本發(fā)明生物工程屬于領(lǐng)域，具體涉及一種提高丁二酸產(chǎn)量的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株及其構(gòu)建方法與用途。

背景技術(shù)：

丁二酸是許多嚴格厭氧菌和兼性厭氧菌代謝的重要中間產(chǎn)物。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種微生物可以通過發(fā)酵來生產(chǎn)琥珀酸，其中研究主要集中在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(actinobacillussuccinogenes)和大腸桿菌(e.coli)。此外，曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌(mannheimiasucciniciproducens)，產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(anaerobiospirillumsucciniciproducens)和一些乳酸菌、丙酸產(chǎn)生菌及真菌等也可以產(chǎn)生少量的丁二酸。在眾多的產(chǎn)琥珀酸的微生物中，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能夠利用多種碳源(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖等)進行發(fā)酵，并且可以耐受葡萄糖和丁二酸的濃度分別高達158g/l和104g/l。因此，該菌以丁二酸產(chǎn)量高、耐受性強等優(yōu)點，成為目前丁二酸最具工業(yè)化潛力的生產(chǎn)菌株之一。

目前，國內(nèi)外對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸進行了一系列研究。中國專利zl201210056568.6，zl201210122717.4等報道了產(chǎn)琥珀酸放線桿菌選育的方法，但丁二酸的發(fā)酵水平僅能達到30g/l左右，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要；中國專利zl201180011827.7，zl200910080815.4等對原料及發(fā)酵方法進行了研究，但其所用方法為隨機篩選，工作量大且結(jié)果無法預測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供一種提高丁二酸產(chǎn)量的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株(產(chǎn)琥珀酸放線桿菌pzactinobacillussuccinogenespz)，保藏編號為cctccno:m2016396，保藏日期為2016年7月19日，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株包含來自產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的pepck基因及來源于大腸桿菌的zwf基因；更優(yōu)選地，所述來自產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的pepck基因及來源于大腸桿菌的zwf基因為串聯(lián)表達。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種提高丁二酸產(chǎn)量的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)、表達載體的構(gòu)建：pgzrs-18質(zhì)粒的基礎(chǔ)上添加pepck基因的啟動子和大腸桿菌的cole1復制子基因，構(gòu)建適合產(chǎn)琥珀酸放線桿菌進行基因過量表達的載體pgzrs-e；

2)、重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將pepck基因及zwf基因串聯(lián)克隆至表達載體pgzrs-e，獲得重組質(zhì)粒pgzrs-pepck-zwf；

3)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，篩選陽性克隆細胞獲得產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述提高丁二酸產(chǎn)量的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株的構(gòu)建方法中，所述步驟2)中所述pepck基因與所述zwf基因為化學合成獲得；更優(yōu)選地，所述步驟2)中所述pepck基因與所述zwf基因為pcr擴增獲得。

本發(fā)明所述提高丁二酸產(chǎn)量的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株的構(gòu)建方法中，所述步驟3)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的方法可以為本領(lǐng)域中已知的基因轉(zhuǎn)化方法；優(yōu)選地，本發(fā)明所述提高丁二酸產(chǎn)量的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株的構(gòu)建方法中，所述步驟3)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的方法為電轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明還提供了上述方法制備獲得的表達載體與重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的另一方面是提供上述產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株在丁二酸發(fā)酵中的應用，包括將產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株cctccm2016397，接種發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1)現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)琥珀酸放線桿菌高產(chǎn)丁二酸的方法多使用隨機誘變篩選的方法，一方面工作量大，篩選結(jié)果難以控制；另一方面，對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌高產(chǎn)丁二酸的代謝途徑無法準確控制，導致碳源轉(zhuǎn)化率不高；

本發(fā)明通過對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌gxas137出發(fā)菌株，串聯(lián)過量表達編碼產(chǎn)琥珀酸放線桿菌產(chǎn)丁二酸過程的關(guān)鍵限速酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pepck)及提高體內(nèi)還原力水平的6-磷酸葡萄糖激酶(g6pdh)的基因pepck及基因zwf，獲得工程菌actinobacillussuccinogenespz，提高了限速酶的活性，增加細胞內(nèi)的還原了水平，從而減弱丁二酸合成途徑中的限速步驟，增加碳代謝在c4支路的分配，從而達到了提高丁二酸產(chǎn)量的目的。

