本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種拮抗放線菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禾谷絲核菌，拉丁名rhizoctoniacerealis，屬無(wú)孢霉目真菌類(lèi)?？梢鹦←湣⒋篼?、玉米、水稻的紋枯病，是我國(guó)小麥種植區(qū)普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重的一種土傳性真菌病害。

禾谷絲核菌侵染引起的小麥紋枯病是一種世界性病害。在我國(guó)近20個(gè)?。ㄊ校┒加胁煌潭鹊陌l(fā)生和危害，以江蘇、浙江、安徽、山東、河南、陜西、貴州、湖北及四川等省麥區(qū)發(fā)生普遍，危害嚴(yán)重，輕者產(chǎn)量損失5%-10%，重者減產(chǎn)20%-40%。甚至造成枯孕（白）穗而顆粒無(wú)收。近年來(lái)，由于小麥品種、栽培措施和肥水條件的改變，紋枯病危害逐漸加重，己成為影響小麥穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要障礙。目前對(duì)小麥紋枯病的防治是在農(nóng)業(yè)防治的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥劑防治，藥劑防治主要用三唑類(lèi)殺菌劑迸行“一噴一拌”。由于紋枯病發(fā)生在小麥莖基部，防治方法不當(dāng)則效果不理想。而且長(zhǎng)期連續(xù)地使用化學(xué)農(nóng)藥，易導(dǎo)致一系列嚴(yán)重后果：使病菌產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留造成環(huán)境污染以及威脅人類(lèi)的健康等。生物防治則是利用生物及其代謝產(chǎn)物防治植物病蟲(chóng)害，可避免化學(xué)農(nóng)藥使用帶來(lái)的一系列環(huán)境和能源方面的問(wèn)題，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。小麥紋枯病的生物防治研究目前還處于開(kāi)始階段，篩選有效控制小麥紋枯病的生防菌、研究生防菌的控病機(jī)理將為小麥紋枯病的生物和生態(tài)防治提供一定的理論基礎(chǔ)，使其成為小麥紋枯病綜合治理中的重要環(huán)節(jié)。

平臍蠕孢菌（bipolarissorokiniana）和黃色鐮孢菌（fusariumculmorum）不僅可以引起小麥的根腐病，還可以侵染玉米、水稻、多種蔬菜甚至牧草，引起根腐病。近些年小麥根腐病發(fā)生嚴(yán)重，小麥種子的帶菌率比較高，一般病田發(fā)病率為1%~5%，較重病田發(fā)病率在10%左右。小麥根腐病對(duì)小麥產(chǎn)量的影響比較大，一般病田減產(chǎn)10%~30%，嚴(yán)重地塊會(huì)減產(chǎn)30%~70%（李可凡等，2003）。在我國(guó)，防治小麥根腐病比較常用的農(nóng)藥有三唑酮、三唑醇、克菌丹、福美砷、退菌特、賽力散等，一般采用藥劑拌種的方法，采用藥劑拌種與田間藥劑噴施相結(jié)合的方法，能更有效的減輕小麥根腐病的為害程度。李可凡等（2003）小麥開(kāi)花始期施用噴灑25%粉銹寧可濕性粉劑或50%的福合劑，每公頃用商品藥量1500g，可控制葉部病害的發(fā)展，有較好的防病增產(chǎn)的效果。朱統(tǒng)泉等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，使用立克秀、禾果利拌種對(duì)小麥紋枯病和根腐病的防治效果較好?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用會(huì)造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留，同時(shí)化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期并且超標(biāo)使用，嚴(yán)重危害甚至破壞農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，同時(shí)殺死了環(huán)境中的有益微生物，提高了植物病原菌的抗藥性，最終致防治效果下降甚至防治失敗。發(fā)展生物防治是當(dāng)前研究的一大趨勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)上的不足，本發(fā)明目的是提供一種拮抗放線菌，可用于禾谷絲核菌、平臍蠕孢菌和/或黃色鐮孢菌引起的多種農(nóng)作物病害的生物防治。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種拮抗放線菌，保藏編號(hào)為cgmccno.9793的海棠鏈霉菌(streptomycesspectabilis)fx-h-51。

優(yōu)選的，所述放線菌培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為7d。

所述的放線菌在生物防治中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述的放線菌在防治禾谷絲核菌、平臍蠕孢菌和/或黃色鐮孢菌引起的病害中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述的放線菌在防治小麥紋枯病、小麥根腐病中的應(yīng)用。

所述放線菌可以制備放線菌菌劑。

優(yōu)選的，拮抗放線菌菌劑，其活性成分為如下(a)、(b)、(c)、（d）和（e）中的至少一種：

（a）權(quán)利要求1所述放線菌；

（b）權(quán)利要求1所述放線菌的發(fā)酵上清液；

（c）權(quán)利要求1所述放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)物；

（d）權(quán)利要求1所述放線菌的發(fā)酵上清液的提取物；

（e）權(quán)利要求1所述放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)物的提取物。

優(yōu)選的，通過(guò)以下方法提取活性物質(zhì):溶媒萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、柱層析、薄層層析等技術(shù)對(duì)發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離提純。

優(yōu)選的，萃取劑為乙酸乙酯。

優(yōu)選的，以氯仿︰甲醇=20︰1進(jìn)行層析。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明是一種高效拮抗禾谷絲核菌、平臍蠕孢菌和/或黃色鐮孢菌等多種農(nóng)作物病害的放線菌，放線菌及其發(fā)酵上清液、發(fā)酵培養(yǎng)物、相關(guān)提取物，在小麥、玉米、水稻等多種病害的生物防治上具有重要意義，本發(fā)明的應(yīng)用可以減輕化學(xué)防治帶來(lái)的生態(tài)環(huán)境污染、人畜危害等問(wèn)題，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)投入，減輕環(huán)境壓力。

生物樣品保藏信息如下：

海棠鏈霉菌(streptomycesspectabilis)fx-h-51，于2014年10月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中科院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno.9793。

