芽孢桿菌新菌株及其發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法和發(fā)酵產(chǎn)物在防治梨黑斑病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及芽抱桿菌的新菌株，同時還設(shè)及該新菌株的發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，W 及該發(fā)酵產(chǎn)物在防治梨黑斑病中的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 梨黑斑病是一種危害嚴重的世界性氣傳真菌病害，由鏈格抱（Alternaria alternata)引起，在梨果義自U和義后均有發(fā)生。
[0003] 我國是梨種植和出口大國，采后病原微生物的侵染造成采后腐爛損失嚴重，直接 影響梨果膽運生產(chǎn)，梨黑斑病的有效防治成為梨產(chǎn)業(yè)中急待解決的問題。
[0004] 使用化學(xué)殺菌劑控制水果的采后病害一直被認為是最有效的控制方法。然而，隨 著病原菌抗藥性的逐漸增加，及人們對水果質(zhì)量要求的提高和環(huán)保意識的加強，果蔬采后 生物防治方法作為一種控制采后病害的新途徑，逐漸為人們所認可，并成為研究熱點。
[0005] 近年，有不少關(guān)于梨黑斑病生物防治的研究報道，例如：
[0006] 齊東梅等篩選了一株枯草芽抱桿菌(Bacillus SUbtiliS化110,其發(fā)酵液對梨采 后黑斑病的防治率達到86.6% ;
[0007] 謝莉從±壤中分離到金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)B-105,其發(fā)酵液對梨黑 斑病的抑制率67.4%;
[000引 Benbow等研究了隱球酵母屬的Cryptococcus informominiatus和紅酵母屬的 Rhodotorula glutinis對梨病害的抑菌效果，CiTptococcus informominiatus和 化odotorula glutinis在采收前Id對梨進行處理，能有效地控制梨的采后黑斑?。?br>[0009] 宋聰?shù)确蛛x到一株枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)J18,梨果在菌懸液中浸果 30s，驚干后噴施接種鏈格抱菌，梨黑斑病的發(fā)病率僅為16.57%，且菌株能在梨果上很好地 定殖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種芽抱桿菌的新菌株，該新菌株的發(fā)酵產(chǎn)物能有效防治 梨黑斑病。
[ocm]為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0012] 一株解淀粉芽抱桿菌(BaciIlus am^olique化ciens)新菌株ZG2，其特征在于，前 述解淀粉芽抱桿菌(BaciIlus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2為W保藏號CGMCC No. 11868 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、的菌株。
[0013] 一種芽抱桿菌（BaciIlus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2的發(fā)酵產(chǎn)物的制備方 法，其特征在于，包括W下步驟：
[0014] StepU制備種子液：
[0015] 將新鮮芽抱桿菌(8日(3；[11118日1]171〇119116'日(316]13)新菌株262單菌落接種于溶菌肉 湯培養(yǎng)液中，28°C下震蕩恒溫培養(yǎng)，制得芽抱桿菌(Bacillus amyIoliquefaciens)新菌株 ZG2的種子液；
[0016] Step2、制備發(fā)酵液：
[0017] 將芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)新菌株ZG2的種子液接入溶菌肉湯 培養(yǎng)液中，28°C下震蕩恒溫培養(yǎng)，制得芽抱桿菌(BaciIlus amyIolique化Ciens)新菌株ZG2 的發(fā)酵液。
[0018] 前述的制備方法，其特征在于，在Stepl和Step2中，前述溶菌肉湯培養(yǎng)液的配方如 下:酵母粉5g、蛋白腺10g、NaCl 5g、瓊脂粉18g、蒸饋水1000ml，抑7.4-7.6。
[0019]前述的制備方法，其特征在于，在Step2中，芽抱桿菌（Bacillus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2的種子液的接種比例為1 %。
[0020]前述的制備方法，其特征在于，在Step2中，震蕩恒溫培養(yǎng)的時間為72h。
[0021 ] 本發(fā)明的有益之處在于：芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)新菌株ZG2的 發(fā)酵產(chǎn)物可W有效防治梨黑斑病，防治機會多，生防效果好，其中：在梨果采收前防治，防治 效果可W達到90% W上;在梨果采收后立即防治，防治效果可W達到82% W上;在梨果預(yù)冷 后防治，防治效果可W達到65% W上;如果將不同時期結(jié)合防治，效果更好。
