專利名稱：微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生產(chǎn)工藝的制作方法
微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生產(chǎn)工藝
本發(fā)明涉及一種堿性蛋白酶的生產(chǎn)工藝，尤其是涉及一種微生物發(fā)酵法生 產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
隨著化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)品的種類和產(chǎn)量的增加，其施用范圍也不斷擴(kuò)大，農(nóng)藥殘 留已對(duì)人類和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的威脅，而生物農(nóng)藥由于其高效、安全、無(wú)毒、 尤殘留、無(wú)環(huán)境污染的優(yōu)點(diǎn)，己成為農(nóng)業(yè)發(fā)展中最為活躍的研究領(lǐng)域。近十多 年來(lái)，由于各國(guó)的重視，生物農(nóng)藥研究和生產(chǎn)都有了很大的發(fā)展，目前化學(xué)農(nóng) 藥每年以2%的速度遞減，而生物農(nóng)藥卻以5%的速度遞增。特別是我國(guó)作為農(nóng)業(yè)
大國(guó)，在'2001年加入WTO后面對(duì)著國(guó)際市場(chǎng)上激烈的競(jìng)爭(zhēng)，微生物資源在農(nóng)業(yè) 上的開發(fā)和利用也迎來(lái)了前所未有的歷史機(jī)遇和挑戰(zhàn)，其發(fā)展將有利于解決當(dāng) 前農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境中的難點(diǎn)問(wèn)題。為了保護(hù)生態(tài)環(huán)境和實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展， 開發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微生物農(nóng)藥顯得意義深遠(yuǎn)，且具有廣闊的市場(chǎng)價(jià)值 和應(yīng)用前景。
微生物殺蟲劑具有無(wú)污染、無(wú)殘留和對(duì)人體危害小等特點(diǎn)，但也存在作用 時(shí)間長(zhǎng)、侵染力弱、殺蟲效果遲緩等缺點(diǎn)。而許多細(xì)菌能夠分泌堿性蛋白酶， 降解昆蟲寄主的表皮蛋白質(zhì)，協(xié)助菌體侵入蟲體，提高殺蟲劑的毒力，克服生
物殺蟲劑遲效和不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。因此可在生物殺蟲劑中添加堿性蛋白酶，開發(fā) 出高效的生物農(nóng)藥。同時(shí)堿性蛋白酶還在醫(yī)學(xué)上作為生化藥物，在食品工業(yè)中 作為嫩化劑、沉淀劑等廣泛使用，甚至在日用品工業(yè)中用作美容產(chǎn)品添加劑。
目前，國(guó)內(nèi)外大多利用動(dòng)物胰臟來(lái)提取生產(chǎn)，成本高，產(chǎn)量有限，限制了 該酶的應(yīng)用范圍。而采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶周期短、營(yíng)養(yǎng)需求低、提 取工藝簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)，不受原料限制而進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，對(duì)國(guó)家的 可持續(xù)發(fā)展策略具有深遠(yuǎn)的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述背景技術(shù)中的不足之處，提供一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn) 枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生產(chǎn)工藝，其采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶，周 期短，營(yíng)養(yǎng)需求低，提取工藝簡(jiǎn)單，降低了成本，同時(shí)提高了蛋白酶的回收率。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