附圖說(shuō)明

圖1是土壤分離的部分放線菌。

圖2是拮抗放線菌fx-h-51菌株的菌絲、孢子形態(tài)；其中左圖是菌絲形態(tài)；右圖是菌絲與孢子形態(tài)。

圖3是拮抗放線菌fx-h-51菌株生理生化特性測(cè)定結(jié)果。其中a是明膠液化實(shí)驗(yàn)結(jié)果;b是牛奶凝固與胨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果;c是淀粉水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果;d是纖維素水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4是拮抗放線菌fx-h-51菌株16srdna擴(kuò)增結(jié)果。

圖5是拮抗放線菌fx-h-51菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

圖6是溫度對(duì)放線菌fx-h-51菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響結(jié)果。

圖7是初始ph對(duì)放線菌fx-h-51菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響結(jié)果。

圖8是搖床轉(zhuǎn)速對(duì)放線菌fx-h-51菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響結(jié)果。

圖9是發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量對(duì)放線菌fx-h-51菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響結(jié)果。

圖10是不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)放線菌fx-h-51菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響結(jié)果。

圖11是發(fā)酵培養(yǎng)條件趨勢(shì)圖。

圖12是放線菌對(duì)小麥紋枯病、根腐病的防治效果圖。其中1代表fx-h-71；2代表fx-h-51；3代表fx-s-178；4代表fx-s-114；5代表fx-h-51和fx-h-71混合；6代表fx-h-71和fx-s-178混合；7代表fx-h-51和fx-s-178混合；8代表fx-h-51、fx-h-71、fx-h-178混合；9代表空白對(duì)照。

圖13是放線菌防治禾谷絲核菌（wk-207）引起小麥紋枯病效果（左：對(duì)照右：fx-h-51處理）。

圖14是放線菌防治鐮孢菌（wf25）引起的小麥根腐病結(jié)果（左：對(duì)照右：fx-s-178處理）。

圖15是防治蠕孢菌引起的小麥根腐病結(jié)果（左：對(duì)照右：fx-h-51、fx-h-71、fx-s-178混合處理）。

圖16是發(fā)酵液熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。

圖17是發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)圖。

圖18是發(fā)酵液紫外線穩(wěn)定性試驗(yàn)圖。

圖19是溶媒萃取結(jié)果。

圖20是薄層層析結(jié)果。

圖21是薄層層析結(jié)果。

圖22是色譜條帶抑菌活性。

圖23是第二次硅膠層析的tlc結(jié)果圖。

圖24是樣品對(duì)禾谷絲核菌的拮抗作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述：

實(shí)施例1拮抗放線菌來(lái)源和篩選

1.樣本采集

2012～2013年，分別從陜西、山西、甘肅等地的蘋(píng)果園以及山東各地小麥田中采集土樣50多份，其中蘋(píng)果園中采集的為果樹(shù)根際重茬土，小麥田中采集的為根際土。共計(jì)分離得到217株放線菌，見(jiàn)圖1（僅為部分分離菌株）。

2.放線菌的分離純化

采用稀釋涂布法，選用高氏1號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行分離，抑菌劑為重鉻酸鉀（80mg/l）。取10g土樣，加入到90ml滅菌水中，搖瓶30min，靜止20min，取上清液，用無(wú)菌水分別稀釋到10-2、10-3、10-4，用移液槍取0.1ml稀釋后的菌液到高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上，然后用無(wú)菌涂布器進(jìn)行平板涂布，25℃倒置培養(yǎng)兩周。用接種環(huán)挑取形態(tài)各不相同的單菌落接種到不含重鉻酸鉀的高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，再經(jīng)過(guò)多次挑取單菌落到培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化，將純化后的菌株進(jìn)行試管斜面4℃編號(hào)保存。

3.拮抗放線菌的初步篩選

將純化后的放線菌進(jìn)行拮抗活性測(cè)定，記錄具有較好抑制效果的菌株。采用平板對(duì)峙法（王蘭英等，2006）：將分離到的放線菌接種到高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，供試靶標(biāo)真菌接種到pda平板上，分別培養(yǎng)。7d后用直徑5mm的打孔器打取靶標(biāo)菌菌餅，接種在pda平板中央，同樣方法取放線菌菌餅，等距離接種在靶標(biāo)菌兩側(cè)，以不接放線菌，只接種靶標(biāo)菌作為對(duì)照，25℃培養(yǎng)4～7d，每處理重復(fù)3次。觀察放線菌各菌株對(duì)靶標(biāo)菌的抑菌效果，選取有明顯抑菌圈的菌株作為復(fù)篩菌株。

表1拮抗放線菌對(duì)禾谷絲核菌的抑制作用

表2拮抗放線菌對(duì)小麥根腐病菌的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，184株放線菌對(duì)峙小麥紋枯病致病菌禾谷絲核菌（wk-207，rhizoctoniacerealis），其中抑菌圈半徑超過(guò)5mm的放線菌48株，其中拮抗效果最明顯的放線菌為fx-h-51，抑菌半徑達(dá)16.75mm，見(jiàn)表1。選取對(duì)小麥紋枯病菌抑菌半徑達(dá)8mm以上的放線菌對(duì)小麥根腐病致病菌黃色鐮孢菌（wf25，fusariumculmorum）、平臍蠕孢菌（wb112，bipolarissorokiniana）進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，抑菌圈半徑超過(guò)5mm的放線菌分別有5株、7株，見(jiàn)表2。

4.拮抗放線菌的復(fù)篩

利用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)初步篩選得到的4株放線菌菌株的生防效果及其耐性進(jìn)行綜合評(píng)判（徐文鳳等，2011；郭建博等，2007；徐文鳳等，2012）。生防效果測(cè)定以禾谷絲核菌（wk-207，rhizoctoniacerealis）屬agd融合群為靶標(biāo)菌，進(jìn)行平板對(duì)峙時(shí),不同放線菌的抑菌效果作為判定依據(jù)。耐性試驗(yàn)主要包括不同放線菌對(duì)溫度、酸堿性、抗生素等耐受能力，其中放線菌的耐低溫性是以10℃條件下培養(yǎng)6d的菌落直徑表示，耐高溫性是以40℃條件下培養(yǎng)6d的菌落直徑表示；耐酸性以ph=3時(shí)，菌株在25℃條件下培養(yǎng)6d的菌落直徑表示；耐堿性是以ph=11時(shí)，菌株在25℃條件下培養(yǎng)6d的菌落直徑表示；對(duì)鏈霉素的耐性測(cè)定是以菌株在含鏈霉素為1mg/l的高氏1號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d后的菌落直徑表示。

根據(jù)灰色系統(tǒng)理論，將所有供試菌株視為一灰色系統(tǒng)，每一菌株都是系統(tǒng)中的單一的灰因素，作為參考數(shù)列χ0的是“理想菌株”各項(xiàng)性狀性質(zhì)指標(biāo)構(gòu)成的數(shù)列，作為比較數(shù)列χi（i=1、2、3…7）是供試菌株各項(xiàng)性狀性質(zhì)指標(biāo)構(gòu)成的數(shù)列，將參考數(shù)列χ0與比較數(shù)列χi進(jìn)行數(shù)據(jù)量化處理，求出各供試菌株與參考菌株的關(guān)聯(lián)度，并按關(guān)聯(lián)度大小排出關(guān)聯(lián)序。

綜合初篩結(jié)果選取4株放線菌菌株fx-h-51、fx-h-71、fx-s-114、fx-s-178，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果如表3所示：在對(duì)靶標(biāo)菌的抑制作用、對(duì)鏈霉素的抗性上菌株fx-h-51的效果較好；在耐高溫性、耐酸堿性上菌株fx-s-114的耐受性較好；在耐低溫性上菌株fx-s-178的耐受性較好。

表3四株放線菌的生防性狀測(cè)定結(jié)果

表4供試菌株的灰色關(guān)聯(lián)度及排序

根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)分析，關(guān)聯(lián)度越大的菌株，其與參考菌株越接近，綜合性能越好。由表4中可以看出，菌株fx-h-51的灰色關(guān)聯(lián)度r0i=0.9025最大，表明菌株fx-h-51的綜合性狀與構(gòu)建的理想菌株最接近，是比較理想的拮抗絲核菌的放線菌菌株。其次是菌株fx-s-114、fx-s-178，而菌株fx-h-71的灰色關(guān)聯(lián)度最小，表明其菌株的綜合性狀與構(gòu)建的理想菌株相差最大。

實(shí)施例2拮抗放線菌fx-h-51的鑒定

參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》（周德慶等，1986）和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》（中科院微生物研究所，1975）的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征、生理生化鑒定。培養(yǎng)特征觀察培養(yǎng)基包括高氏1號(hào)培養(yǎng)基、伊莫松培養(yǎng)基、、察氏培養(yǎng)基、葡萄糖-天門(mén)冬素培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基、馬鈴薯塊培養(yǎng)基。生理生化特征試驗(yàn)培養(yǎng)基包括明膠液化培養(yǎng)基、牛奶凝固胨化培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、纖維素水解培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、格里斯氏試劑a液、格里斯氏試劑b液、硫化氫產(chǎn)生培養(yǎng)基。

1.形態(tài)特征觀察

通過(guò)復(fù)篩，篩選出生防效果好、耐性較強(qiáng)的菌株fx-h-51。采用插片法、載片培養(yǎng)法觀察菌株fx-h-51形態(tài)。插片法：主要觀察菌株的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀況。將拮抗放線菌fx-h-51菌株在高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上劃線，然后將蓋玻片45°斜插在培養(yǎng)基上，使菌絲能夠沿著蓋玻片與培養(yǎng)基交界處生長(zhǎng)并附著于蓋玻片上，25℃恒溫培養(yǎng)7d，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu)、氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀況以及有無(wú)可溶性色素及其顏色。載片培養(yǎng)法：用于觀察菌株的孢子和孢子絲形態(tài)。將高氏1號(hào)培養(yǎng)基滴在載玻片上，接種菌株，蓋上蓋玻片，25℃恒溫培養(yǎng)7d后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察孢子絲和孢子的形態(tài)。

拮抗放線菌fx-h-51菌株在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)7d后觀察形態(tài)特征，見(jiàn)圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株菌落生長(zhǎng)繁茂，邊緣不規(guī)則向四周擴(kuò)散，菌落呈現(xiàn)橙紅色，表面絨狀隆起且干燥不透明。氣絲直桿狀，淺粉色，基絲橙紅色，無(wú)橫隔，孢子橢圓形，表面光滑。

2.培養(yǎng)特征觀察

將菌株fx-h-51分別接種在高氏1號(hào)、伊莫松、察氏、葡萄糖-天門(mén)冬素、無(wú)機(jī)鹽淀粉及馬鈴薯塊培養(yǎng)基上（劉姝等，2007），25℃恒溫培養(yǎng)，分別在7、14、28d觀察菌株的培養(yǎng)特征和顏色變化。觀察并記錄氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的生長(zhǎng)狀況及其顏色、有無(wú)可溶性色素等特征。

表5拮抗放線菌fx-h-51菌株的培養(yǎng)特征

25℃恒溫培養(yǎng)7d后觀察拮抗放線菌fx-h-51菌株的培養(yǎng)特征。試驗(yàn)結(jié)果表明，拮抗放線菌fx-h-51在伊莫松、葡萄糖-天門(mén)冬素、馬鈴薯塊培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，在高氏1號(hào)、察氏、無(wú)機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況很好，菌落圓形、隆起、粉狀、在培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可溶性色素。fx-h-51菌株在6種不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征見(jiàn)表5。