【附圖說明】
[0022] 圖1是芽抱桿菌(BaciIlus amyIoIiquefaciens)新菌株ZG2在透射電鏡下的形態(tài) 特征；
[0023] 圖2是28°C時芽抱桿菌（BaciIlus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2在梨果傷口上 的生長動態(tài)；
[0024] 圖3是20°C時芽抱桿菌（BaciIlus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2在梨果傷口上 的生長動態(tài)；
[00巧]圖4是4°C和0°C時芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)新菌株ZG2在梨果傷 口上的生長動態(tài)。
【具體實施方式】
[0026] W下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作具體的介紹。
[0027] 第一部分:解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)新菌株ZG2 [00巧]新菌株已做保藏。
[0029] 保藏日期:2015年12月11日。
[0030] 保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、。
[0031] 保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0032] 保藏編號：CGMCC No. 11868。
[0033] 新菌株是從山西省原平市石封村要果實表面分離并純化得到的。分離純化的具體 過程如下：
[0034] (1)將采摘的要果用0.05M的憐酸緩沖液浸泡，在搖床上10化pm/min震蕩IOmin，收 集洗液；
[0035] (2)再次用0.05M的憐酸緩沖液浸泡上述要果，超聲清洗30min，收集洗液；
[0036] (3)用稀釋平板法，將收集的洗液連續(xù)稀釋，分別取0.1 mL涂布于溶菌肉湯培養(yǎng)基 平板上，每個稀釋度重復(fù)3次；
[0037] (4)在30°C下培養(yǎng)2地-4她，觀察菌株生長情況；
[0038] (5)待長出菌落后，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落，在溶菌肉湯培養(yǎng)基上進行純 化培養(yǎng)，并編號。
[0039] 新菌株具有W下特征：
[0040] (一)形態(tài)學(xué)特征
[0041 ] (1)在溶菌肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)4她-72h，新菌株ZG2呈革蘭氏陽性菌，桿狀，大小為 (0.8皿-1.2皿）X (1.6皿-2.5皿），有鞭毛(見圖1);
[0042] (2)在溶菌肉湯培養(yǎng)基平板上好氧培養(yǎng)2地-4她后，產(chǎn)生初期為凸起、表面粘稠、邊 緣不規(guī)則的乳白色菌落，后期為皺縮變干的淺黃色菌落。
[0043] 溶菌肉湯培養(yǎng)基(pH 7.4-7.6)的配方如下：酵母粉5g，蛋白腺lOg，化Cl 5g，瓊脂 粉ISg，蒸饋水1000ml。
[0044] (二)生理生化特征
[0045] (1)新菌株為兼性厭氧菌，生長抑范圍為5.5-7.5，生長溫度范圍為5°C-40°C，NaCl 濃度范圍2 %-6 %;
[0046] (2)其他生理生化指標如下表所示：
[0047] 新蔭株半理半化據(jù)佈
[004引
[0049]
[(K)加 ](S)基因特征
[0051 ] 經(jīng)16S rDNA序列測定，PCR擴增得到新菌株的16S rDNA片段，測序長度為145化P， 將新菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST比對，結(jié)果表明，新菌株與 Bacillus amyloliquefaciens(GU125620)相似度達到100%。
[0052]結(jié)合形態(tài)特征、生理生化指標和基因特征，我們最終確定分離純化得到的菌株為 芽抱桿菌(8日。;[11118日111710119116化(316]13)新菌株262。
[0化3] 第二部分:制備芽抱桿菌(8曰(3；[11118曰1]171〇119116化(316]13)新菌株262的發(fā)酵產(chǎn)物
[0054]第1步:制備種子液
[005日]從試管斜面上用接種針挑取一環(huán)新鮮芽抱桿菌（BaciIlus amyIoliquefaciens) 新菌株ZG2單菌落，接種于溶菌肉湯培養(yǎng)液中，28°C、160rpm/min震蕩恒溫培養(yǎng)24h，制得芽 抱桿菌(Bacillus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2的種子液。
[0056] 溶菌肉湯培養(yǎng)液(pH 7.4-7.6)的配方如下：酵母粉5g、蛋白腺lOg、化Cl 5g、瓊脂 粉18g、蒸饋水1000ml。
[0057] 第2步:制備發(fā)酵液
[0化引將芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefa