本發(fā)明涉及細(xì)胞分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及了一種人臍帶組織消化酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MesnchymalStemCells，MSCs)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景?？焖贉?zhǔn)確地分離高活力的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是研發(fā)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞各項(xiàng)功能的前提。目前，從臍帶中分離MSCs常用的方法有組織貼壁法、單酶法(膠原酶)、雙酶法(膠原酶、胰蛋白酶)以及三酶法(膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶)消化法。組織貼壁法操作簡(jiǎn)單，但存在以下幾種問題：不利于MSCs游離，造成臍帶組織的浪費(fèi)；華通氏膠、破碎細(xì)胞的DNA增加了培養(yǎng)基的黏度；細(xì)胞貼壁緩慢，影響培養(yǎng)周期。酶消化法在酶的選擇與消化時(shí)間上沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，存在的問題主要有：組織塊徹底消化時(shí)間長(zhǎng)；消化酶種類單一，不能徹底消化透明質(zhì)酸、膠原纖維；單純?cè)黾用傅膭┝?，?huì)破壞游離出的細(xì)胞表面蛋白如粘附因子，使細(xì)胞活力與貼壁能力受到影響。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于
背景技術(shù)：
存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種用于分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的組織消化酶，該消化酶中除了膠原酶、透明質(zhì)酸酶以外，還增加了DNA酶，大大縮短了消化時(shí)間，使消化粘稠度降低，添加青霉素和鏈霉素可有效防止樣本在采集的過程中污染以及運(yùn)輸過程中細(xì)菌的滋生。一種人臍帶組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶30-50份、透明質(zhì)酸酶20-40份。優(yōu)選的，所述組織消化酶還包括DNA酶0.1-0.8份。優(yōu)選的，組織消化酶還包括抗生素。優(yōu)選的，所述抗生素包括青霉素4-10份、鏈霉素15-23份。優(yōu)選的，所述組織消化酶包括膠原酶40份、透明質(zhì)酸酶20份、DNA酶0.4份、青霉素6份、鏈霉素20份。一種人臍帶組織消化酶的制備方法，方法步驟如下：S1：在無菌安全柜內(nèi)稱取膠原酶，加入DMEM培養(yǎng)基中；S2：稱取透明質(zhì)酸酶加入S1制得的培養(yǎng)基中；S3：稱取DNA酶加入S2制得的培養(yǎng)基中；S4：稱取青霉素和鏈霉素加入S3制得的培養(yǎng)基中；S5：將S4制得的培養(yǎng)基經(jīng)過0.22μm的濾網(wǎng)過濾，放置于4℃?zhèn)溆谩＿M(jìn)一步的，所述DMEM培養(yǎng)基為低糖型。一種人臍帶組織消化酶可應(yīng)用于分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶是由卵黃囊和尿囊所構(gòu)成，通常是由2條較細(xì)的臍動(dòng)脈與1條較粗的臍靜脈所組成，我們?cè)谥苽涞倪^程中會(huì)剔除動(dòng)脈和靜脈，但是臍帶外圍由一層柔軟的膠狀物包裹著，稱為華通氏膠，用以保護(hù)臍帶內(nèi)的血管。華通氏膠為構(gòu)成臍帶的凝膠狀物質(zhì)，主要成份是黏多糖，也含有成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是一種黏膜組織。透明質(zhì)酸酶為一種能水解透明質(zhì)酸的酶(透明質(zhì)酸為組織基質(zhì)中具有限制水分及其它細(xì)胞外物質(zhì)擴(kuò)散作用的成分)，用于暫時(shí)降低細(xì)胞間質(zhì)的粘性。膠原酶的化學(xué)名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。膠原酶的化學(xué)本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。在臍帶消化酶中添加膠原酶就是為了特異性的水解臍帶組織中的蛋白質(zhì)，使間充質(zhì)干細(xì)胞充分的暴露出來。在膠原酶中添加了DNA酶，DNA酶防止分離細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞黏附聚集?？股厥乔嗝顾嘏c鏈霉素。