本發(fā)明涉及微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以一種堿性蛋白酶的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

堿性蛋白酶，指在堿性條件下能夠水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶，堿性蛋白酶在各領(lǐng)域都應(yīng)用很廣泛，在工業(yè)、食品等領(lǐng)域都有十分廣闊的應(yīng)用市場。在工業(yè)上的主要是用于制造加酶洗滌劑，其有助于去除血漬、汗?jié)n等蛋白質(zhì)污垢，還用于輕紡工業(yè)，最常用于絹絲脫膠羊毛的防縮等。在食品方面的應(yīng)用包括蛋白類食品的發(fā)酵、肉類的嫩化、酒精的澄清等。蛋白酶的研究和應(yīng)用已經(jīng)有很長的歷史，但是，隨著社會的進(jìn)步，科技的不斷發(fā)展，對蛋白酶的研究會有更廣闊的范圍。我國人口眾多，每年對堿性蛋白酶的需求量很大，因此，如何用低成本生產(chǎn)出高活性的堿性蛋白酶，是需要迫切解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提高堿性蛋白酶的產(chǎn)酶水平，提供一種堿性蛋白酶的生產(chǎn)方法。

本發(fā)明提供的堿性蛋白酶的生產(chǎn)方法，以地衣芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，是將地衣芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)中使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分包括蛋白胨、酵母浸粉、糊精、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈣、氯化鈷、豆粕和水；所述補(bǔ)充培養(yǎng)基成分包括糊精和蛋白胨。

相較于其它的地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基，本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基中富含地衣芽孢桿菌生長和表達(dá)堿性蛋白酶所需的營養(yǎng)成分。采用發(fā)明中的培養(yǎng)基配方和補(bǔ)料工藝能顯著的延長地衣芽孢桿菌的生長周期，降低其芽孢產(chǎn)生率，并達(dá)到地衣芽孢桿菌高產(chǎn)堿性蛋白酶的效果。

優(yōu)選地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中各成分用量為：蛋白胨15～20g/L，酵母浸粉5～15g/L，糊精25～35g/L，磷酸氫二鈉2～5g/L，磷酸二氫鉀2～5g/L，硫酸鎂0.5～0.8g/L，硫酸錳0.4～0.6g/L，氯化鈣0.1～0.3g/L，氯化鈷0.03～0.07g/L，豆粕3～7g/L。

優(yōu)選地，補(bǔ)充培養(yǎng)基中糊精含量為發(fā)酵液總質(zhì)量的3～4％，蛋白胨含量為發(fā)酵液總質(zhì)量的1％。

優(yōu)選地，在發(fā)酵培養(yǎng)之前，還包括菌種的活化、搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)的步驟；其中，搖瓶培養(yǎng)使用搖瓶培養(yǎng)基，成分包括蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉和葡萄糖。

優(yōu)選地，搖瓶培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量為10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化鈉10g/L，葡萄糖20g/L。

優(yōu)選地，菌種的活化是取保存的地衣芽孢桿菌菌種在LB平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時。

優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37℃，通氣量0.5V/V·min，攪拌200轉(zhuǎn)/分鐘。

優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)先使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)36小時后，加入補(bǔ)充培養(yǎng)基，調(diào)整發(fā)酵液溶氧量在9～11％，用氨水調(diào)節(jié)pH值在6.3～6.8，直到發(fā)酵結(jié)束。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過在發(fā)酵過程中使用專門適用于地衣芽孢桿菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)后期補(bǔ)充糖和氮源，經(jīng)過60小時發(fā)酵得到的發(fā)酵液中堿性蛋白酶酶活5萬u/毫升以上。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1：地衣芽孢桿菌的堿性蛋白酶發(fā)酵

(1)菌種活化：將斜面保存的菌種挑取單菌落接種在LB平板(常規(guī)方法配制)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時；

(2)搖瓶培養(yǎng)：將活化后的菌種接種在成分包括蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化鈉10克/升，葡萄糖20克/升的搖瓶培養(yǎng)基中，在37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24小時；

(3)種子罐培養(yǎng)：以5％的接種量將搖瓶種子液接種到成分為蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，糊精30克/升，磷酸氫二鈉3克/升，磷酸二氫鉀3克/升，硫酸鎂0.7克/升，硫酸錳0.5克/升，氯化鈣0.2克/升，氯化鈷0.05克/升，豆粕5克/升的種子罐培養(yǎng)基中，在37℃，通氣量1(V/V·min)，攪拌200轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)12小時；

(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：以10％的接種量將二級種子罐種子液轉(zhuǎn)入成分為蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，糊精30克/升，磷酸氫二鈉3克/升，磷酸二氫鉀3克/升，硫酸鎂0.7克/升，硫酸錳0.5克/升，氯化鈣0.2克/升，氯化鈷0.05克/升，豆粕5克/升的發(fā)酵培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在溫度37℃，通氣量0.5(V/V·min)，攪拌200轉(zhuǎn)/分鐘，罐壓0.05Mpa條件下進(jìn)行發(fā)酵；其中用氨水控制發(fā)酵液pH值在6.3～6.8范圍內(nèi)。發(fā)酵開始36小時后，用成分為糊精含量為發(fā)酵液總量3～4％，蛋白胨含量為發(fā)酵液總量1％的混合培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基補(bǔ)糖和氮源，補(bǔ)糖后培養(yǎng)液溶氧控制在10％左右，直至發(fā)酵結(jié)束。

經(jīng)過上述條件的培養(yǎng)，60小時發(fā)酵液中堿性蛋白酶酶活53645u/毫升，遠(yuǎn)高于一般發(fā)酵能達(dá)到的1400u/毫升左右的水平。

以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳實施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。