- 一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生產(chǎn)工藝，其特征在于 包括以下步驟-
(1) 菌種培養(yǎng)采用種子培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
(2) 發(fā)酵培養(yǎng)基配制；
(3) 發(fā)酵將枯草芽孢桿菌菌種接入搖瓶，進(jìn)行發(fā)酵得發(fā)酵液；
(4) 粗提發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后離心，脫色，過(guò)濾和減壓干燥得粗品堿性蛋
白酶；
(5) 精制粗品經(jīng)純化溶解后，鹽析，透析，超濾濃縮，凝膠過(guò)濾層析，
然后干燥濃縮得成品。 步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖1.2%+蔗糖0.6% +淀粉1.2%，
豆餅粉3. 0%，酵母粉0. 3%， K2HP04 3H200. 2% ,其余以蒸餾水補(bǔ)充。
步驟(3)中發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間36h，溫度36。C，初始最佳PH值8.0，搖
瓶轉(zhuǎn)速150 r/min。
步驟(3)中枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法為
(1) :菌種培養(yǎng)基選用采用LB液體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨10g/L+酵母提取物5g /L+NaCl 5g/L+蒸餾水
(2) :將配置好的LB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)PH至7.8,分裝三角瓶，在O. 105Mpa蒸 f二壓力滅菌30min，自然冷卻至45°C， 24h后無(wú)菌條件下接種枯草芽孢桿菌菌種， 38。C下170 r/min搖床培養(yǎng)36-38h;
(3) :無(wú)菌條件下將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液接入發(fā)酵培養(yǎng)基。 在發(fā)酵液中加入植物油作為消泡劑，加入量為0. 3%(w/w)
發(fā)酵液的處理和產(chǎn)品制備過(guò)程為
(1) 發(fā)酵液的預(yù)處理
取發(fā)酵完畢的發(fā)酵液100ml，加入絮凝劑NaA102，室溫?cái)嚢?min后靜置待 分層；絮凝劑NaA102的用量以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)O. 1%—0. 15%為宜；
(2) 離心
將預(yù)處理后的發(fā)酵液的上清液裝入離心管，在4卩條件下8000r/min離心 8min;
(3) 脫色
向離心液中加入1%的中顆?；钚蕴?，用水浴加熱至9(TC，保溫?cái)嚢?0分
鐘，趁熱過(guò)濾，如濾液顏色加重，可用活性炭再度脫色，直至濾液為無(wú)色或微
黃色為止；
(5) 紙板過(guò)濾過(guò)濾紙板由孔徑30 50iim的棉花纖維、石棉和硅藻土組 成，紙板過(guò)濾機(jī)的壓力為0.3 MPa，取濾液低溫千燥可得粗蛋白酶；
(6) 鹽析
將硫酸銨晶體磨成粉末，在冰浴條件下邊攪拌邊加入pH為7. 8的粗蛋白酶 辨液中，然后繼續(xù)攪拌lh放置于4X:條件下4000r/min離心30min，收集沉淀， 溶于定量緩沖液中；
(7) 透析
將鹽析獲得的沉淀物溶解于裝有O. 2mol/LpH7. 4硼酸緩沖液中的透析袋中， 扎好兩端，置于IO倍酶液體積的蒸餾水中4'C透析過(guò)夜，其間需換水4次，最 后以飽和BaCU來(lái)檢測(cè)硫酸銨是否透析完全；<formula>formula see original document page 9</formula>
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將透析所得酶液置于超濾容器中在4。C的環(huán)境中，在氮?dú)鈮毫?. 5個(gè)大氣壓 力下，用截留分子量為10萬(wàn)的膜超濾5h，收集截留的液體；
(9)離子交換柱層析
選用陰離子交換樹脂DEAE-S印hadex A50作為填充介質(zhì)，將DEAE-S印hadex A50用蒸餾水充分溶脹，采用浮選法除去過(guò)細(xì)的粒子，放置一定時(shí)間后，倒去上 清液，至上清液不含細(xì)粒為止；用0. lmol/LHCL浸泡20min，再用0. lmol/LNaOH 浸泡20min，最后用0. 1 mol/LHCL浸泡20min;用上柱緩沖夜平衡幾次，抽真
