本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療和預(yù)防乙型肝炎病毒感染的喹嗪酮類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(hbv)作為一種部分雙鏈dna病毒，其復(fù)制需要經(jīng)過(guò)一個(gè)從rna中間體逆轉(zhuǎn)錄為dna的步驟。hbv基因組能夠編碼包括表面抗原(hbsag)在內(nèi)的多種抗原以及dna復(fù)制過(guò)程中所需的dna聚合酶等。
在hbv的致病過(guò)程中，如宿主免疫系統(tǒng)持續(xù)暴露于hbsag和其他抗原下，則可導(dǎo)致hbv特異性t細(xì)胞大量缺失或功能進(jìn)行性損傷(kondo,etal.journalofimmunology.1993,150:4659-4671；kondo,etal.journalofmedicalvirology.2004,74:425-433；fisicaro,etal.gastroenterology.2010,138:93-682.)，同時(shí)也可直接抑制宿主免疫系統(tǒng)的功能。故同時(shí)抑制hbv的dna復(fù)制和hbsag合成，這樣的靶向治療藥物能夠顯著改善chb患者的免疫再激活狀況并明顯緩解患者癥狀(wielandsfandfvchisari.jvirol.2005,79:80-9369；kumar,etal.jvirol.2011,85:95-987；woltman,etal.plosone.2011,6:e15324；opdenbrouw,etal.immunology.2009,126:9-280.)。
hbsag定量檢測(cè)作為評(píng)估慢性乙型肝炎預(yù)后及治療效果的重要生物標(biāo)志物之一，在慢性感染者中卻很少發(fā)現(xiàn)hbsag被完全清除，但這仍然是乙肝治療的最終目標(biāo)。但目前常用的抗病毒藥物如核苷(酸)類似物，主要作用是抑制hbv的dna合成，而無(wú)法降低體內(nèi)hbsag的水平。
專利文獻(xiàn)us2015/0210682a1、us2016/0122344a1、wo2015/173164、以及cn105899508a等公開了如式a所示的喹嗪酮類化合物，具有降低體內(nèi)hbsag水平的性能。
式a中的r1～r6參見上述專利中所定義。
其中，尤其是專利文獻(xiàn)cn105899508a公開的下式所示的化合物a1，能夠降低體內(nèi)hbsag水平。
最近公開的pct專利申請(qǐng)wo2017/017042a1中公開了式b所示的一類化合物，
該專利文獻(xiàn)公開的優(yōu)選化合物中，v和y均為ch2，如下式所示的化合物b1，
化合物b1中的喹嗪環(huán)與五元環(huán)共用的碳原子為手性碳，各有r和s兩種構(gòu)型，化合物b1為其中的兩種順式異構(gòu)體的外消旋體。而公開的化合物b1制備方法中，會(huì)得到化合物b1及其反式異構(gòu)體的混合體，需要通過(guò)手性制備分離才能得到化合物b1。該專利文獻(xiàn)同時(shí)對(duì)化合物b1及其異構(gòu)體進(jìn)行了生物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示化合物b1的抗hbv活性比其反式異構(gòu)體的抗hbv活性更加顯著。由于反式異構(gòu)體的存在，該專利文獻(xiàn)公開的方法制備順式的化合物b1產(chǎn)率較低。
另外，該專利文獻(xiàn)的生物實(shí)驗(yàn)還顯示，在抗hbv活性方面，當(dāng)w、x均為ch2或化學(xué)鍵時(shí)，通常比w、x中的一個(gè)為雜原子時(shí)要好。而且該專利中，并沒(méi)有公開v或y為o，s，so2和nr時(shí)的具體化合物，它們的抗hbv活性也不得而知，而且v或y為o，s，so2或nr的具體化合物很難通過(guò)該專利公開的制備方法進(jìn)行合成。