3.生理生化特征測(cè)定

（1）明膠液化

放線菌能夠分泌明膠酶，這種酶可以分解明膠，使其無(wú)法凝固從而呈現(xiàn)液體狀態(tài)。將菌株fx-h-51接種于裝有明膠的試管中，25℃恒溫培養(yǎng)，以未接種菌株的明膠培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，分別在5、10、20d觀察液化程度。觀察前應(yīng)冷卻30min后，查看明膠的液化程度，若試管中明膠出現(xiàn)液體，說(shuō)明明膠已液化或部分液化，反之說(shuō)明明膠未液化。

（2）牛奶凝固與胨化

將菌株fx-h-51接種于裝有牛奶的試管中，25℃恒溫培養(yǎng)，以未接種菌株為空白對(duì)照，分別在3、6、10、20、30d，觀察牛奶是否出現(xiàn)凝固、胨化。若牛奶呈現(xiàn)透明或半透明狀，為胨化現(xiàn)象(denisek.zinnieletal，2014)，測(cè)定的是菌株產(chǎn)生蛋白酶的能力。

（3）淀粉水解

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌塊，接種于淀粉水解培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫培養(yǎng)7d，以未接種菌塊的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。7d后，在菌落周?chē)渭颖R戈氏碘液，鋪滿(mǎn)平板，幾分鐘后將多余的碘液倒出，若在菌塊周?chē)囵B(yǎng)基出現(xiàn)透明圈，說(shuō)明菌株fx-h-51產(chǎn)生淀粉酶；若菌塊周?chē)囵B(yǎng)基沒(méi)有透明圈，說(shuō)明菌株fx-h-51不產(chǎn)生淀粉酶。透明圈的大小表示該菌株產(chǎn)生淀粉酶能力的強(qiáng)弱或水解淀粉能力的強(qiáng)弱。

（4）纖維素水解

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌塊，接種于纖維素水解培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7d，以未接種該菌株的培養(yǎng)基作空白對(duì)照。7d后，在培養(yǎng)基上加入1mg/ml剛果紅溶液，10～15min后，倒去剛果紅溶液，再加入1mol/l的nacl溶液，15min后倒掉nacl溶液。若在菌塊周?chē)囵B(yǎng)基出現(xiàn)透明圈，說(shuō)明該菌株產(chǎn)生纖維素酶，透明圈的大小表示該菌株分解纖維素的能力的強(qiáng)弱。

（5）硝酸鹽還原反應(yīng)

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌塊，接種于硝酸鹽還原培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7d，以未接菌種的硝酸鹽還原培養(yǎng)基為空白對(duì)照。檢測(cè)時(shí)，取1ml菌液加到試管中，格里斯氏試劑a、b液各加2滴，若有亞硝酸鹽存在會(huì)使菌液呈現(xiàn)紅色、棕色或橙色等，為陽(yáng)性反應(yīng)。若無(wú)紅色出現(xiàn)，則再加2滴二苯胺試劑，若菌液呈藍(lán)色，表示無(wú)亞硝酸鹽存在，標(biāo)定為陰性，不成藍(lán)色標(biāo)定為陽(yáng)性。

（6）硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌塊，接種于硫化氫產(chǎn)生培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7d，已未接菌種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，觀察菌落周?chē)囵B(yǎng)基是否變黑。若菌落周?chē)兒?，說(shuō)明該菌株能夠產(chǎn)生硫化氫；反之，則表示該菌株不能產(chǎn)生硫化氫。

生理生化測(cè)定結(jié)果表明，拮抗放線菌fx-h-51菌株能使明膠全部液化，牛奶凝固且胨化，能夠水解淀粉跟纖維素，但水解纖維素能力較弱，硝酸鹽不還原，不產(chǎn)生硫化氫。見(jiàn)表6及圖3。

表6拮抗放線菌fx-h-51菌株的生理生化特性測(cè)定結(jié)果

注：+代表發(fā)生；—代表不發(fā)生。

4.分子生物學(xué)鑒定

放線菌fx-h-51菌株總dna的提取方法參考徐平等人的方法（徐平等，2003；姜淑梅等，2007）但有所改進(jìn)。提取步驟如下：

（1）將菌株fx-h-51接種到鋪有玻璃紙的高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上，在25℃恒溫培養(yǎng)5d左右，待菌落形成后，刮取菌落于離心管中。

（2）加入300μl～500μlte，振蕩懸起沉淀并充分混勻反應(yīng)液。

（3）加入1/100體積濃度10mg/ml的溶菌酶，1/100體積濃度20mg/ml的蛋白酶k，倒管并充分混勻反應(yīng)液，37℃反應(yīng)30min。

（4）加入1/10體積的10%sds和0.5mol/ledta，倒管充分混勻，55℃反應(yīng)1h。

（5）加入2/3體積7mol/l預(yù)冷乙酸銨溶液，倒管充分混勻，10000r/min，保留上清。

（6）加入2倍體積無(wú)水乙醇-20℃醇沉30min，12000r/min離心5min，棄上清。

（7）加入70%乙醇倒管洗沉淀2次，每次1ml，12000r/min離心5min，小心棄上清。

（8）真空抽干沉淀并溶入50μlte，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取提取dna5μl上樣，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外燈下觀測(cè)所提取dna的質(zhì)量。

目的片段pcr擴(kuò)增

根據(jù)16srdna的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其保守區(qū)使用特異引物，序列為：

正向引物27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′

反向引物its4：5′-tacggctaccttgttacgactt-3′

pcr擴(kuò)增選用50μl反應(yīng)體系，反應(yīng)程序如下：

表7pcr反應(yīng)程序

擴(kuò)增反應(yīng)條件：

用于pcr擴(kuò)增的各種試劑（dntpmixture、l0×buffer、taqdna聚合酶）由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供，擴(kuò)增引物由上海生工生物技術(shù)有限公司。

擴(kuò)增結(jié)果用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，1倍tbe為電泳緩沖液，上樣量5μl。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

