯并咪唑-2-甲酰胺和7.5g(18.6mmol)勞森試劑置于250ml茄型瓶中，加入150ml四氫呋喃，66℃回流反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后蒸干溶劑，所得固體用二氯甲烷溶解，飽和碳酸氫鈉洗一次，飽和氯化鈉洗一次，收集有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，柱層析得白色固體。收率為60％。步驟d：2-(1h-苯并咪唑-2-基)噻唑-4-甲酸乙酯的制備室溫下，將1.8g(10.0mmol)1h-苯并咪唑-2-硫代甲酰胺和1.98g(10.0mmol)3-溴代丙酮酸乙酯置于250ml茄型瓶中，加入無水乙醇100ml，78℃下回流反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后蒸干溶劑，得黑色固體，柱層析純化。收率為90％。步驟e：按照實施例1中步驟d和步驟e的制備方法，制備標題化合物。實施例14：本發(fā)明產(chǎn)物藥理作用研究pin1酶體外抑制活性實驗1.pin1酶活性測試所需儀器及試劑(1)底物溶劑：0.47mlicl，溶于三氟乙醇(tfa)；(2)緩沖buffer：35mmhepes(ph7.8)；(3)60mg/ml糜蛋白酶，溶于蒸餾水中，現(xiàn)用現(xiàn)配(sigma,c4129)；(4)順式脯氨酸底物suc-ala-glu-cis-pro-phe-pna(bachem,l-1635)；(5)重組人pin1蛋白(sinobiologicalinc.,10282-h07e)；(6)紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司，uv-1801)。2.pin1酶活性測試原理pin1可以催化肽脯酰胺鍵的順反異構(gòu)，含順式肽脯酰胺鍵的四肽底物suc-ala-glu-cis-pro-phe-pna在pin1酶的催化作用下，轉(zhuǎn)變成反式結(jié)構(gòu)suc-ala-glu-trans-pro-phe-pna。糜蛋白酶可以特異切割反式底物中的phe-pna，生成對硝基苯胺(pna)，在390nm顯色，通過對吸光度的測定間接反映酶的活性。3.pin1酶活性測試方法紫外-可見分光光度計預(yù)冷，至溫度<10℃；比色杯調(diào)零；加入緩沖液860μl，pin1純蛋白20μl，混勻；加入待測化合物或溶劑對照10μl，分光光度計中預(yù)冷孵育20～30min；加入150μl糜蛋白酶，快速混勻；最后加入40μl底物啟動反應(yīng)，立即測定，在390nm連續(xù)監(jiān)測90s。因為當?shù)孜餄舛冗h小于米氏常數(shù)時，非催化的熱力學(xué)反應(yīng)速度小于10％的初速度，反應(yīng)初速度取決于底物濃度，酶促反應(yīng)過程符合一級動力學(xué)反應(yīng)，所以可以用指數(shù)擬合求得反應(yīng)的初速度。應(yīng)用軟件graphpadprism5.0進行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)指數(shù)擬合，得到每個反應(yīng)的反應(yīng)速度。抑制率(％)＝[1-(kx-k1)/(kd-k1)]×100。kx是加入化合物的反應(yīng)速度，kd是加入溶劑對照的反應(yīng)速度，k1是非酶促催化的自身熱力學(xué)反應(yīng)速度。以胡桃醌為陽性對照藥?？疾炷繕嘶衔飳η傲邢侔┘毎纳L抑制活性以及在10μm濃度下的體外酶抑制活性，結(jié)果見table1。table1.theanti-proliferativeandpin1inhibitoryactivitiesoftargetcompounds.a-表示還未進行活性測試上述試驗結(jié)果表明，本發(fā)明要保護的通式的化合物具有良好pin1酶抑制作用。本發(fā)明的化合物具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。當前第1頁12當前第1頁12