本發(fā)明涉及一種防治馬鈴薯晚疫病的生防菌株枯草芽孢桿菌bs193及其應(yīng)用，屬于農(nóng)作物病害防治技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由晚疫病菌（phytophthorainfestans(mont)debary）引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上一種毀滅性的病害，在世界各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生和流行，嚴重威脅著馬鈴薯的生產(chǎn)，其造成的危害、防治難度及對社會影響已超過水稻稻瘟病和小麥條銹病，被視為國際第一大作物病害。晚疫病在我國發(fā)生普遍而嚴重，每年因感晚疫病造成約80億元人民幣的經(jīng)濟損失，已成為限制我國馬鈴薯生產(chǎn)和實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的第一大障礙。

目前為止，晚疫病防治主要還是培育抗病品種和大量使用化學(xué)農(nóng)藥。其中培育抗病品種仍然是防治疫病最成功的措施，但是晚疫病菌毒性組成具多變異性特點，導(dǎo)致利用主抗基因育成的抗病品種抗性喪失，而在短時間內(nèi)篩選并培育出具有抗新疫病的新品種是非常困難的?；瘜W(xué)農(nóng)藥對農(nóng)業(yè)的發(fā)展雖然起著重要的作用，但長期對化學(xué)農(nóng)藥的使用會帶來許多負面影響。使用化學(xué)農(nóng)藥不僅缺乏長期的有效性，還出現(xiàn)生態(tài)環(huán)境被破壞、人畜和有益生物中毒、化學(xué)性物質(zhì)在糧食和飼料中殘留量大大超標，影響人畜生存質(zhì)量等諸多問題，許多國家和地區(qū)已經(jīng)相繼禁止了一些高毒、高殘留化學(xué)農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用。在當今人們越來越關(guān)注自己的生存環(huán)境，以及越來越提倡綠色生活的時代，探索有效的生防措施無疑具有重大的理論和現(xiàn)實意義。

芽孢桿菌(bacillussubtilis)是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢生物種群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。許多性狀優(yōu)良的天然分離株已成功應(yīng)用于植物病害的生物防治。枯草芽孢桿菌通過成功定殖至植物根際、體表或體內(nèi)，與病原菌競爭植物周圍的營養(yǎng)，分泌抗菌物質(zhì)以抑制病原菌生長，同時誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而達到生防的目的。其主要防治對象為絲狀真菌及卵菌所引起的植物病害?？莶菅挎邨U菌是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細菌,其生理特征多樣，分布廣泛，極易分離培養(yǎng)。該菌在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境,能產(chǎn)生多種抗菌素和酶具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。

枯草芽孢桿菌不僅可以在土壤、植物根際體表等外界環(huán)境中廣泛存在，而且是植物體內(nèi)常見內(nèi)生細菌，尤其是在植物的根、莖部。目前該菌已經(jīng)在水稻、大豆、棉花、小麥、辣椒、番茄、玉米等農(nóng)作物上顯示出很好的病害防治效果。由于枯草芽孢桿菌具有生長快、營養(yǎng)簡單以及產(chǎn)生耐熱、抗逆芽孢等突出特征，而使其不僅有利于生防菌劑在生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖，并且批量生產(chǎn)工藝簡單，成本較低，施用方便，儲存期長，現(xiàn)已成為一種理想的生防細菌。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：針對目前馬鈴薯晚疫病嚴重發(fā)生，且面積逐年擴大，化學(xué)防治效果不理想，同時帶來環(huán)境污染的問題，提供一種高效防治馬鈴薯晚疫病的生防枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種防治馬鈴薯晚疫病的枯草芽孢桿菌菌株bs193，經(jīng)形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征觀察和分子生物學(xué)研究鑒定為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，已于2017年3月27月保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為cgmccno.13936。

所述的枯草芽孢桿菌bs193菌劑的制備過程如下：

將所述的菌株接種于lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min，培養(yǎng)20h，制成種子液。取10ml種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。經(jīng)優(yōu)化后得到的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化鈉和15g瓊脂粉加蒸餾水定容至1l，溶解并調(diào)ph為7.0。通過對培養(yǎng)條件的摸索，得到最佳發(fā)酵條件為：接種量5%(v/v)、裝瓶量200ml/500ml、發(fā)酵培養(yǎng)基ph值7.0、37℃，200r/min，培養(yǎng)48h，制成濃度為10⁸cfu/ml的bs193菌株發(fā)酵液。

所述的枯草芽孢桿菌bs193菌劑在防治馬鈴薯晚疫病中的應(yīng)用方法如下：

可在馬鈴薯植株噴霧或灌根使用。連續(xù)使用2-3次，每次間隔7~10天。該菌劑也可與有機肥混合配制成菌肥使用。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明篩選出的枯草芽孢桿菌bs193能夠明顯抑制馬鈴薯晚疫病菌的生長。由于該菌株分離自番茄植株體內(nèi)，屬于內(nèi)生菌，是生物制劑，因此沒有化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來的一系列問題，對減少農(nóng)業(yè)污染，且能有效防治馬鈴薯晚疫病。