使用takaraminibestdnafragmentpurificationkitver.4.0試劑盒純化回收擴(kuò)增片段。

1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為1倍tbe，加樣3μl進(jìn)行回收產(chǎn)物檢測(cè)。

特異擴(kuò)增片段的克隆

克隆載體采用peasy-t3載體，由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供，克隆感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌dh-5α。

（1）克隆反應(yīng)體系的建立

在微型離心管中加入pcr回收產(chǎn)物3.7μl、peasy-t3載體0.3μl，輕輕混勻，室溫反應(yīng)10min，冰浴5min。

（2）轉(zhuǎn)化

a、加連接產(chǎn)物于33μldh-5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴反應(yīng)25min。

b、42℃熱激90s，立即置于冰上5min。

c、加入800μllb液體培養(yǎng)基，200rpm，37℃孵育1h。

d、8000rpm離心2min，去除部分上清，保留100~150μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液均勻涂布含氨芐青霉素lb平板，培養(yǎng)過(guò)夜。

（3）單克隆檢測(cè)

挑取平板上長(zhǎng)出的單克隆于lb/amp⁺液體培養(yǎng)基中，200rpm，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以培養(yǎng)的菌液為模板，進(jìn)行pcr檢測(cè)。

（4）序列測(cè)定及分析

將含有目的片段的克隆委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。用dnaclub軟件對(duì)每一序列的正向(5′-3′)和反向(3′-5′)進(jìn)行核對(duì)，并生成5′-3′的完整序列。利用blast，從genbank、ncbi等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性查詢(xún)，選出同源性最高且有效發(fā)表的典型菌株序列，用clustalx進(jìn)行序列比對(duì)，最后用mega4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，來(lái)確定放線菌的親緣關(guān)系和分類(lèi)地位。

拮抗放線菌fx-h-51菌株分子生物學(xué)鑒定如下：

通過(guò)pcr方法克隆拮抗放線菌fx-h-51菌株的16srdna，并進(jìn)行基因測(cè)序，獲得16srdna序列，共1447bp,16srdnapcr擴(kuò)增序列見(jiàn)seqidno:1。電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。

在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)與菌株fx-h-51相近的16srdna序列，與其同源性較高的菌株均屬于鏈霉菌屬；最后利用mega4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖5。通過(guò)blast相似性分析，放線菌fx-h-51菌株與海棠鏈霉菌（streptomycesspectabilis）的16srdna序列同源性最高，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚于同一分枝中。

實(shí)施例3菌株fx-h-51發(fā)酵條件優(yōu)化

微生物的發(fā)酵除了受到培養(yǎng)基的氮、碳以及微量元素影響之外，還要受到培養(yǎng)時(shí)間、ph、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、溫度等因素的影響，是一個(gè)十分繁雜的過(guò)程（王永宏等，2006）。因此，需要把優(yōu)化的各種因素充分組合在一起才能發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力。

1實(shí)驗(yàn)材料

（1）供試菌種

放線菌fx-h-51菌株，經(jīng)過(guò)分離、篩選獲得

供試病原菌：絲核菌wk207由本實(shí)驗(yàn)室提供

（2）培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：高氏1號(hào)培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖50.3g、胰蛋白胨9.6g、nacl2.5g、caco32.0g、蒸餾水1000ml。

2單因素試驗(yàn)初步優(yōu)化放線菌fx-h-51菌株的發(fā)酵條件

（1）溫度對(duì)發(fā)酵濾液抑菌作用的影響

溫度對(duì)菌株的發(fā)酵有很大的影響，尤其是在改變發(fā)酵過(guò)程中酶的活性上，并且溫度還能夠改變氧的溶解度和傳遞速率（田黎等，2003）。

本實(shí)驗(yàn)將ph為7的100ml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶中，分別置于22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃，160r/min振蕩培養(yǎng)6d后，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)小麥紋枯病菌的抑制效果，以測(cè)定菌株最佳的發(fā)酵溫度。

結(jié)果顯示（圖6），當(dāng)發(fā)酵溫度在28℃時(shí)，對(duì)禾谷絲核菌的抑制作用相對(duì)最高，抑菌直徑達(dá)到34.67mm。當(dāng)溫度為22℃、37℃時(shí)，對(duì)禾谷絲核菌的抑制作用相對(duì)較低，抑菌直徑分別為23.67mm、26.50mm。

（2）初始ph值對(duì)發(fā)酵濾液抑菌作用的影響

將100ml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶中，ph值分別調(diào)成4、5、6、7、8、9、10、11，25℃、160r/min振蕩培養(yǎng)6d后，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)小麥紋枯病菌的抑制效果，以測(cè)定菌株發(fā)酵的最佳初始ph。

結(jié)果表明（圖7），當(dāng)ph為8時(shí)，對(duì)禾谷絲核菌的抑制作用最好，抑菌直徑達(dá)37.17mm，當(dāng)ph為4時(shí)，抑菌作用最小，直徑為23.17mm。由此可見(jiàn)，該菌在初始ph為3時(shí)，產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的能力較弱。

（3）搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵濾液抑菌作用的影響

將ph為7的100ml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min，25℃振蕩培養(yǎng)6d后，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)小麥紋枯病菌的抑制效果，以測(cè)定菌株發(fā)酵的最佳搖床轉(zhuǎn)速。

結(jié)果表明（圖8），當(dāng)轉(zhuǎn)速為200r/min時(shí)，對(duì)禾谷絲核菌的抑菌作用最大，抑菌直徑可達(dá)34.50mm；當(dāng)轉(zhuǎn)速為240r/min時(shí)，抑菌作用較差，抑菌直徑為28.50mm。

（4）裝液量對(duì)發(fā)酵濾液抑菌作用的影響

將ph為7的發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶中，裝液量分別設(shè)置為50ml、75ml、100ml、125ml、150ml，25℃、160r/min振蕩培養(yǎng)6d后，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)小麥紋枯病菌的抑制效果，以測(cè)定菌株發(fā)酵的最佳裝液量。

