本發(fā)明涉及病毒疫苗技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒、制備方法及預(yù)防新城疫強毒的疫苗。

背景技術(shù)：

新城疫(Newcastle Disease,ND)是一種急性高接觸性傳染病。該病傳播迅速，發(fā)病率、死亡率可達85％以上，強毒株引起的感染常達100％，是當今全球范圍內(nèi)最嚴重的家禽傳染病之一。自1926年首發(fā)于印尼西亞和英國新城以來，在其后90年的歷史中，新城疫在全世界曾發(fā)生過多次大流行，實驗表明有250多種鳥類可被新城疫病毒(NDV)感染。在我國許多地區(qū)每年都有此病的發(fā)生，并且在水禽和野鳥體內(nèi)也分離到新城疫病毒。正是由于該病的危害和引發(fā)的后果極其嚴重，新城疫被國際獸疫局(OIE)列為A類疫病。

新城疫病毒是一種負鏈RNA病毒，屬于禽副粘病毒I型。新城疫病毒含有六個主要蛋白，其中最主要的糖蛋白是新城疫病毒融合蛋白F和血凝素--神經(jīng)氨酸酶蛋白HN。這兩個蛋白不僅與病毒的毒力和致病性有關(guān)，同時也是誘導(dǎo)宿主體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護性抗體的蛋白。成熟的ND病毒粒子有囊膜,呈圓形,直徑約為100-250nm。囊膜上有纖突長約8nm，為F蛋白和HN蛋白。另外，HN蛋白能結(jié)合紅細胞表面的受體，這一特性可用來做為血凝效價和血清抗體效價檢測的判斷指標。新城疫病毒雖然只有一個血清型，但其強毒已進化出現(xiàn)了九個基因型，當前我國新城疫病毒的優(yōu)勢流行株屬基因VII型，是危害嚴重的強毒病毒株。

近年來，雖然新城疫疫苗在世界范圍內(nèi)得到了廣泛使用，但由于新城疫病毒一直處于不斷的進化之中，目前已產(chǎn)生了多個不同的基因型。而在我國優(yōu)勢流行的強毒株基因Ⅶ型，常規(guī)疫苗對其攻擊并不能提供理想的免疫保護效力。因此有必要用流行的強毒株來研制安全有效的新型疫苗，徹底防范新城疫疫病的傳播。

病毒樣顆粒(Virus Like Particles，VLPs)是指含有某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，其在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，稱為病毒樣顆粒。VLPs保留了天然病毒顆粒的空間構(gòu)象和誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位，免疫性強，能激發(fā)體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。由于VLPs只是一個純粹的大分子蛋白聚合顆粒，不含病毒遺傳物質(zhì)，不能自主復(fù)制，因此使用時非常安全。在制備過程中采用細胞發(fā)酵罐進行動物細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，保證了批次間的均一性，不會造成環(huán)境污染。病毒樣顆粒疫苗作為一種新型疫苗，不僅克服了傳統(tǒng)疫苗的不足，也彌補了其它基因工程疫苗的缺憾，是目前最有發(fā)展前景、最安全的候選疫苗。

病毒樣顆粒(VLPs)疫苗屬基因工程苗，可選用重組桿狀病毒作為載體來表達制備。由于重組昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)易于篩選，安全性好，產(chǎn)物成本低，表達水平高，表達產(chǎn)物的翻譯后加工與高等生物相似，可使蛋白產(chǎn)物保持天然結(jié)構(gòu)、生物活性和免疫活性，且易于大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白，因此被認為是表達VLPs的最佳表達系統(tǒng)。

有研究報道，逆轉(zhuǎn)錄病毒的Gag前體蛋白可在昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達，并且，在沒有其它病毒組分存在的情況下，表達的Gag前體蛋白足以在昆蟲細胞表面出芽，有效地組裝和釋放形成VLP。Gag前體蛋白的一個顯著特點是能與一些不同病毒的結(jié)構(gòu)蛋白相組合，穩(wěn)定地共表達，因而具有很好的應(yīng)用價值。