本領(lǐng)域技術(shù)人員一直致力于尋找新的具有更好抗hbv活性的喹嗪酮類化合物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在研發(fā)一類抗hbv活性總體效果好的以喹嗪酮為母體的新型化合物。
本發(fā)明人前期進(jìn)行了大量的合成和篩選工作，巧合的是得到的一些化合物在結(jié)構(gòu)上卻與最近公開的pct專利申請(qǐng)wo2017/017042a1中的化合物b1類似。同時(shí)，本發(fā)明也篩選出一類與wo2017/017042a1公開的具體化合物在結(jié)構(gòu)上有明顯區(qū)別的喹嗪酮類化合物，結(jié)構(gòu)如式ⅰ，明顯的區(qū)別在于式ⅰ中v和y不同時(shí)為ch2。
本發(fā)明在此提供這一種喹嗪酮類化合物，包括光學(xué)異構(gòu)體、外消旋體、順?lè)串悩?gòu)體以及任意組合或其藥用鹽，結(jié)構(gòu)如式??；
其中，
r1是氫，鹵素，氰基，c1-6烷基，c1-6烷基氨基或c1-6烷氧基；
r2是氫，鹵素，氰基，c1-6烷基，鹵代c1-6烷基，c3-7環(huán)烷基，羥基，c1-6烷氧基，鹵代c1-6烷氧基，氰基c1-6烷氧基或苯基c1-6烷氧基；
r3是氫，鹵素，氰基，c1-6烷基，鹵代c1-6烷基，c3-7環(huán)烷基，氨基，苯基c1-6烷基氨基，c1-6烷氧基羰基哌嗪基，羥基，c1-6烷氧基，鹵代c1-6烷氧基，c1-6烷氧基c1-6烷氧基，c1-6烷氧基c1-6烷氧基c1-6烷氧基，c1-6烷基羰基氨基c1-6烷氧基，c1-6烷基磺?；被鵦1-6烷氧基，c1-6烷基磺?；鵦1-6烷氧基，氰基c1-6烷氧基，氰基c3-7環(huán)烷基c1-6烷氧基，c3-7環(huán)烷基c1-6烷氧基，羥基c1-6烷氧基，雜芳基c1-6烷氧基，苯基c1-6烷氧基，雜環(huán)烷基c1-6烷氧基，雜環(huán)烷基羰基c1-6烷氧基；
r4是氫，鹵素，氰基，c1-6烷基，c1-6烷基氨基或c1-6烷氧基；
r5是氫或c1-6烷基；
r6是氫或c1-6烷基；
r7是氫、鹵素或c1-6烷基；
v和y中的一個(gè)是o，v和y中的另一個(gè)是cr8r9，其中r8和r9分別獨(dú)立地是氫或c1-6烷基。
本發(fā)明的一些較佳實(shí)施例中，
r1優(yōu)選是氫，氟，氯，溴，甲基，甲基氨基，甲氧基或乙氧基；更優(yōu)選是氫。
r2優(yōu)選是氫，氟，氯，溴，甲基，乙基，三氟甲基，甲氧基，乙氧基，丙氧基，三氟甲氧基，氰基，環(huán)丙基，羥基或苯基甲氧基；更優(yōu)選是甲氧基，乙氧基，丙氧基，三氟甲氧基或苯基甲氧基；更進(jìn)一步優(yōu)選是甲氧基。
r3優(yōu)選是氫，溴，甲基，乙基，異丙基，氰基，苯基甲基-n(甲基)-，叔丁氧基羰基哌嗪基，羥基，甲氧基，乙氧基，丙氧基，異丙氧基，異丁氧基，丁氧基，二氟甲基甲氧基，三氟甲基甲氧基，甲氧基乙氧基，甲氧基丙氧基，乙氧基乙氧基，甲氧基乙氧基乙氧基，甲基羰基氨基乙氧基，甲基磺?；被已趸?，甲基磺?；已趸杌籽趸?，氰基丙氧基，氰基環(huán)丙基甲氧基，環(huán)丙基甲氧基，環(huán)己基乙氧基，羥基乙氧基，羥基丙氧基，咪唑基乙氧基，嗎啉基乙氧基，2-氧代-吡咯烷-1-基乙氧基，苯基甲氧基，苯基乙氧基，吡咯烷基乙氧基，吡咯烷基羰基甲氧基或四氫吡喃-4-基甲氧基；更優(yōu)選是甲氧基丙氧基。
r4是氫，氟，氯，溴，甲基，甲基氨基，甲氧基或乙氧基；更優(yōu)選是氫。
r5優(yōu)選是氫或甲基，更優(yōu)選是甲基。
r6優(yōu)選是氫或甲基，更優(yōu)選是甲基。
r7優(yōu)選是氫，氟，氯，溴，甲基；更優(yōu)選是氫。
優(yōu)選的v是o，y是cr8r9，或者優(yōu)選的v是cr8r9，y是o；其中r8和r9分別獨(dú)立地優(yōu)選是氫或甲基，更優(yōu)選是氫。
當(dāng)然，本發(fā)明的上述各個(gè)基團(tuán)不限于上述的優(yōu)選基團(tuán)，而且各個(gè)優(yōu)選基團(tuán)可任意組合。
本發(fā)明式ⅰ化合物中，喹嗪環(huán)與五元雜環(huán)共用的碳原子為手性碳，各有r和s兩種構(gòu)型，存在兩種順式異構(gòu)體和兩種反式異構(gòu)體，其外消旋體可通過(guò)手性制備分離得到單一光學(xué)純化合物。
本發(fā)明的某些化合物可按照常規(guī)方法制備為藥用鹽的形式。包括其有機(jī)酸鹽及無(wú)機(jī)酸鹽：無(wú)機(jī)酸包括(但不限于)鹽酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氫溴酸、硝酸等，有機(jī)酸包括(但不限于)乙酸、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、對(duì)甲苯磺酸、水楊酸、草酸等。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，r1是氫；r2是甲氧基；r3是甲氧基丙氧基；r4是氫；r5是甲基；r6是甲基；r7是氫；v是ch2，y是o；其結(jié)構(gòu)如下，
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，r1是氫；r2是甲氧基；r3是甲氧基丙氧基；r4是氫；r5是甲基；r6是甲基；r7是氫；v是o，y是ch2；其結(jié)構(gòu)如下，
其中兩個(gè)順式的異構(gòu)體cis-(+)-10-甲氧基-11-(3-甲氧基丙氧基)-3,3-二甲基-7-氧代-3,3a,7,12b-四氫-2h-呋喃并[3,2-c]吡啶并[2,1-a]異喹嗪-6-甲酸，和cis-(-)-10-甲氧基-11-(3-甲氧基丙氧基)-3,3-二甲基-7-氧代-3,3a,7,12b-四氫-2h-呋喃并[3,2-c]吡啶并[2,1-a]異喹嗪-6-甲酸結(jié)構(gòu)如下所示，它們?cè)诮档腕w內(nèi)hbsag水平方面具有顯著的效果。
本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)當(dāng)v和y中的一個(gè)為o時(shí)，式ⅰ的化合物與hbv病毒結(jié)合的效率更高，可進(jìn)一步提高體內(nèi)hbv病毒的清除率。此外，當(dāng)v和y中的一個(gè)為o時(shí)，化合物能夠顯著改善包括溶解性在內(nèi)的一系列物理、化學(xué)性質(zhì)，使其具有良好的藥用屬性，同時(shí)亦將明顯降低其毒性，改善其藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)功能。
本發(fā)明的另一目的在于提供制備式ⅰ的化合物的方法，其包括步驟：式ⅱ的化合物的水解得到式ⅰ的化合物，
其中，r1～r7、v和y如上述定義，r10為c1-6烷基優(yōu)選甲基。
本發(fā)明的一些較佳實(shí)施例中，v為氧，y為cr8r9，所述方法還包括步驟：式ⅳ的化合物經(jīng)氫化還原得到式ⅲ的化合物，以及式ⅲ的化合物經(jīng)氧化環(huán)化得到式ⅱ的化合物，
其中，r8、r9如上述定義。
式ⅲ的化合物經(jīng)氧化環(huán)化得到式ⅱ的化合物的步驟可具體為：在溶劑中，式ⅲ的化合物在氧化劑作用下、電氧化還原條件下或光氧化還原條件下被氧化后，用酸處理得到成環(huán)的式ⅱ的化合物；其中，所述溶劑選自乙腈、水、乙醇和二氯甲烷中一種或多種，所述氧化劑選自kmno4、k2s2o8、ddq(2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌)、can(硝酸鈰銨)、cuso4和phi(oac)2中的一種或多種，所述的酸選自h2so4、hcl和hac中的一種或多種。
