本發(fā)明涉及具有生產(chǎn)異戊二烯能力的重組甲烷氧化菌以及使用其生產(chǎn)異戊二烯的方法，更具體地涉及其中引入了編碼與甘薯(ipomoeabatatas)異戊二烯合酶的氨基酸序列具有至少70％同源性的異戊二烯合酶的基因并具有生產(chǎn)異戊二烯能力的重組甲烷氧化菌以及使用此重組甲烷氧化菌生產(chǎn)異戊二烯的方法。
背景技術(shù)：
：類異戊二烯是可用于藥物、營養(yǎng)品、香料、芳香劑、香水和橡膠產(chǎn)品的異戊二烯聚合物。異戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是不溶于水但可溶于醇的揮發(fā)性烴?？梢酝ㄟ^從石油c5裂解級分中直接分離得到或通過c5異烷烴或異烯烴的脫水得到商業(yè)上可行的量的異戊二烯(weissermel和arpe,industrialorganicchemistry(工業(yè)有機化學(xué)),第四版,wiley-vch,117-122頁,2003)，并且c5骨架也可以由較小的亞單元合成。異戊二烯的生物合成通過兩種不同的代謝途徑發(fā)生(julsing等，applmicrobiolbiotechnol,75:1377-1384,2007)。在真核生物和原生生物中，異戊二烯經(jīng)由甲羥戊酸(mva)途徑合成，而在一些細(xì)菌和高等植物中，異戊二烯經(jīng)由甲基赤蘚醇磷酸(methylerythritolphosphate，mep)途徑合成。植物散發(fā)異戊二烯依賴于光和溫度，并隨著葉的發(fā)育而增加。已在白楊(aspen)樹中鑒定出異戊二烯合酶，即異戊二烯生產(chǎn)酶(silver和fall,plantphysiol,97:1588-1591,1991；以及silver和fall,jbiolchem,270:13010-13016,1995)，并認(rèn)為異戊二烯合酶負(fù)責(zé)全部葉子中異戊二烯的體內(nèi)生產(chǎn)。還報道了異戊二烯的細(xì)菌生產(chǎn)(kuzma等,currmicrobiol,30:97-103,1995；wilkins,chemosphere,32:1427-1434,1996)，并且生產(chǎn)量隨細(xì)菌生長階段和培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的含量而變化(美國專利第5,849,970號；wagner等，jbacteriol,181:4700-4703,1999)。然而，由現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)菌系統(tǒng)獲得的異戊二烯的水平不足以用于商業(yè)用途。因此，需要一種有效的、大規(guī)模的、細(xì)菌生產(chǎn)異戊二烯的方法來提供用于制造類異戊二烯的原料。另一方面，在c1化合物中，甲烷氣體由天然氣和合成氣低成本地制造，其中合成氣為通過焚燒諸如生物質(zhì)、城市垃圾等的廢棄物得到的一氧化碳、二氧化碳和氫的混合氣體。天然氣作為下一代能源引起人們的關(guān)注，因為它大量存在于化石資源中并產(chǎn)生相對少量的co2。因此，正在發(fā)生從常規(guī)石油向天然氣的轉(zhuǎn)變。甲烷氧化菌是采用分子中不具有c-c鍵的碳化合物(如甲烷、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等)作為唯一碳源或能源的同化c1化合物的微生物的總稱。稱為甲烷氧化菌(methanotroph)、甲烷氧化細(xì)菌(methane-oxidizingbacteria)、甲醇同化菌(methanolassimilatingbacteria)、甲醇同化酵母、甲醇同化微生物的任何微生物均屬于甲基營養(yǎng)菌(methylotrophs)。甲基營養(yǎng)菌的主要代謝反應(yīng)是在將甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛之后再將甲醛轉(zhuǎn)化為具有c-c鍵的有機物的反應(yīng)。作為使用甲烷氧化菌生產(chǎn)異戊二烯的方法，報道了幾種包含從外部引入異戊二烯合酶的方法。然而，當(dāng)將外源基因異戊二烯合酶引入甲烷氧化菌中時，存在甲烷氧化菌不具有足夠的生產(chǎn)異戊二烯能力的缺點，因此異戊二烯產(chǎn)量低(us2015-0225743；kr2015-0100666；wo2014-138419；wo2014-089436)。因此，本發(fā)明人已經(jīng)進行了廣泛的努力以開發(fā)使用獲自廢棄物例如天然氣、生物質(zhì)、城市廢物等的甲烷氣體或甲醇作為碳源以高產(chǎn)率生產(chǎn)異戊二烯的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在甲烷或甲醇的存在下培養(yǎng)通過用甘薯異戊二烯合酶基因進行轉(zhuǎn)化而構(gòu)造的嗜鹽甲烷氧化菌時，能以高產(chǎn)率生產(chǎn)異戊二烯，從而完成本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：技術(shù)問題本發(fā)明的一個目的是提供使用甲烷氣體或甲醇作為碳源以高產(chǎn)率生產(chǎn)異戊二烯的重組甲烷氧化菌。本發(fā)明的另一個目的是提供使用所述重組甲烷氧化菌生產(chǎn)異戊二烯的方法。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了具有異戊二烯生產(chǎn)能力的重組甲烷氧化菌，其中該重組甲烷氧化菌中引入了編碼與seqidno:1的氨基酸序列具有至少70％同源性的異戊二烯合酶的基因。