2)本發(fā)明構(gòu)建的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的表達載體、重組質(zhì)?？梢赃m合其他高產(chǎn)出發(fā)菌株的構(gòu)建，可以對已有高產(chǎn)菌株進行有目的再次基因工程改造，具有工業(yè)化生產(chǎn)應用的潛力。

說明書附圖

圖1為本發(fā)明的一個實施例中表達載體與重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程示意圖；

圖2為本發(fā)明的一個實施例中表達載體pgzrs-e與原始載體pgzrs-18xbai單酶切產(chǎn)物電泳分析圖；

圖3為本發(fā)明的一個實例中利用重疊pcr獲得pepck-zwf基因片段電泳圖

圖4為本發(fā)明的一個實施例中重組質(zhì)粒pgzrs-pepck-zwf的xbai和saci雙酶切產(chǎn)物電泳圖；

圖5為工程菌株pz與對照菌株gxas37的相關(guān)酶活分析圖；

圖6為重組菌株gxas137-pepck-zwf與對照菌株的發(fā)酵結(jié)果圖。

具體實施方式

在本發(fā)明的一個實施例中，提供了產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株actinobacillussuccinogenespz，保藏編號為cctccnom2016396，保藏日期為2016年7月19日，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)。所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株包含來自產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的pepck基因及來源于大腸桿菌的zwf基因；更優(yōu)選地，所述來自產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的pepck基因及來源于大腸桿菌的zwf基因為串聯(lián)表達。

在本發(fā)明的另一個實施例中提供了提高丁二酸產(chǎn)量的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)、表達載體的構(gòu)建：pgzrs-18質(zhì)粒的基礎(chǔ)上添加pepck基因的啟動子和大腸桿菌的cole1復制子基因，構(gòu)建適合產(chǎn)琥珀酸放線桿菌進行基因過量表達的載體pgzrs-e；

2)、重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將pepck基因及zwf基因串聯(lián)克隆至表達載體pgzrs-e，獲得重組質(zhì)粒pgzrs-pepck-zwf；

3)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，篩選陽性克隆細胞獲得產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實施例中，所述步驟2)中所述pepck基因與所述zwf基因為化學合成獲得；更優(yōu)選地，所述步驟2)中所述pepck基因與所述zwf基因為pcr擴增獲得。

在本發(fā)明的實施例中，所述提高丁二酸產(chǎn)量的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株的構(gòu)建方法中，所述步驟3)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的方法可以為本領(lǐng)域中已知的基因轉(zhuǎn)化方法；優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟3)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的方法為電轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明的另一個實施例還提供了上述方法制備獲得的表達載體pgzrs-e與重組質(zhì)粒pgzrs-pepck-zwf。

本實施例中產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的發(fā)酵方法為：

將平板上的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌單菌落接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16h，菌數(shù)達3億以上，再按照5％(v/v)接種量進行二級擴繁培養(yǎng)8h，菌數(shù)達3億以上，即得到液態(tài)種子；按5％(v/v)的接種量將液態(tài)種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml厭氧瓶中，裝液量為150ml，利用ph緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph維持在6.5-7.0，在充滿n2的環(huán)境中，轉(zhuǎn)速100r/min，溫度為37℃，分批發(fā)酵30h，即得丁二酸。

所述種子培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖8g/l，酵母粉12g/l，玉米漿4g/l，nahco34g/l，nah2po49.6g/l，k2hpo41.55g/l。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖30-100g/l，氮源5-20g/l，磷酸二氫鉀2g/l，碳酸氫鈉2g/l，氯化鈣0.3g/l，氯化鎂0.3g/l。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為玉米漿和酵母粉以任意比例混合。

所述ph調(diào)節(jié)劑是堿式碳酸鎂和碳酸鈉以任意比例混合，濃度為30-100g/l。

本發(fā)明發(fā)酵液中產(chǎn)品分析方法：

樣品處理：發(fā)酵液在室溫下12000r/min，離心10min，取上清，然后用孔徑為0.22μm的無菌濾膜過濾，用高效液相色譜(hplc)檢測發(fā)酵液丁二酸及殘還原糖濃度。

有機酸測定：hplc法，戴安utimat3000，自動進樣器，色譜柱：rezexroa-organicacid300×7.8mm，流動相2.5mmol/lh2so4，ph2.5，柱溫45℃，進樣量10ul，流速0.6ml/min，紫外檢測器波長210nm。