本發(fā)明枯草芽孢桿菌分離自植株體內(nèi)，容易在體內(nèi)定植，有利于充分發(fā)揮菌株的優(yōu)勢。本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌株培養(yǎng)條件簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1菌株bs193發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌菌絲的影響（光學(xué)顯微鏡下200×）。

圖2菌株bs193發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌菌絲的影響（電子顯微鏡7000×）。

圖3菌株bs193對馬鈴薯晚疫病菌的拮抗測定。

圖4菌株bs193發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌的平板抑菌效果圖。

具體實施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但并不是對本發(fā)明的限制。下述實施例中所用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

實施例一：菌株bs193的鑒定

1、菌株來源

菌株bs193從健康的番茄葉片上分離獲得。將番茄葉片用自來水洗凈晾干后，選取適量葉片組織，再用蒸餾水清洗3次、75%乙醇消毒3min，用無菌水清晰3次，升汞處理10-15min，再無菌水清洗3次。在無菌研缽內(nèi)加入10ml無菌水和滅菌石英砂，研磨成勻漿，加蓋靜止30min后，用移液槍吸50μl上清液于na培養(yǎng)基上涂板，48h后長出菌落進行純化保藏。

、形態(tài)特征觀察

將菌株bs193劃線接種在lb培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化鈉和15g瓊脂粉加蒸餾水溶解并調(diào)ph為7.0-7.2，補加雙蒸水定容至1000ml,高壓滅菌備用。)上，30℃培養(yǎng)48h后進行形態(tài)特征觀察：菌株bs193革蘭氏陽性，桿狀，末端圓；（0.6～0.8）×（1.5～3.0）微米；無莢膜，不成鏈，能運動；芽孢橢圓形至柱狀，中生或次端生，（0.6～0.9）×（1.0～1.5）微米，橢圓形，中生或次端生。菌落粗糙，不透明，粘著，擴展。

、序列分析與分子鑒定

基因組提取試劑盒提取菌株bs193基因組dna后，采用通用引物進行16srdna的pcr擴增?；厥誴cr擴增產(chǎn)物，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后，陽性克隆送生工生物工程（上海）有限公司測序，序列全長為1509bp（seqidno.1）。將所得序列提交到genbank數(shù)據(jù)庫進行blast分析比對，發(fā)現(xiàn)與bs193同源性較高的菌株均屬于枯草芽孢桿菌，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征，將菌株bs193鑒定為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。

實施例二：菌株bs193拮抗測定

采用平板對峙培養(yǎng)法，將菌株bs193對馬鈴薯晚疫病菌作拮抗測定，首先在黑麥培養(yǎng)基平板中央接入馬鈴薯晚疫病菌菌絲塊，待馬鈴薯晚疫病菌菌落長至3cm時，在菌落4周點接上菌株bs193，25℃下培養(yǎng)15天后測量菌株bs193對大豆疫霉菌的抑菌帶寬度，實驗結(jié)果篩選測定表明菌株bs193對馬鈴薯晚疫病菌具有較好的拮抗作用（圖3）。

實施例三：菌株bs193發(fā)酵液防效試驗

bs193菌株發(fā)酵液（10⁸cfu/ml），8000r/min離心20min，分別收集其菌體沉淀和上清液。菌體沉淀利用無菌水清洗多次后，再用無菌水配成與原發(fā)酵菌液等體積的菌體懸浮液。馬鈴薯播種于盛有無菌土壤的營養(yǎng)缽中，每盆種植四株。分別用20ml菌株培養(yǎng)液、菌體懸浮液、無菌濾液灌根處理，24h后接種10ml疫霉菌孢子懸浮液液（孢子囊濃度1×10⁴/ml）。每處理重復(fù)3次，以清水和lb培養(yǎng)基處理后接種馬鈴薯晚疫病霉菌為對照，保濕處理。接種3d后調(diào)查發(fā)病情況。

病情分級標準如下：

0級：接種部位無變化或稍變褐；

1級：接種部位產(chǎn)生病斑，病斑面積占莖部面積的1/4以下；

3級：接種部位病斑面積占莖部總面積的1/4～1/2左右；

5級：接種部位病斑占莖部面積的1/2以上；

7級：接種部位病斑連片，已形成繞莖現(xiàn)象，但植株并沒萎蔫或枯死；

9級：植株萎蔫或枯死。

病情指數(shù)（%）=[（病級數(shù)×該病級植株數(shù))／(最高病級數(shù)×總植株數(shù))]×100%

防治效果（%）=[(對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù))／對照病情指數(shù)]×100%（對照指清水對照處理）

實驗結(jié)果表明（表1），供試菌株bs193發(fā)酵液能夠顯著降低馬鈴薯晚疫病的病情指數(shù)，防治效果高達75.51%，溫室盆栽實驗結(jié)果說明，菌株bs193能夠有效防治馬鈴薯晚疫病，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。

表1菌株bs193處理后不同間隔時間接種馬鈴薯晚疫病菌的防病效果

注：表中數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所

<120>一種防治馬鈴薯晚疫病的枯草芽孢桿菌bs193及其應(yīng)用

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1509

<212>dna

<213>枯草芽孢桿菌bs193的16srdna序列

<400>1

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