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)異戊二烯的方法，其包括以下步驟：(a)在甲烷或甲醇作為碳源存在的條件下培養(yǎng)所述重組甲烷氧化菌，從而生產(chǎn)異戊二烯；和(b)回收生產(chǎn)的異戊二烯。有益效果使用本發(fā)明的重組甲烷氧化菌能夠利用獲自廢棄物如天然氣、生物質(zhì)、城市垃圾等的甲烷氣體或甲醇作為碳源以高產(chǎn)率生產(chǎn)異戊二烯。附圖說明圖1顯示通過本發(fā)明的重組甲烷氧化菌生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖2顯示本發(fā)明的重組甲烷氧化菌培養(yǎng)物中的異戊二烯的gc-ms分析結(jié)果。圖3顯示在甲烷底物的存在下通過本發(fā)明的重組甲烷氧化菌生產(chǎn)異戊二烯的結(jié)果。具體實施方式在本發(fā)明中，為了使用甲醇或甲烷作為碳源以高產(chǎn)率生產(chǎn)異戊二烯，通過向嗜鹽甲烷氧化菌中引入甘薯異戊二烯合酶基因(isps)構(gòu)造了重組甲烷氧化菌。發(fā)現(xiàn)該重組甲烷氧化菌表現(xiàn)出了生產(chǎn)異戊二烯的能力，這種能力在野生型甲烷氧化菌中未出現(xiàn)。用于本發(fā)明的甲烷氧化菌是能夠使用碳源作為底物經(jīng)由mep代謝途徑生產(chǎn)dmapp的嗜鹽甲烷氧化菌，并且其可以含有編碼以下甲基赤蘚醇磷酸(mep)途徑酶的基因：(i)mep途徑酶：1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(dxs)、1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(dxr)、1-脫氧-d-核酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(drl)、4-二磷酸胞苷-2c-甲基-d-赤蘚糖醇合酶(ispd)、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基赤蘚糖醇激酶(ispe)、2c-甲基-d-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合酶(ispf)、1-羥基-2-甲基-2-(e)-丁烯基4-二磷酸合酶(ispg)、異戊烯基二磷酸：nad(p)+氧化還原酶(isph)和異戊基二磷酸異構(gòu)酶(idi)。因此，一方面本發(fā)明涉及具有生產(chǎn)異戊二烯能力的重組甲烷氧化菌，其中該重組甲烷氧化菌中引入了編碼與seqidno:1的氨基酸序列具有至少70％同源性的異戊二烯合酶的基因。在本發(fā)明中，具有seqidno:1的氨基酸序列的異戊二烯合酶是顯示高異戊二烯生產(chǎn)效率的甘薯異戊二烯合酶(isps)。與甘薯isps基因同源性最高的基因是油橄欖(oleaeuropaea)萜烯合酶3，其僅顯示與甘薯isps基因68％的同源性，因此本發(fā)明中使用的isps基因是與常規(guī)萜烯合成酶同源性非常低的新的酶。在本發(fā)明中，編碼異戊二烯合酶的基因與seqidno:1的氨基酸序列具有優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、甚至更優(yōu)選90％、最優(yōu)選95％的同源性。在本發(fā)明中，甲烷氧化菌可以選自甲基單胞菌屬(methylomonas)、甲基桿菌屬(methylobacter)、甲基球菌屬(methylococcus)、甲基彎曲菌屬(methylosinus)、甲基孢囊菌屬(methylocystis)、甲基微菌屬(methylomicrobium)、甲烷單胞菌屬(methanomonas)、甲基細(xì)胞菌屬(methylocella)和甲基帽菌屬(methylocapsa)。優(yōu)選地，可用于本發(fā)明的甲烷氧化菌可以是嗜堿甲基微菌(methylomicrobiumalcaliphilum)，但不限于此。在本發(fā)明的實施例中，將甘薯isps基因引入到嗜堿甲基微菌20z(methylomicrobiumalcaliphilum20z)(dsm19304)中，從而構(gòu)造具有生物合成異戊二烯能力的重組甲烷氧化菌。在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)異戊二烯的方法，其包括以下步驟：(a)在甲烷或甲醇作為碳源存在的條件下培養(yǎng)所述重組甲烷氧化菌，從而生產(chǎn)異戊二烯；和(b)回收所生產(chǎn)的異戊二烯。步驟(b)中異戊二烯的回收可以通過例如氣相色譜(gc)、氣相色譜-質(zhì)譜(gc-ms)、氣提、蒸餾、聚合物膜分離、滲透蒸發(fā)吸附/解吸、熱解吸、真空解吸、溶劑萃取等已知的方法進行，但不限于此。實施例在下文中，將參考實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實施例僅為說明性目的，而不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍，這對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。