自然環(huán)境下(不考慮人為產(chǎn)生的抗藥性)，對(duì)青霉素不敏感的微生物絕大多數(shù)對(duì)鏈霉素敏感，反之亦然。兩種抗生素搭配可以控制幾乎全部常見細(xì)菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果在于：本發(fā)明提出的一種人臍帶組織消化酶包括膠原酶、透明質(zhì)酸酶和DNA酶，該消化酶組合物性質(zhì)溫和，可有效降低消化粘稠度，對(duì)細(xì)胞損傷?。辉摻M織消化酶的酶解速率高，縮短了臍帶組織的消化時(shí)間，分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更加優(yōu)良的增殖活性和分化能力；此外本發(fā)明的組織消化酶中還添加青霉素和鏈霉素，可有效防止樣本在采集過程中的污染以及運(yùn)輸過程中細(xì)菌的滋生。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說。實(shí)施例1一種人臍帶組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶30份、透明質(zhì)酸酶40份、DNA酶0.1份、青霉素4份、鏈霉素23份。一種人臍帶組織消化酶的制備方法，方法步驟如下：S1：在無菌安全柜內(nèi)稱取膠原酶，加入DMEM培養(yǎng)基中；S2：稱取透明質(zhì)酸酶加入S1制得的培養(yǎng)基中；S3：稱取DNA酶加入S2制得的培養(yǎng)基中；S4：稱取青霉素和鏈霉素加入S3制得的培養(yǎng)基中；S5：將S4制得的培養(yǎng)基經(jīng)過0.22μm的濾網(wǎng)過濾，放置于4℃?zhèn)溆?。?shí)施例2一種人臍帶組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶50份、透明質(zhì)酸酶25份、DNA酶0.3份、青霉素7份、鏈霉素15份。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3一種人臍帶組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶40份、透明質(zhì)酸酶20份、DNA酶0.4份、青霉素6份、鏈霉素20份。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例4一種人臍帶組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶35份、透明質(zhì)酸酶35份、DNA酶0.8份、青霉素8份、鏈霉素17份。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例5一種人臍帶組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶45份、透明質(zhì)酸酶30份、DNA酶0.6份、青霉素10份、鏈霉素22份。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例6一種人臍帶組織消化酶在分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用。S1：在無菌安全柜內(nèi)稱量40mg膠原酶融入40mL1xDMEM低糖培養(yǎng)基中，終濃度為1mg/mL；S2：稱量20mg透明質(zhì)酸酶，加入S1制得的培養(yǎng)基中，終濃度為0.5mg/mL。S3：稱量0.4mgDNA酶，加入S2制得的培養(yǎng)基中，終濃度0.01為mg/ml。S4：稱量6mg青霉素，20mg鏈霉素加入S3制得的培養(yǎng)基中。S5：將S4制得的培養(yǎng)基用0.22um濾器，保證無菌，即得所需要的人臍帶組織消化酶。將所得人臍帶組織消化酶加入到剪碎的臍帶組織中，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，200轉(zhuǎn)、消化2h，觀看沒有大的臍帶塊后，加含有EDTA0.05％Trypsin-EDTA(1x)phenolRed30mL，消化10min，離心2000rpm，10min即可。加入30mlDMEM培養(yǎng)基清洗一次，離心(2000r*5min)去上清；沉淀可以直接接種或凍存，接種密度由組織量決定，約10mL組織接種一個(gè)15cmBD培養(yǎng)皿，5mL組織接種一個(gè)T75培養(yǎng)瓶；接種的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)三天，三天后全量換液去除雜物，之后每3天半量或全量換液，細(xì)胞長(zhǎng)至90％時(shí)傳代或凍存；原代細(xì)胞凍存，清洗后的沉淀可以直接加入適量?jī)龃嬉海盅b凍存，凍存密度可以根據(jù)組織量決定，5mL組織凍存一支，復(fù)蘇時(shí)可以直接接種一個(gè)T75培養(yǎng)瓶，根據(jù)上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)原代細(xì)胞。使用該組織消化酶可以使臍帶組織和華通氏膠消化基本完全，消化完成之后組織過濾比較容易，組織酶混合液不會(huì)過于黏稠，一般的消化酶會(huì)使組織酶混合液過于黏稠，過濾的時(shí)候不容易過濾，過濾同樣體積的混合液可能需要過多的過濾器，這樣產(chǎn)生了不必要的浪費(fèi)。而且細(xì)胞也很容易與組織粘液在一起不容易過濾出來。組織消化酶過濾后細(xì)胞成單個(gè)分散在培養(yǎng)基中，容易貼壁，而且細(xì)胞貼壁后很快進(jìn)行分裂增殖，普通的消化液會(huì)有大量的粘液，阻止細(xì)胞貼壁以及細(xì)胞的分裂。細(xì)胞活力測(cè)試實(shí)驗(yàn)方法：采用MTT法。1)細(xì)胞培養(yǎng)：采用實(shí)施例1-5所得的人臍帶組織消化酶分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；2)用96孔板培養(yǎng)，每組設(shè)4個(gè)平行樣本取均值，收獲細(xì)胞前4h。3)每孔加入10μL配好的MTT，4h后用吸引器棄培養(yǎng)液，并加入100μL的DMSO，采用排槍加，保證反應(yīng)的一致性，振蕩8min。4)看到紫色結(jié)晶物充分溶解后，置酶標(biāo)儀(要提前開機(jī)預(yù)熱半小時(shí)左右)上測(cè)各孔光吸收值(OD)，以空白孔調(diào)零，濾過的波長(zhǎng)是570nm。5)利用測(cè)出的OD值求細(xì)胞存活率，常以存活率為縱軸、時(shí)間為橫軸繪制其生存曲線。細(xì)胞存活率(％)＝實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表一細(xì)胞存活率結(jié)果組別實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4實(shí)施例5存活率99.1％98.7％98.9％99.6％99.5％實(shí)驗(yàn)結(jié)論：通過表一結(jié)果可知，本發(fā)明所制得的人臍帶組織消化酶能夠保證臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率在98％以上，使臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有優(yōu)良的增殖活性和分化能力。二、細(xì)胞表面抗原的流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法：1)采用實(shí)施例3所制得的人臍帶組織消化酶進(jìn)行組織消化所獲得的細(xì)胞。2)在每個(gè)流式檢測(cè)管中加入50uL的稀釋后的一抗；在空白管或同型對(duì)照管中加入50uL緩沖液，細(xì)胞濃度范圍2-0.03ug/106細(xì)胞。3)在各管中分別加入50uL細(xì)胞懸液，并輕輕混勻。4)避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分鐘。5)孵育完成后，加入緩沖液(每流式檢測(cè)管中加2mL)，4℃下400g離心5分鐘，并棄去上清。6)重復(fù)洗滌過程3次。7)重懸細(xì)胞后上流式儀檢測(cè)。8)使用直接標(biāo)記一抗，用500uL緩沖液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表型：應(yīng)該表達(dá)的一種表面標(biāo)記CD73、CD90和CD105必須為陽性，陽性率不低于95％；同時(shí)為了保證消化酶獲得的干細(xì)胞中沒有混雜其它細(xì)胞，選取一組已知的間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)的表型作為輔助，證實(shí)我們方法的優(yōu)越性。CD34、CD45、CD14、HLA-DR、IgGPE、IgGECD、IgGFITC，陽性率不得超過2％。表1本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞表面抗原的陽性率表面抗原CD34CD45CD14HLA-DRIgGPEIgGECDIgGFITCCD73CD90CD105陽性率0.2％0.3％0.2％0.3％0.1％0.2％0.5％99.82％99.91％99.67％表2為用文獻(xiàn)的方法得到的細(xì)胞表面抗原的陽性率表面抗原CD34CD45CD14HLA-DRIgGPEIgGECDIgGFITCCD73CD90CD105陽性率1.7％1.1％0.7％0.6％0.2％0.7％0.6％68.83％90.47％78.46％實(shí)驗(yàn)結(jié)論：說明本發(fā)明所制得的消化酶，用于消化得到的細(xì)胞純度更高。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3