生物量測定：采用分光光度計(du800uv/visspectrophotometer,beckman,usa)在660nm進行測定，樣品先用0.2mhcl進行處理，溶解所含的mgco3，12000r/min離心10min，再用蒸餾水洗三次，以除去所含的色素及雜質(zhì)。

相關(guān)酶活測定方法：主要參照相關(guān)試劑盒的說明書進行。

丁二酸產(chǎn)率(％)定義為：每消耗1g葡萄糖糖所產(chǎn)生丁二酸的克數(shù)。

丁二酸生產(chǎn)強度定義為：單位時間內(nèi)可發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的濃度，單位為g/(l·h)。

下面將結(jié)合本發(fā)明中的實施例，對本發(fā)明中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1表達載體構(gòu)建

如圖1所示，在原始質(zhì)粒pgzrs-18(哈爾濱獸醫(yī)所王春來教授惠贈，圖1a)的基礎(chǔ)上添加pepck基因的啟動子(克隆自產(chǎn)琥珀酸放線桿菌基因組，seqidno1所示序列，即tcgataaattgaaaatgcagcaatagaggaaacacggtttgtttgagtgaaaacagccgtgttttttcatttaccgccataaaaatttgaaacggatcacaaatcatgaaaaaaatacgttcaaattagaactaattatcgaaaatttgatctagttaacattttttaggtataaatagttttaaaatagatctagtttggatttttaattttaaattatcaatgaggtga)到載體pgzrs-18-pro(圖1b)和大腸桿菌的cole1復制子基因(克隆自puc18載體genbank:l08752.1)，構(gòu)建適合產(chǎn)琥珀酸放線桿菌進行基因過量表達的載體pgzrs-e(圖1c)。

表達載體pgzrs-e與原始載體pgzrs-18，使用xbai單酶切產(chǎn)物電泳分析的結(jié)果如圖2所示，其中m：λ/hindiiidna分子量標記；1：表達載體pgzrs-e；2：pgzrs-18載體，結(jié)果顯示：pepck基因的啟動子和大腸桿菌的cole1復制子基因已成功克隆至載體pgzrs-18。

實施例2表達基因獲得及表達載體與轉(zhuǎn)基因工程菌的構(gòu)建

1)串聯(lián)表達基因pepck基因(genbank:eu253567.1)及zwf基因(genbank:ba000007.2)為通過化學合成的方法合成獲得(基因合成公司合成)；

2)串聯(lián)表達基因也可通過重疊pcr方式獲得。

引物如下：

p1：5’-gcgtctagaatgactgacttaaacaaact-3’(seqidno2)

p2：5’-taccgccattgcgtttgtcgtctagatgcttttggaccg

gcgccaac-3’(seqidno3)

p3：5’-ttggcgccggtccaaaagcaatggcggtaacgcaaac

agc-3’(seqidno4)

p4：5’-tgcgagctcttactcaaactcattccagg-3’(seqidno5)

pcr反應體系

pcr參數(shù)

結(jié)果如下：

(1)以引物p1、p2擴增pepck基因；p3、p4擴增zwf基因。

(2)利用產(chǎn)物純化試劑盒對pepck、zwf基因pcr產(chǎn)物進行純化。

(3)以pepck、zwf共同的模板，p1和p4為引物，擴增得到pepck+zwf基因，電泳結(jié)果如圖3所示，其中，m1：λ/hindiiidna分子量標記；m2：dl2000dna分子量標記；1：zwf與pepck基因串聯(lián)后的pcr產(chǎn)物。從圖3可以看出：獲得的pcr產(chǎn)物大小約為3.2kb，符合兩個基因串聯(lián)大小，說明我們獲得了pepck、zwf這兩個基因串聯(lián)的片段。

3)將來源于產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的pepck基因及來源于大腸桿菌的zwf基因通過酶切、連接至實施例1獲得的表達載體pgzrs-e，獲得重組質(zhì)粒pgzrs-pepck-zwf，進行雙酶切驗證。

如圖4所示，對重組質(zhì)粒pgzrs-pepck-zwf使用xbai和saci雙酶切產(chǎn)物的電泳圖，其中，m：λ/hindiiidna分子量標記；1：pgzrs-e質(zhì)粒；2：重組質(zhì)粒pgzrs-pepck-zwf。

從圖4可以看出：雙酶切后出現(xiàn)3.2kb和5.4kb兩個片段，與表達載體pgzrs-e及串聯(lián)表達基因pepck-zwf大小一致，說明我們獲得了將串聯(lián)表達基因克隆至表達載體的重組質(zhì)粒pgzrs-pepck-zwf。

4)電轉(zhuǎn)化至產(chǎn)琥珀酸放線桿菌gxas137(本實驗室篩選得到，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保存編號為cctccm2011399，該菌株已申請國家發(fā)明專利cn201210017288.4)，利用抗性篩選獲得工程菌株actinobacillussuccinogenespz。

電轉(zhuǎn)化方法為：

(1)電轉(zhuǎn)化條件：電壓2500v、電阻400ω、電容25μf。

(2)電擊完成后立即加入0.5ml預冷的種子液，37℃靜置培養(yǎng)1h，取適當體積涂布到含有抗性的篩選平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，挑選篩選平板上長出的單菌落進行驗證。

篩選培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基平板上添加60ug/ml氨芐青霉素

實驗結(jié)果：在篩選平板上共長出12個克隆，挑選單克隆于試管中進行液體培養(yǎng)16h(添加60ug/ml氨芐青霉素)，提取質(zhì)粒驗證全部正確，進行發(fā)酵試驗，獲得丁二酸產(chǎn)量最高的工程菌株，命名為actinobacillussuccinogenespz。

實施例3工程菌株相關(guān)酶活測定

將實施例2獲得的工程菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(actinobacillussuccinogenespz)及對照菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌gxas137進行液體發(fā)酵培養(yǎng)：

將平板上的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌單菌落接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16h，菌數(shù)達3億以上，再按照5％(v/v)接種量進行二級擴繁培養(yǎng)8h，菌數(shù)達3億以上，即得到液態(tài)種子；按5％(v/v)的接種量將液態(tài)種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml厭氧瓶中，裝液量為150ml，利用ph緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph維持在6.5-7.0，在充滿n2的環(huán)境中，轉(zhuǎn)速100r/min，溫度為37℃，分批發(fā)酵30h，即得丁二酸。

所述種子培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖8g/l，酵母粉12g/l，玉米漿4g/l，nahco34g/l，nah2po49.6g/l，k2hpo41.55g/l。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖30-100g/l，氮源5-20g/l，磷酸二氫鉀2g/l，碳酸氫鈉2g/l，氯化鈣0.3g/l，氯化鎂0.3g/l。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為玉米漿和酵母粉以任意比例混合。

所述ph調(diào)節(jié)劑是堿式碳酸鎂和碳酸鈉以任意比例混合，濃度為30-100g/l。

菌液離心收集菌體，超生破胞后制得粗酶液，按照相關(guān)酶活的測定方法對相關(guān)的磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(pepck)、丙酮酸激酶(pk)、蘋果酸脫氫酶(mdh)及葡萄糖-6-磷酸激酶(g6pdh)的酶活進行測定，結(jié)果如圖5。

從圖5可以看出：與對照菌株相比，工程菌株pz的pepck及g6pdh的酶活力顯著增加，分別提高了25.3％和34％，而pk、mdh及adh酶活略有降低，但影響并不顯著(p>0.05)。由此可知基因pepck及zwf在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌體內(nèi)得到過表達，且對代謝通路中的相關(guān)酶活產(chǎn)生了一定的影響。

實施例4工程菌株丁二酸發(fā)酵測定

將實施例2獲得的工程菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌pz及對照菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌gxas37接種發(fā)酵，發(fā)酵條件見實施例3，初糖濃度為75g/l，發(fā)酵時間為48h，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵產(chǎn)物及生物量，結(jié)果見圖6。

由圖6發(fā)酵結(jié)果可知：與對照菌株gxas137丁二酸產(chǎn)量為49.4g/l相比，工程菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌pz丁二酸產(chǎn)量達到55.68g/l，產(chǎn)量增加約12.71％，但細胞生長受到一定的影響，細胞生物量下降10.7％，對副產(chǎn)物乙酸及甲酸的影響不顯著(p>0.05)，對照菌株的丁二酸產(chǎn)率為65.87％，生產(chǎn)強度為1.03g/(l·h)；而工程菌株的丁二酸產(chǎn)率為74.24％，生產(chǎn)強度為1.16g/(l·h)。以上結(jié)果表明獲得的工程菌株具有工業(yè)化應用的潛力。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

序列表

<110>廣西科學院

<120>一種提高丁二酸產(chǎn)量的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工程菌株及其構(gòu)建方法與用途

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>231

<212>dna

<213>actinobacillussuccinogenes

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