上述氧化環(huán)化時(shí)可高度選擇性地生成順式的結(jié)構(gòu)，避免出現(xiàn)順式和反式結(jié)構(gòu)的混合體，而得到的順式的結(jié)構(gòu)還可通過(guò)手性制備進(jìn)一步得到效果更好的光學(xué)純的化合物。當(dāng)使用的式ⅳ的化合物為光學(xué)純化合物時(shí)，最后得到的即為無(wú)需進(jìn)行手性拆分的光學(xué)純的目標(biāo)化合物。
本發(fā)明的再一目的在于提供式ⅰ的化合物，包括光學(xué)異構(gòu)體、外消旋體、順?lè)串悩?gòu)體以及任意組合或其藥用鹽，在制備抗hbv藥物中的應(yīng)用。
進(jìn)一步，所述的抗hbv藥物為抑制hbsag合成或分泌，同時(shí)抑制hbv病毒復(fù)制的藥物。
進(jìn)一步，所述的抗hbv藥物為片劑、粉劑、膠囊、溶液、分散體、混懸劑、糖漿、噴霧劑、栓劑、凝膠、乳液或貼劑。
所述的抗hbv藥物可用于治療和預(yù)防乙型肝炎病毒感染。
本發(fā)明的有益效果在于：
1、本發(fā)明的式ⅰ的化合物能夠顯著降低體內(nèi)hbsag水平，同時(shí)抑制hbv病毒的復(fù)制，可用于制備治療和預(yù)防乙型肝炎病毒感染的藥物。式ⅰ中v或y為o時(shí)，其溶解性得到顯著改善，具有良好的藥用屬性，同時(shí)毒性也較低，藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)功能得到改善，其與hbv病毒結(jié)合的效率可大大增加，體內(nèi)hbv病毒的清除率也可進(jìn)一步提高。
2、本發(fā)明式ⅰ的化合物的制備方法，只需通過(guò)氫化、氧化環(huán)化以及水解等反應(yīng)，而且在氧化環(huán)化反應(yīng)中，相比于專利文獻(xiàn)wo2017/017042a1公開的化合物b1的制備方法，立體選擇性更高，可選擇性的得到抗hbv活性更高的順式的結(jié)構(gòu)，避免出現(xiàn)順式和反式結(jié)構(gòu)的混合體，而得到的順式的結(jié)構(gòu)還可通過(guò)手性制備進(jìn)一步得到效果更好的光學(xué)純的化合物。整個(gè)制備過(guò)程每一步的產(chǎn)率均較高，總體生產(chǎn)成本低廉、工藝簡(jiǎn)單、選擇性高、異構(gòu)體含量低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1cis-10-甲氧基-11-(3-甲氧基丙氧基)-3,3-二甲基-7-氧代-3,3a,7,12b-四氫-2h-呋喃并[3,2-c]吡啶并[2,1-a]異喹嗪-6-甲酸
合成路線如下：
步驟1：制備6-(2-羥基-1,1-二甲基-乙基)-10-甲氧基-9-(3-甲氧基丙氧基)-2-氧代-6,7-二氫苯并[a]喹嗪-3-甲酸乙酯
將6-(2-芐氧基-1,1-二甲基-乙基)-10-甲氧基-9-(3-甲氧基丙氧基)-2-氧代-6,7-二氫苯并[a]喹嗪-3-甲酸乙酯(1.65g，3mmol，制備參考專利文獻(xiàn)us20160122344a1)，以及pd/c(10％)(0.5g)緩慢加入乙醇(200ml)中，在氫氣氛下加壓，機(jī)械攪拌，得到粗制6-(2-羥基-1,1-二甲基-乙基)-10-甲氧基-9-(3-甲氧基丙氧基)-2-氧代-6,7-二氫苯并[a]喹嗪-3-甲酸乙酯(1.10g，收率約79.7％)，未經(jīng)純化直接用于下一步驟。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.43(s,1h),7.12(s,1h),6.89(s,1h),6.71(s,1h),4.44(d,1h),4.37(q,2h),4.15(q,2h),3.89(s,3h),3.57(m,2h),3.39(d,1h),3.36(s,4h),3.29(q,2h),3.07(m,1h),3.07(d,1h),2.13(m,2h),1.37(t,3h),0.87(s,3h),0.49(s,3h).esi-ms(m/z):460.2[m+1]+.