結(jié)果表明（圖9），當(dāng)裝液量為100ml時(shí)，對(duì)禾谷絲核菌的抑菌作用最大，抑菌直徑可達(dá)33.67mm；當(dāng)轉(zhuǎn)速為150ml時(shí)，抑菌作用較差，抑菌直徑為28.84mm。

（5）發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵濾液抑菌作用的影響

將ph為7的100ml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶中，25℃、160r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置為3d、5d、7d、9d、11d，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)小麥紋枯病菌的抑制效果，以測(cè)定菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間。

結(jié)果表明（圖10），當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為7d時(shí)，對(duì)禾谷絲核菌的抑菌作用最大，抑菌直徑可達(dá)34.00mm；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為3d時(shí)，抑菌作用較差，抑菌直徑為20.00mm。

3菌株fx-h-51發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)前面單因素的試驗(yàn)，確定了三個(gè)單因素為主要影響條件：發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間，進(jìn)行l(wèi)9（3⁴）正交試驗(yàn)，各個(gè)因素水平如下表：

表8因素水平表

根據(jù)正交試驗(yàn)，來(lái)確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件。見(jiàn)表9-11和圖11。

表9中的9個(gè)處理結(jié)果表明，第5個(gè)處理的抑菌直徑最大，為34.6mm，說(shuō)明抑菌效果較好，相應(yīng)的水平組合為a2b2c3，培養(yǎng)條件是28℃、7d、220r/min。從圖11的趨勢(shì)圖可以看出，最佳組合是a2b2c2，培養(yǎng)條件是28℃、7d、200r/min。這組試驗(yàn)并沒(méi)有包括在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中，為了檢驗(yàn)一下真實(shí)結(jié)果是否與試驗(yàn)推測(cè)的結(jié)果相吻合，所以又追加了a2b2c2試驗(yàn)處理，追加的a2b2c2試驗(yàn)處理的抑菌直徑為35.7mm，發(fā)酵菌液表現(xiàn)出較高的抑菌效果。

表9正交設(shè)計(jì)表l9（3⁴）

表10正交試驗(yàn)方差分析表

表11極差分析表

表10表明，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的水平間存在顯著差異，而培養(yǎng)時(shí)間三個(gè)水平間不存在顯著差異。從表11中還可以看出，溫度在各因素中影響最大，其次是轉(zhuǎn)速、時(shí)間。因此，通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件是28℃、200r/min，7d。

實(shí)施例4拮抗放線菌防治小麥紋枯病、根腐病的溫室實(shí)驗(yàn)

選取4株對(duì)小麥紋枯病菌（wk-207）、根腐病病原菌（wb112、wf25）有較好抑制效果的放線菌菌株fx-h-51、fx-h-71、fx-s-114、fx-s-178，對(duì)其各自及組合的菌液進(jìn)行溫室盆栽試驗(yàn)，測(cè)定不同放線菌菌株對(duì)小麥紋枯病、根腐病的生防效果。

具體方法：4株放線菌菌株劃線接種在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d，然后打取菌塊接種于裝有100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml的錐形瓶中，200r/min振蕩培養(yǎng)7d，以小麥紋枯病致病菌禾谷絲核菌（wk-207，rhizoctoniacerealis）和小麥根腐病致病菌菌平臍蠕孢菌（wb112，bipolarissorokiniana）、黃色鐮孢菌（wf25，fusariumculmorum）作為靶標(biāo)菌，取3種病原真菌分別接種在麥粒培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7d，進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，作為病原菌接種體。將供試小麥種子播于裝有土壤的盆中，每盆10粒，小麥種子均勻分布于盆中，每粒小麥種子附近接入1粒接種體，然后用土壤覆蓋。取5ml放線菌菌液均勻?yàn)⑷肱柚?。以不接放線菌菌液的為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每隔3～4d定量澆水，30d后調(diào)查發(fā)病情況。

小麥紋枯病嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（徐娜娜等，2014）：

0級(jí)：不發(fā)病

1級(jí)：小麥植株葉鞘外部發(fā)病，且病斑長(zhǎng)度小于葉鞘1/2

3級(jí)：小麥植株葉鞘外部發(fā)病，且病斑長(zhǎng)度大于葉鞘1/2

5級(jí)：小麥植株葉鞘外部發(fā)病，并侵入莖，且病斑長(zhǎng)度環(huán)莖不足1/2

7級(jí)：小麥植株葉鞘外部發(fā)病，并侵入莖，且病斑長(zhǎng)度環(huán)莖超過(guò)1/2

9級(jí)：植株枯死

小麥根腐病嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（李鵬昌等，2014）：

0級(jí)：不發(fā)病

1級(jí)：小麥植株莖基部外部葉鞘變黑褐色，且病斑長(zhǎng)度小于葉鞘的1/2

3級(jí)：小麥植株莖基部外部葉鞘變黑褐色，且病斑長(zhǎng)度大于葉鞘的1/2

5級(jí)：小麥植株莖基部?jī)?nèi)部葉鞘變黑褐色，且病斑長(zhǎng)度小于葉鞘的1/2

7級(jí)：小麥植株莖基部?jī)?nèi)部葉鞘變黑褐色，且病斑長(zhǎng)度大于葉鞘的1/2

9級(jí)：根部腐爛，植株死亡

從圖12可以看出，每個(gè)處理對(duì)小麥紋枯病、根腐病都有一定的防治效果，在防治小麥紋枯病上處理2防治效果最好，達(dá)到81.20%，即菌株fx-h-51防治效果最好；在平臍蠕孢菌引起的小麥根腐病的防治上，處理8即fx-h-51、fx-h-71、fx-h-178組合防治效果最好達(dá)到75.10%；在黃色鐮孢菌引起的小麥根腐病防治上，處理3即fx-s-178的防治效果最好，達(dá)到76.53%。防治效果如圖13-15所示。