實施例1：通過引入isps基因制備重組甲烷氧化菌為了構(gòu)造質(zhì)粒bluescript-sk-isps，合成了引物f_ibat_nde[seqidno:2]和r_ibat_kpn[seqidno:3]，使用一對引物seqidno:2和seqidno:3通過pcr擴增isps基因，并使用ndei和kpni限制酶將isps基因插入到pbluescript載體。然后使用兩組引物：ptac-isps-f(seqidno:4)/isps-pawp78r(seqidno:5)和phps-ispf(seqidno:6)/isps-pawp78r(seqidno:5)從pbluescrip-sk-isps擴增isps基因。引物在5’端(重疊區(qū)域)與ptac或phps或pawp78序列互補以促進片段的退火。使用的所有引物列于下面表1中。表1引物序列ptac啟動子和phps啟動子分別是衍生自tac或hps啟動子的功能性合成雜交物(hybrid)，其-10和核糖體結(jié)合位點分別來自hps和pmoa基因啟動子。將擴增的isps片段與相應(yīng)的啟動子區(qū)域連接，并使用gibson組裝(來自neblabs的nebuilderhifidnaassemblymastermix)將其克隆至pawp78中(puri，aw等，applenvironmicrobiol.81(5)：1775-81,2015)。將所得片段轉(zhuǎn)化入neb-5α感受態(tài)大腸桿菌。將轉(zhuǎn)化的克隆在lb+kan(卡那霉素)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過pcr篩選正確組裝的菌株。從2-3個克隆獲得基因構(gòu)建體并測序以證實。將經(jīng)驗證的構(gòu)建體(pawp78::ptac-isps和pawp78::phps-isps)亞克隆至大腸桿菌s17-1中，并通過雙親交配(biparentalmating)并入到嗜堿甲基微菌20z(dsm19304)中(ojalads等，methodsenzymol.495:99-118,2011)。使用含有卡那霉素(100μg/ml)和rif(50μg/ml)的培養(yǎng)基來選擇含有pawp78::ptac-isps或pwp78::phps-isps的重組嗜堿甲基微菌20z，該培養(yǎng)基具有下面表2至表5所示的組成。實施例2：在甲醇底物的存在下由重組甲烷氧化菌生產(chǎn)異戊二烯向50ml無菌的封閉血清瓶中加入12.5ml具有下面表2所示組成的培養(yǎng)基，并加入2g/l甲醇作為碳源。表2中的微量元素溶液、磷酸鹽溶液和碳酸鹽溶液的組成分別示于表3、表4和表5中。將在實施例1中構(gòu)造的轉(zhuǎn)化有isps基因的嗜堿甲基微菌20z接種到該培養(yǎng)基中并在30℃的溫度和250rpm的攪拌速度下培養(yǎng)3天。表2培養(yǎng)基成分含量kno31.0g/lmgso4·7h2o0.2g/lcacl2·2h2o0.02g/l微量元素溶液(×1000)1ml/lnacl30g/l磷酸鹽溶液20ml/l碳酸鹽溶液(1m,ph8.8-9.0)40ml/ldh2o添加至1l表3微量元素溶液成分含量(g/l)na2edta5feso4·7h2o2znso4·7h2o0.3mncl2·4h2o0.03cocl2·6h2o0.2cuso4·5h2o0.3nicl2·6h2o0.05na2moo4·2h2o0.05h3bo30.03dh2o添加至1l表4磷酸鹽溶液成分含量(g/l)kh2po45.44na2hpo45.68表5碳酸鹽溶液成分含量(g/l)nahco375.6na2co310.5接下來，將種子培養(yǎng)物接種到新準(zhǔn)備的血清瓶中，然后在與上述相同的條件下培養(yǎng)3天，之后分析異戊二烯的產(chǎn)量。通過gc/fid(柱：db-5ms(60m長×0.25mm內(nèi)徑(i.d)×0.25mm厚度))分析異戊二烯的產(chǎn)量；入口分流比：10:1；入口溫度：280℃；箱溫：初始溫度30℃(10分鐘)，斜率：10℃/分鐘，等溫：180℃(0分鐘)。結(jié)果，如圖1和圖2所示，野生型嗜堿甲基微菌20z菌株未產(chǎn)生異戊二烯，但實施例1中構(gòu)造的含有pawp78::ptac-isps或pwp78::phps-isps的菌株生產(chǎn)約50μg/ml的高濃度異戊二烯。實施例3：在甲烷底物的存在下由重組甲烷氧化菌生產(chǎn)異戊二烯向250ml無菌三角燒瓶(baffledflask)中加入50mlp培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)化有isps基因的嗜堿甲基微菌20z重組菌株接種到培養(yǎng)基中并在30℃和200rpm下培養(yǎng)24小時。加入2g/l的甲醇作為碳源。接下來，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種到在3l發(fā)酵罐中的1.5l工作體積的p培養(yǎng)基中，并在30℃和200rpm或更高轉(zhuǎn)速以及ph8.7-9下培養(yǎng)。使用甲烷氣體(10v/v％，90％n2)作為碳源。注入碳源與空氣的混合物，并在細(xì)胞培養(yǎng)期間分析異戊二烯。捕獲出口氣，并分析出口氣中的異戊二烯。結(jié)果，如圖3所示，可以確認(rèn)異戊二烯的產(chǎn)生。序列表<110>sk新技術(shù)株式會社圣地亞哥州立大學(xué)研究基金會<120>使用重組嗜鹽甲烷氧化菌生產(chǎn)異戊二烯的方法<130>khp16213275.7<150>10-2016-0009372<151>2016-01-26<160>6<170>patentinversion3.2<210>1<211>541<212>prt<213>甘薯(ipomoeabatatas)<400>1metthralaargargseralaasntyrglnprosersertrpsertyr151015aspglutyrleuvalaspthrthrthrasnaspserlysleuargile202530glngluaspalaarglyslysleugluglugluvalargasnvalleu354045gluaspglylysleugluthrleualaleuleugluleuileaspasp505560ileglnargleuglyleuglytyrlysphearggluserthrserthr65707580serleualametleulysmetservalglyglnglualaserasnser859095serleuhissercysserleutyrpheargleuleuarggluhisgly100105110pheaspilethrproaspvalpheglulysphelysaspgluasngly115120125lysphelysaspserilealalysaspvalargglyleuleuserleu130135140tyrglualaserpheleuglyphegluglygluasnileleuaspglu145150155160alaarggluphethrthrmethisleuasnasnilelysasplysval165170175asnproargilealaglugluvalasnhisalaleugluleuproleu180185190hisargargvalgluargleuglualaargargargileglnsertyr195200205serlysserglygluthrasnglnalaleuleuthrleualalysile210215220asppheasnthrvalglnalavaltyrglnargaspleuglnaspval225230235240serlystrptrplysaspthralaleualaasplysleuserpheala245250255argaspargleumetgluserphephetrpalaileglymetsertyr260265270aspproglnhisserlysserargglualavalthrlysthrphelys275280285leuvalthrvalleuaspaspvaltyraspvaltyrglyserleuasp290295300gluleuglulysphethralaalaalagluargtrpaspvalaspala305310315320ilelysaspleuproasptyrmetlysleucystyrleuserleuphe325330335asnthrvalasnaspleualatyraspthrleulysasplysglyglu340345350thrvalileproilemetlyslysalatrpalaaspleuleulysala355360365pheleuglnglualaglntrpiletyrasnlystyrthrprothrphe370375380aspglutyrleuasnasnalaargpheservalserglycysvalmet385390395400leuvalhissertyrphethrthrglnasnilethrlysglualaile405410415hisserleugluasntyrhisaspleuleuiletrpproserileval420425430pheargleualaasnaspleuserserserlysalagluilegluarg435440445glygluthralaasnserilethrcystyrmetasngluthrglygln450455460serglugluglnalaarggluhisileserlysleuileaspglucys465470475480phelyslysmetasnlysglumetleualathrserthrserprophe485490495glulysserpheilegluthralaileasnleualaargilealaleu500505510cysglntyrglntyrglyaspalahisseraspproaspvalargala515520525argasnargilevalservalileileasnprovalglu530535540<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>2catatgactgcccgccgctc20<210>3<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>3ggtaccctattccactggattaatgataactgac34<210>4<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>4ccatgattacgaaaggaggacaatgactgcccgccgctcagc42<210>5<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>5gcatcttcccgacaactactactattccactggattaatgataac45<210>6<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>6gtaactatcggagaagaaacatgactgcccgccgctcagcaaac44當(dāng)前第1頁12