空，然后采用快速裝柱法裝入樹脂，避免產(chǎn)生氣泡；用洗脫液平衡若干天；洗 脫液為50mmol/L， pH7. 4的Tris-HCL緩沖液，洗脫速度為2. 8ml/10min，每十分 鐘收集-一管；收集蛋白酶活性峰，濃縮。
(10) S印hadexG 一 75凝膠柱層析
在低溫4'C的環(huán)境下，選擇SephadexG — 75作為填充介質(zhì)；稱取一定量的 S印hadexG — 75在沸水中充分溶脹，冷卻，裝柱；將DEAE-S印hadex A50收集 到的活性峰濃縮后上樣；用O. lmol/LpH7.4的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫 速度為0.5ml/min，用核酸/蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)，收集含堿性蛋白酶活性組分，然
后冷凍干燥濃縮于4r保存。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下
1、 制備簡(jiǎn)單。工藝簡(jiǎn)單，設(shè)備要求一般，操作過(guò)程可人為控制，便于管理 和質(zhì)量控制。
2、 產(chǎn)量高。對(duì)菌種發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，發(fā)酵液活性物質(zhì)的產(chǎn)最達(dá)最高。
3、 回收率高。將傳統(tǒng)提取工藝與現(xiàn)代工藝相結(jié)合，采用絮凝、鹽析，凝膠 層析等技術(shù)，大大提高回收率。
4、 具有迅速的資源再生性。整個(gè)工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，并可對(duì)工藝 條件進(jìn)行改造，原材料可重復(fù)利用。
5、 生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)安全、排污少，且天然產(chǎn)物容易降解、無(wú)積累、選擇 性高，不會(huì)對(duì)環(huán)境構(gòu)成危害。
6、 針對(duì)不同領(lǐng)域的需求生產(chǎn)相應(yīng)的產(chǎn)品，最大程度減輕能耗。 四

圖1為發(fā)酵產(chǎn)物的提取和純化流程圖； 圖2為發(fā)酵生產(chǎn)流程框圖。
五具體實(shí)施例方式
彈性蛋白酶(Elastase)是一種以水解不溶性彈性硬蛋白(elastin)為特征 的蛋白水解酶，它可由動(dòng)物胰臟提取或由微生物發(fā)酵制得。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝 為用枯草芽孢桿菌BQ-An作為生產(chǎn)菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵得發(fā)酵液，發(fā)酵液通過(guò) 預(yù)處理、離心、脫色、過(guò)濾、鹽析、透析、超濾、凝膠過(guò)濾層析后真空冷凍干 燥得純的堿性蛋白酶成品。具體工藝過(guò)程
1、 菌種培養(yǎng)
將菌種BQ-An活化并擴(kuò)大培養(yǎng)；
2、 配制發(fā)酵培養(yǎng)基
以最佳營(yíng)養(yǎng)條件配制菌株發(fā)酵培養(yǎng)基；
3、 發(fā)酵
將在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后菌液于無(wú)菌條件下，接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基 的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵；
4、 提取
發(fā)酵液通過(guò)預(yù)處理、離心、脫色、過(guò)濾、鹽析、透析、超濾、凝膠過(guò)濾層 析后，真空冷凍干燥得堿性蛋白酶成品。
實(shí)施例 ,(1)菌種培養(yǎng)
①種子培養(yǎng)基
LB液體培養(yǎng)基蛋白胨IO g，酵母浸膏5 g， NaCl 10 g，水l L， pH7. 0， 121 。C高壓滅菌30 min。
②擴(kuò)大培養(yǎng)
用接種環(huán)挑取保存在斜面上的BQ-An菌株菌泥一環(huán)，接種于裝有100 mL種 子培養(yǎng)基的250 mL三角培養(yǎng)瓶中。在38。C恒溫?fù)u床160 r/min條件下培養(yǎng)36-38h。
(2) 發(fā)酵培養(yǎng)基配制