步驟2：制備cis-10-甲氧基-11-(3-甲氧基丙氧基)-3,3-二甲基-7-氧代-3,3a,7,12b-四氫-2h-呋喃并[3,2-c]吡啶并[2,1-a]異喹嗪-6-甲酸乙酯
將6-(2-羥基-1,1-二甲基-乙基)-10-甲氧基-9-(3-甲氧基丙氧基)-2-氧代-6,7-二氫苯并[a]喹嗪-3-甲酸乙酯(0.92g，2mmol)溶于乙腈(282ml)中，加入預(yù)先配制好的溶液(1.1g的k2s2o8與0.43g的cuso4溶于57ml水)，將所得混合物加熱回流1-2小時(shí)，自然冷卻后，過(guò)濾以除去固體。向?yàn)V液中加入乙酸乙酯(300ml)，接著將合并的有機(jī)層用飽和nacl溶液洗滌，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，將所得固體溶于乙酸(7ml)中，在機(jī)械攪拌下逐滴加入濃硫酸(0.3ml)，在室溫下攪拌0.5-1小時(shí)。將混合物用乙酸乙酯(300ml)稀釋，接著將合并的有機(jī)層用飽和nahco3溶液、飽和nacl溶液洗滌，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，通過(guò)柱色譜(流動(dòng)相：乙醇/乙酸乙酯)，純化得到cis-10-甲氧基-11-(3-甲氧基丙氧基)-3,3-二甲基-7-氧代-3,3a,7,12b-四氫-2h-呋喃并[3,2-c]吡啶并[2,1-a]異喹嗪-6-甲酸乙酯(460mg，收率50.2％)。
步驟3：制備cis-10-甲氧基-11-(3-甲氧基丙氧基)-3,3-二甲基-7-氧代-3,3a,7,12b-四氫-2h-呋喃并[3,2-c]吡啶并[2,1-a]異喹嗪-6-甲酸
將cis-10-甲氧基-11-(3-甲氧基丙氧基)-3,3-二甲基-7-氧代-3,3a,7,12b-四氫-2h-呋喃并[3,2-c]吡啶并[2,1-a]異喹嗪-6-甲酸乙酯(230mg，0.5mmol)加入3ml的thf/水(體積比：thf:h2o＝1:1)的溶液中，再向溶液中加入naoh(80mg)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后加入乙酸乙酯(50ml)，接著加入1mol/l的鹽酸以將溶液的ph調(diào)節(jié)至3-4，干燥濃縮，通過(guò)柱色譜純化(流動(dòng)相：異丙醇/乙酸乙酯)得到固體化合物ⅰa，即cis-10-甲氧基-11-(3-甲氧基丙氧基)-3,3-二甲基-7-氧代-3,3a,7,12b-四氫-2h-呋喃并[3,2-c]吡啶并[2,1-a]異喹嗪-6-甲酸(118mg，收率54.9％)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.38(s,1h),7.18-7.10(m,3h),5.54(d,1h),4.38(d,1h),4.21(q,2h),3.94(s,3h),3.77(d,1h),3.58(td,2h),3.44(d,1h),3.37(s,3h),2.15(t,2h),1.39(s,3h),0.59(s,3h).esi-ms(m/z):430.4[m+1]+.
化合物ⅰa為外消旋體，化合物ⅰa(1g)通過(guò)手性hplc進(jìn)一步分離得到兩種光學(xué)異構(gòu)體ⅰb(320mg)和ⅰc(310mg)，
化合物ⅰb和ⅰc的核磁氫譜、質(zhì)譜相同：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.38(s,1h),7.18-7.10(m,3h),5.54(d,1h),4.38(d,1h),4.21(q,2h),3.94(s,3h),3.77(d,1h),3.58(td,2h),3.44(d,1h),3.37(s,3h),2.15(t,2h),1.39(s,3h),0.59(s,3h).esi-ms(m/z):430.4[m+1]+.