實(shí)施例5放線菌fx-h-51菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

農(nóng)用抗生素不管是施用在作物表面，還是深入到土壤中，都要受到陽(yáng)光、溫度以及土壤酸堿度的影響，因此，農(nóng)用抗生素在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性成為了評(píng)價(jià)其是否有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的一個(gè)重要指標(biāo)（朱昌雄等，2002）。另外，在活性物質(zhì)的提取、精制以及加工過(guò)程中，也需要對(duì)其有效成分進(jìn)行光、熱、ph條件下穩(wěn)定性的測(cè)定（nobilimdcetal，2001）。

按照實(shí)施例3試驗(yàn)優(yōu)化后的發(fā)酵條件獲得放線菌fx-h-51的發(fā)酵液，再經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾得到上清液，然后測(cè)定發(fā)酵液的穩(wěn)定性。

1.發(fā)酵液對(duì)熱的穩(wěn)定性測(cè)定

取5份發(fā)酵液，分別置于10℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃處理60min后，待自然冷卻到室溫（張玲玲等，2009）。以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，絲核菌wk-207作為靶標(biāo)菌，采用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定生物活性（慕立義等，1994），試驗(yàn)重復(fù)3次，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d后，觀察并測(cè)量菌絲直徑，從而確定其熱穩(wěn)定性。

試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)發(fā)酵液的穩(wěn)定性有較大的影響。低溫時(shí)發(fā)酵液的抑菌活性比較穩(wěn)定，抑菌效果較好，抑菌直徑達(dá)到35.33mm；40℃以后，隨著溫度的升高，抑菌效果降低，但到100℃，抑菌效果仍未完全喪失。見(jiàn)圖16，因此，該發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)不耐熱，保存溫度不宜高于40℃。

2.發(fā)酵液對(duì)酸堿的穩(wěn)定性測(cè)定

取5份發(fā)酵液，分別用1mol/lhcl和1mol/lnaoh調(diào)ph至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0靜置2h后，再分別用1mol/lnaoh和1mol/lhcl調(diào)至中性，以無(wú)菌水為對(duì)照，重復(fù)3次，方法同上，確定其ph穩(wěn)定性。

試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵液的抑菌活性在ph值為3～11的條件下抑菌效果變化不大，但在ph值為7時(shí)的抑菌效果最好，抑菌直徑達(dá)到31.50mm。因此，說(shuō)明該發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)在酸堿環(huán)境下有較高的耐受性。見(jiàn)圖17。

3.發(fā)酵液對(duì)紫外線的穩(wěn)定性測(cè)定

取5份發(fā)酵液，在紫外線下分別處理0min、5min、15min、25min、35min、45min后，以無(wú)菌水為對(duì)照，重復(fù)3次，方法同上，確定其光穩(wěn)定性。

試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵液在受到紫外線不同時(shí)間照射后，對(duì)禾谷絲核菌抑菌效果有影響，發(fā)酵液的抑菌活性隨紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。發(fā)酵液經(jīng)紫外線照射5min后，對(duì)禾谷絲核菌的抑菌直徑為39.67mm，照射45min后，對(duì)供試菌的抑菌直徑為35.83mm，與照射5min時(shí)的抑菌活性相比，有所下降。見(jiàn)圖18。

實(shí)施例6放線菌fx-h-51菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性成分分離純化和抑菌實(shí)驗(yàn)

一般情況下，發(fā)酵液中含有一些菌體代謝副產(chǎn)物，這些雜質(zhì)的含量會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于活性物質(zhì)千百倍，尤其是這些雜質(zhì)的理化性質(zhì)與活性物質(zhì)極其相似（高群等，2007），因此，清除發(fā)酵液中的雜質(zhì)是后續(xù)工作順利進(jìn)行的前提。

1材料

（1）培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：高氏1號(hào)；發(fā)酵培養(yǎng)基：優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基；生物活性測(cè)定培養(yǎng)基：pda。

（2）主要試劑儀器

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇、碘、柱層析硅膠、薄層層析板、梨形漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、離心機(jī)。

2．發(fā)酵液的制備

用實(shí)施例5的方法制備發(fā)酵上清液。

3．萃取劑的選擇

分別選用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇四種有機(jī)溶劑作為發(fā)酵液的萃取劑，將發(fā)酵上清液和不同的萃取溶劑置于分液漏斗內(nèi)，上下顛倒、使其充分接觸混合，萃取3次，分離有機(jī)相、水相。取各有機(jī)溶劑萃取劑，以絲核菌wk207作為靶標(biāo)菌，采用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行生物活性測(cè)定，以未經(jīng)溶劑萃取的發(fā)酵液和無(wú)菌水作為對(duì)照，25℃恒溫培養(yǎng)5d，試驗(yàn)重復(fù)3次，觀察并記錄菌絲生長(zhǎng)直徑，對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性和相關(guān)性分析，比較各萃取溶劑間的抑菌效果，選取最佳的溶媒萃取劑。

試驗(yàn)結(jié)果表明，以乙酸乙酯為萃取劑的抑菌效果直徑最大，達(dá)32.50mm，這表明乙酸乙酯中活性物質(zhì)含量最高，見(jiàn)圖19。同時(shí)說(shuō)明拮抗放線菌fx-h-51菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)極性較高。

4.粗提物的制備

用乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵上清液按照少量多次的原則進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)有機(jī)相進(jìn)行濃縮，將濃縮物蒸干獲得膏狀物，即為抑菌組分粗提物。

5.抑菌活性物質(zhì)粗提物的薄層層析檢測(cè)

(1)點(diǎn)樣

首先將膏狀粗提物溶入乙酸乙酯中，點(diǎn)樣與距底邊2cm處的直線上，點(diǎn)的擴(kuò)散直徑不能超過(guò)3mm，如果在一個(gè)點(diǎn)上需要重復(fù)多次點(diǎn)樣，需等待上一次點(diǎn)樣的溶劑完全揮發(fā)后再進(jìn)行。點(diǎn)樣完成后，室溫下將薄層板晾干進(jìn)行展層。

(2)展層系統(tǒng)的選擇

薄層層析檢測(cè)的關(guān)鍵在于展開(kāi)劑的選擇，展開(kāi)劑的選擇要從樣品的極性、揮發(fā)性、溶解度等方面綜合考慮。通常展開(kāi)劑的展開(kāi)能力與溶劑極性成正比，rf值在0.3～0.5之間比較合適（王艷紅等，2006）。本著展開(kāi)劑極性大，加大極性低溶劑的比例或選用極性小的溶劑的原則試驗(yàn)，反之亦然。

本試驗(yàn)選用正丁醇︰甲醇︰水=4︰1︰2、石油醚︰環(huán)己烷=10︰1、氯仿︰甲醇=30︰1、氯仿︰甲醇=20︰1四種展開(kāi)體系進(jìn)行展開(kāi)劑的選擇。

不同極性的溶劑系統(tǒng)展層后，碘熏蒸法顯色見(jiàn)圖20。試驗(yàn)結(jié)果表明，一種溶劑比例的rf值過(guò)高，一種溶劑比例的rf值過(guò)低，其中以氯仿︰甲醇=20︰1層析效果較好，碘熏蒸后可以看到4個(gè)較為理想的斑點(diǎn)，rf值分別為0.49、0.39、0.23、0.09。

(3)展層

展層采用上行法，將點(diǎn)樣后的薄層層析板放入充滿(mǎn)飽和展開(kāi)劑蒸氣的層析缸中，一段時(shí)間后，用鉛筆標(biāo)記展開(kāi)劑前沿位置，利于計(jì)算rf值。展開(kāi)劑不要過(guò)多，應(yīng)在點(diǎn)樣線以下，以免影響展開(kāi)效果。展層結(jié)束后，將薄層層析板拿出，室溫自然風(fēng)干，進(jìn)行下一步檢測(cè)。

(4)檢測(cè)

檢測(cè)方法常用熒光顯影和碘熏蒸顯色法，本試驗(yàn)檢測(cè)使用碘熏蒸顯色法。將風(fēng)干的薄層層析板置于充滿(mǎn)飽和蒸氣的碘缸中，待顯色后，標(biāo)記棕黃色斑點(diǎn)位置，測(cè)量并計(jì)算相對(duì)遷移率rf值。

6.抑菌活性物質(zhì)粗提物的硅膠柱層析

(1)預(yù)處理

將濃縮后的粗提物與適量的200～300目的硅膠混合均勻，待有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后，備用。

(2)上樣洗脫

稱(chēng)取硅膠干法裝柱，加入粗提物干法拌樣。然后依次經(jīng)石油醚、石油醚︰氯仿(1︰1)、氯仿、氯仿︰乙酸乙酯(1︰1)、乙酸乙酯、丙酮和甲醇梯度洗脫。用的離心管或試管收集洗脫液，一管約收集12ml，共收集70管。tlc檢測(cè)分析洗脫液，展開(kāi)劑為氯仿︰甲醇（20︰1），從第一管開(kāi)始檢測(cè)，每隔一管點(diǎn)樣。檢測(cè)完畢后，合并rf值相同或相近的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。使用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定濃縮后不同組分的生物活性。

(3)色譜條帶的活性跟蹤

將具有高生物活性的組分在薄層層析板上點(diǎn)樣，以氯仿︰甲醇（20︰1）作為展開(kāi)劑，碘熏蒸染色，將相應(yīng)的條帶刮取下，用少量的乙酸乙酯溶解，檢測(cè)條帶的抑菌活性。

發(fā)酵粗提物經(jīng)過(guò)一次硅膠柱層析、tlc檢測(cè)結(jié)果如圖21，共有4個(gè)較為明顯的條帶，rf值分別為rf1=0.53、rf2=0.45、rf3=0.19、rf4=0.08。

表12色譜條帶活性跟蹤結(jié)果

分別將rf1、rf2、rf3編號(hào)為樣品1、樣品2、樣品3，相應(yīng)條帶刮下，以禾谷絲核菌為靶標(biāo)菌，對(duì)其進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，培養(yǎng)5天后，測(cè)定其抑菌效果，結(jié)果如圖22、表12所示，從表12可以看出，樣品2的抑菌作用相比其他樣品效果更好，抑菌直徑達(dá)到35.00mm，在5%的顯著水平上，樣品2與樣品1,3存在顯著差異。

(4)二次硅膠柱層析

以具有高生物活性的組分作為樣品，進(jìn)行二次硅膠柱層析純化，方法同上，收集洗脫液。tlc檢測(cè)分析洗脫液，合并rf值相同或相近的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。

(5)抑菌活性物質(zhì)的純度檢測(cè)

將分離純化得到的化合物單體，用tlc檢測(cè)，在碘缸中顯色進(jìn)行觀察，檢測(cè)其純度，若為單一斑點(diǎn)則為純化合物。

(6)放線菌fx-h-51菌株發(fā)酵產(chǎn)物中活性化合物抑菌活性測(cè)定

使用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法，絲核菌wk-207為靶標(biāo)菌，以加無(wú)菌水的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，25℃恒溫培養(yǎng)4d，觀察并測(cè)量菌絲直徑，進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

樣品2經(jīng)過(guò)二次硅膠柱層析、薄層制備以及tlc檢測(cè)，獲得抑菌效果良好的活性物質(zhì)a，經(jīng)碘熏蒸法檢測(cè)，活性物質(zhì)a純度較好。以禾谷絲核菌為靶標(biāo)菌，對(duì)活性物質(zhì)a進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖23和圖24，96h后純化產(chǎn)物的抑菌率達(dá)到76.47%。

sequencelisting

<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種拮抗放線菌及其應(yīng)用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1447

<212>dna

<213>海棠鏈霉菌（streptomycesspectabilis）的16srdna

<400>1

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