a:發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方(w/w)為葡萄糖1.2% +蔗糖0.6%+淀粉1.2%， 豆餅粉3%，酵母粉O. 3%， K2HP04'3H20 0.2% ;其余以蒸餾水補(bǔ)充。b:將按上 述配方配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)PH至7. 8，分裝三角瓶，在0. 105Mpa蒸汽壓力 滅菌30min，自然冷卻至45°C， 24h后無(wú)菌條件下接種枯草芽孢桿菌菌種，38 。C下170 r/min搖床培養(yǎng)36-38h。
(3) 發(fā)酵最佳發(fā)酵條件為最佳發(fā)酵時(shí)間36h，最佳溫度36'C，初始最 佳PH值8.0，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min。(參見圖2)
無(wú)菌條件下將發(fā)酵好的種子培養(yǎng)液以10% (體積比)的量加入到裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角培養(yǎng)瓶中。在36 。C恒溫?fù)u床150 r/min條件下培養(yǎng) 36h。發(fā)酵過(guò)程中可在發(fā)酵液中加入植物油(花生油)作為消泡劑，加入量為 0. 30/0-0. 6%。
(4) 提取(參見圖1)
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
取發(fā)酵完畢的發(fā)酵液lOOml，加入0. P/。(w/w)的絮凝劑NaA102，室溫?cái)嚢?8min后靜置待分層。
(2) 離心
將預(yù)處理后的發(fā)酵液的上清液裝入離心管，在4。C條件下8000r/min離心 8min;
(3) 脫色
向洗脫液中按重量百分比加入1%的活性炭，用水浴加熱至9(TC，保溫?cái)嚢?30分鐘，趁熱過(guò)濾
(5) 紙板過(guò)濾過(guò)濾紙板由孔徑30 50ym的棉花纖維、石棉和硅藻土組 成，紙板過(guò)濾機(jī)的壓力為0. 3 MPa，。
(6) 鹽析
將硫酸銨晶體磨成粉末，在冰浴條件下邊攪拌邊加入定量的溶粗蛋白酶溶 液液(調(diào)pH為7. 8)中，然后繼續(xù)攪拌lh放置于4t:條件下4000r/min離心30min， 收集沉淀，溶于定量緩沖液中。
(7) 透析
將鹽析獲得的沉淀物溶解于裝有O. 2mol/LpH7. 4硼酸緩沖液中的透析袋中， 扎好兩端，置于IO倍酶液體積的蒸餾水中4i:透析過(guò)夜，其間需換水4次，最 后以飽和BaCL2來(lái)檢測(cè)硫酸銨是否透析完全；
(8) 超濾
將透析所得酶液置于超濾容器中在4t:的環(huán)境中，在氮?dú)鈮毫?. 5個(gè)大氣壓
力下，用截留分子量為10萬(wàn)的膜超濾5h，收集截留的液體。
(9) 離子交換柱層析
選用陰離子交換樹脂DEAE-S印hadex A50作為填充介質(zhì)，將DEAE-S印hadex A50用蒸餾水充分溶脹，采用浮選法除去過(guò)細(xì)的粒子，放置一定時(shí)間后，倒去上 清液，至上清液不含細(xì)粒為止。用0. lmol/LHCL浸泡20min，再用0. lmol/LNaOH 浸泡20min，最后用0. 1 mol/LHCL浸泡20min。用上柱緩沖夜平衡幾次，抽真 空，然后采用快速裝柱法裝入樹脂，避免產(chǎn)生氣泡。收集蛋白酶活性峰，濃縮。
(10) S印hadexG — 75凝膠柱層析
在低溫4'C的環(huán)境下，選擇S印hadexG — 75作為填充介質(zhì)。稱取一定量的 S印hadexG — 75在沸水中充分溶脹，冷卻，裝柱。將DEAE-S印hadex A50收集 到的活性峰濃縮后上樣。用0. lmol/LpH7. 4的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行洗脫，收集 堿性蛋白酶活性組分。然后冷凍干燥濃縮于4X:保存。
枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法
1 □ TT7仕
丄、什口口7K朱
按照多點(diǎn)取樣(不同地點(diǎn)、不同土層深度)混合的方法，鏟去表層土，采用
簡(jiǎn)易打孔器，打取深度為3 — 15cm的土樣，裝入無(wú)菌牛皮紙袋或鋁盒中，做好 記錄。采集的土樣應(yīng)沒(méi)有大的顆粒，帶回實(shí)驗(yàn)室陰干后立即進(jìn)行分離培養(yǎng)。其 中取樣的土壤為任何普通的土壤，任何普通的土壤中均含有枯草芽孢桿菌，即 取樣不受客觀條件的限制，具有重復(fù)性。
2、分離與純化
將采來(lái)的土樣陰干、研磨后，稱取5g，放入150ml盛有45ml生理鹽水的三
角瓶中，搖動(dòng)3-5min，在8CTC水浴中加熱10 min，殺滅不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌和其他 菌類。采用土壤稀釋分離法，吸取l mL的稀釋液加入到含有9 mL水的試管中， 振蕩混勻，制得10"土壤稀釋液；按照上述方法分別制取10—3、 10, 10—5土壤稀 釋液。分別取10入10—4、 10—5土壤稀釋液0.05 mL涂布于肉汁胨培養(yǎng)基平板上。 倒置在28 'C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取單菌落，鏡檢，采用劃線分離的 方法純化。
3 、初篩
(1) 初篩培養(yǎng)基(％) (w/w):脫脂奶粉6.0;酵母膏0. l;葡萄糖O. l;MgS04.7 I12O0. 01; KH2P 040.05; K2H P 040. 1;瓊脂2. 0;其余為蒸餾水，調(diào)pH為 7.0。
(2) 用接種環(huán)將分離得到的菌株接種在彈性蛋白平板培養(yǎng)基上，并置于37 r培養(yǎng)2 — 3天，然后觀察直徑和透明圈大小，以透明圈直徑與菌落直徑的比 值(HC值)作為初篩指標(biāo)。將比值大的用稀釋倒平板或劃線法進(jìn)行分離純化，挑 取單菌落接入斜面，于37。C培養(yǎng)24-32小時(shí)。
4、復(fù)篩
(1) 發(fā)酵培養(yǎng)基(％) (w/w):酪蛋白3.0;葡萄糖4.0;玉米提取液2.0; K 2HPO40.2; MgS04 7 H2 0. 01;其余為蒸餾水。調(diào)pH為7.8。
(2) 將初篩所得菌株分別接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床振蕩發(fā)酵24小 時(shí)后，4°C、 4000rpm離心30分鐘，取上清液，用標(biāo)準(zhǔn)底物、分光光度計(jì)測(cè)定各 菌株彈性蛋白酶的活力反復(fù)試驗(yàn)，選擇一株活力最高的菌株作為發(fā)酵菌株。酶 活測(cè)定參照工業(yè)部頒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生產(chǎn)工藝，其特征在于包括以下步驟(1)菌種培養(yǎng)采用種子培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配制；(3)發(fā)酵將枯草芽孢桿菌菌種接入搖瓶，進(jìn)行發(fā)酵得發(fā)酵液；(4)粗提發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后離心，脫色，過(guò)濾和減壓干燥得粗品堿性蛋白酶；(5)精制粗品經(jīng)純化溶解后，鹽析，透析，超濾濃縮，凝膠過(guò)濾層析，然后干燥濃縮得成品。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生 產(chǎn)工藝，其特征在于步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖1.2%+蔗糖 0. 6%+淀粉1. 2%，豆餅粉3%，酵母粉0. 3%， K2HP04 3H20 0. 2% ，其余以蒸餾 水補(bǔ)充，其中百分比為w/w。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生 產(chǎn)工藝，其特征在于步驟(3)中發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間36h，溫度36'C，初始 PH值8.0，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生 產(chǎn)工藝，其特征在于歩驟(3)中枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法為 (1) :菌種培養(yǎng)基選用采用LB液體培養(yǎng)基；(2) :將配置好的LB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)ra至7.8，分裝三角瓶，在O. 105Mpa蒸 汽壓力滅菌30min，自然冷卻至45°C， 24h后無(wú)菌條件下接種枯草芽孢桿菌菌種， 38r下170 r/min搖床培養(yǎng)36-38h;(3) :無(wú)菌條件下將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液接入發(fā)酵培養(yǎng)基。