生物學(xué)實(shí)施例
1、hbv細(xì)胞系
hepg2.2.15細(xì)胞，一種hbv-表達(dá)細(xì)胞系在rpmi1640培養(yǎng)基(北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％胎牛血清(gemini)和最終濃度為200mg/l的g418(gibco)，并保存在5％co2，37℃的環(huán)境中。
2、mtt法檢測(cè)樣品對(duì)hepg2.2.15細(xì)胞的毒性作用
將對(duì)數(shù)期的hepg2.2.15細(xì)胞懸液(8×104cell/ml)接種到96-孔板中(100μl/孔)，邊緣用無(wú)菌pbs填充，常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞單層貼壁均勻生長(zhǎng)，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μl含有多種濃度的化合物ⅰa的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照組(不含測(cè)試化合物的培養(yǎng)基)。
培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入20μl的含有mtt(biosharp公司生產(chǎn))的pbs緩沖液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，小心棄去各孔的培養(yǎng)基，加入150μl的dmso，置搖床上低速震蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀(biorad，jp，型號(hào)：680-18622)檢測(cè)各孔吸光度od值(檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm，參考波長(zhǎng)為630nm)。根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率，進(jìn)而可得出化合物ⅰa抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)毒性濃度cc50值：
抑制率(％)＝(1-給藥孔o(hù)d值/對(duì)照孔o(hù)d值)×100
表1化合物ⅰa對(duì)hepg2.2.15細(xì)胞的毒性數(shù)據(jù)
由表1結(jié)果可知，化合物ⅰa對(duì)hepg2.2.15細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度cc50達(dá)到538.5μm，可見化合物ⅰa對(duì)hepg2.2.15細(xì)胞的毒性較小。
3、elisa法檢測(cè)樣品對(duì)hbsag分泌的抑制作用
hbsag測(cè)定
將對(duì)數(shù)期的hepg2.2.15細(xì)胞懸液(2.5×104cell/ml)接種到24-孔板中(1ml/孔)，培養(yǎng)24小時(shí)后，吸去培養(yǎng)基，加入含有多種濃度的化合物ⅰa的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照組(不含測(cè)試化合物的培養(yǎng)基)、陽(yáng)性對(duì)照組1(含0.1μm的恩替卡韋etv(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：aak4193)的培養(yǎng)基)、陽(yáng)性對(duì)照組2(含有多種濃度的化合物a1的培養(yǎng)基)和陽(yáng)性對(duì)照組3(含有多種濃度的化合物b1的培養(yǎng)基)。
常規(guī)培養(yǎng)，收集上清，-20℃保存。
使用hbsag抗原檢測(cè)試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司，批號(hào)：201608302)來(lái)半定量地測(cè)量分泌的hbv抗原的水平。對(duì)于該檢測(cè)，將75μl的培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移至測(cè)定板，同時(shí)設(shè)置陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照組，將板密封并在37℃孵育1小時(shí)。撕去封片，將50μl的酶軛合物試劑添加到每個(gè)孔中。將板密封并在37℃孵育半小時(shí)。拋棄上清-酶-混合物并將孔用工作濃度洗滌液(以純化水25倍稀釋)洗滌5次，將殘余液體在吸水薄頁(yè)紙上拍干。向每個(gè)孔中添加50μl的底物a和b。在30分鐘溫育之后，每孔加入50μl的終止液，充分混勻，使用酶標(biāo)儀(biorad，jp，型號(hào)：680-18622)檢測(cè)各孔吸光度od值(檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm，參考波長(zhǎng)為630nm)。根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率：
hbsag分泌抑制率(％)＝(1-給藥孔o(hù)d值/對(duì)照孔o(hù)d值)×100
進(jìn)而得出測(cè)試化合物抑制hbsag分泌的半數(shù)抑制濃度ic50值(ic50定義為相比于空白對(duì)照，hbsag分泌減少50％情況下的化合物濃度)。
表2特定物質(zhì)的活性數(shù)據(jù)
由表2結(jié)果可知，本發(fā)明的化合物ⅰa的抑制hbsag分泌的半數(shù)抑制濃度ic50值遠(yuǎn)低于對(duì)照化合物a1和b1，抗hbv活性更加顯著。
綜上，本發(fā)明的化合物ⅰa不僅細(xì)胞毒性較低，而且相比于結(jié)構(gòu)最為接近的化合物b1，其中五元環(huán)中的氧原子使其溶解性得到顯著改善，具有良好的藥用屬性，藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)功能得到改善，其與hbv病毒結(jié)合的效率可大大增加，體內(nèi)hbv病毒的清除率也可進(jìn)一步提高，該化合物能夠顯著降低體內(nèi)hbsag水平，同時(shí)抑制hbv病毒的復(fù)制，可用于制備治療和預(yù)防乙型肝炎病毒感染的藥物。
以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。