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生 產(chǎn)工藝，其特征在于在發(fā)酵液中加入植物油作為消泡劑，加入量為0. 3% w/w。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生產(chǎn)工藝，其特征在于發(fā)酵液的處理和產(chǎn)品制備過(guò)程為(1) 發(fā)酵液的預(yù)處理取發(fā)酵完畢的發(fā)酵液100ml，加入絮凝劑NaA102，室溫?cái)嚢?min后靜置待 分層；絮凝劑NaAlO,的用量以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)O. 1%—0. 15%為宜；(2) 離心將預(yù)處理后的發(fā)酵液的上清液裝入離心管，在4t:條件下8000r/min離心 8min;(3) 脫色向離心液中加入1%的中顆?；钚蕴浚盟〖訜嶂?(TC，保溫?cái)嚢?0分 鐘，趁熱過(guò)濾，如濾液顏色加重，可用活性炭再度脫色，直至濾液為無(wú)色或微 黃色為止；(5)紙板過(guò)濾過(guò)濾紙板由孔徑30 50"m的棉花纖維、石棉和硅藻土組 成，紙板過(guò)濾機(jī)的壓力為O. 3 MPa，取濾液低溫干燥可得粗蛋白酶；(6) 鹽析將硫酸銨晶體磨成粉末，在冰浴條件下邊攪拌邊加入pH為7. 8的粗蛋白酶 溶液中，然后繼續(xù)攪拌lh放置于4t條件下4000r/min離心30min，收集沉淀， 溶于定量緩沖液中；(7) 透析將鹽析獲得的沉淀物溶解于裝有O. 2mol/LpH7. 4硼酸緩沖液中的透析袋中， 扎好兩端，置于IO倍酶液體積的蒸餾水中4。C透析過(guò)夜，其間需換水4次，最 后以飽和BaCU來(lái)檢測(cè)硫酸銨是否透析完全；(8) 超濾將透析所得酶液置于超濾容器中在4。C的環(huán)境中，在氮?dú)鈮毫?. 5個(gè)大氣壓 力下，用截留分子量為10萬(wàn)的膜超濾5h，收集截留的液體；(9) 離子交換柱層析選用陰離子交換樹脂DEAE-S印hadex A50作為填充介質(zhì)，將DEAE-S印hadex A50用蒸餾水充分溶脹，采用浮選法除去過(guò)細(xì)的粒子，放置-一定時(shí)間后，倒去上 清液，至上清液不含細(xì)粒為止；用O. lmol/LHCL浸泡20min，再用0. lmol麵OH 浸泡20min，最后用0. 1 mol/LHCL浸泡20min;用上柱緩沖夜平衡幾次，抽真 &，然后采用快速裝柱法裝入樹脂，避免產(chǎn)生氣泡；用洗脫液平衡若干天；洗 脫液為50mmol/L， pH7. 4的Tris-HCL緩沖液，洗脫速度為2. 8ml/10min，每十分 鐘收集一管；收集蛋白酶活性峰，濃縮。(10) S印hadexG — 75凝膠柱層析 在低溫4。C的環(huán)境下，選擇S印hadexG — 75作為填充介質(zhì)；稱取一定量的 S印hadexG — 75在沸水中充分溶脹，冷卻，裝柱；將DEAE-S印hadex A50收集 到的活性峰濃縮后上樣；用0. lmol/LpH7. 4的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫 速度為0. 5ml/min，用核酸/蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)，收集含堿性蛋白酶活性組分，然
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的生產(chǎn)工藝，其采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶，周期短，營(yíng)養(yǎng)需求低，提取工藝簡(jiǎn)單，降低了成本，同時(shí)提高了蛋白酶的回收率。本發(fā)明包括以下步驟(1)菌種培養(yǎng)采用種子培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配制；(3)發(fā)酵將枯草芽孢桿菌菌種接入搖瓶，進(jìn)行發(fā)酵得發(fā)酵液；(4)粗提發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后離心，脫色，過(guò)濾和減壓干燥得粗品堿性蛋白酶；(5)精制粗品經(jīng)純化溶解后，鹽析，透析，超濾濃縮，凝膠過(guò)濾層析，然后干燥濃縮得成品。
文檔編號(hào)C12N9/56GK101368177SQ20081023171
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日
發(fā)明者劉雙發(fā), 安德榮 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)