近幾十年來，雖然全世界都廣泛使用疫苗來防控新城疫，但是免疫禽群中仍頻繁出現(xiàn)新城疫強毒感染現(xiàn)象。研究表明，雖然新城疫病毒只有一個血清型，但卻有多個不同的基因型。自上世紀90年代末以來，引起我國新城疫流行的優(yōu)勢毒株為基因VII型強毒，而最常用的新城疫疫苗株為基因II型弱毒株Lasota。因此目前常用的新城疫疫苗毒株與當前流行毒株基因型不匹配。盡管疫苗株能對流行株攻擊提供較好的臨床保護(不發(fā)生癥狀和死亡)，但免疫保護力不足，雞群中流行株的帶毒率和病毒載量較高，這是免疫雞群仍發(fā)生非典型新城疫的主要原因。

采用反向遺傳學(xué)方法制備的毒株基因VII型疫苗能解決疫苗株與流行毒株基因型不匹配的問題。但所制備的疫苗抗原依然是具備遺傳活性的活病毒，必須要經(jīng)過化學(xué)處理進行滅活。同時，在生產(chǎn)制備抗原活病毒時，要防泄漏保證環(huán)境安全，收獲后的廢物需嚴格處理控制等。

有研究報道，用新城疫病毒的M基因、F基因和HN基因合成出了新城疫病毒病毒樣顆粒，可用于制備疫苗。但這種含基質(zhì)蛋白M的新城疫病毒病毒樣顆粒產(chǎn)量不高，尤其當選用強毒基因VII型株的這幾個結(jié)構(gòu)蛋白基因制備病毒樣顆粒抗原時，情況尤為明顯。因此給實際生產(chǎn)和應(yīng)用新城疫病毒病毒樣顆粒疫苗造成了不便。

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒，該新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒用于制備預(yù)防新城疫強毒的疫苗。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種預(yù)防新城疫強毒的疫苗，該疫苗為嵌合病毒樣顆粒疫苗，是采用現(xiàn)代生物學(xué)原理和方法制備的新型疫苗，該疫苗采用目前流行的新城疫強毒毒株基因VII型作為疫苗株，解決了疫苗株與流行株不相匹配的問題；其次，該疫苗抗原含量高，容易生產(chǎn)；表達產(chǎn)物的翻譯后加工與新城疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白相似，顆粒表面上的新城疫病毒膜蛋白保持了其天然結(jié)構(gòu)、生物活性和免疫原性。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述的新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

新城疫病毒病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒為嵌合顆粒，該顆粒包含逆轉(zhuǎn)錄病毒的Gag前體蛋白，新城疫病毒點突變?nèi)诤系鞍爪，新城疫病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN。

其中，新城疫病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN的核苷酸序列為SEQ ID No.7所示序列，其氨基酸序列為SEQ ID No.8所示序列。

優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒為雞白血病病毒或人免疫缺陷病毒。

其中，雞白血病病毒的Gag前體蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No.1所示序列，其氨基酸序列為SEQ ID No.2所示序列；人免疫缺陷病毒的Gag前體蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No.3所示序列，其氨基酸序列為SEQ ID No.4所示序列。

優(yōu)選地，所述新城疫病毒點突變?nèi)诤系鞍爪由新城疫病毒融合蛋白F的第147位的氨基酸突變后得到。所述新城疫病毒點突變?nèi)诤系鞍爪的核苷酸序列為SEQ ID No.5所示序列，氨基酸序列為SEQ ID No.6所示序列。

新城疫病毒點突變?nèi)诤系鞍爪的核苷酸序列(SEQ ID No.5)如下：

ATGGGCTCCAAACCTTCTACCAGGATCCCAGCACCTCTAATGCTGATCACTCGGATTATGCTGATATTGAGCTGTATCCGTCTGACAAGCTCTCTTGACGGCAGGCCCCTTGCAGCTGCAGGAATTGTAGTAACAGGAGATAAGGCAGTCAATGTATACACCTCGTCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTGCTCCCGAATATGCCCAGAGATAAGGAGGCATGTGCAAAAGCCCCATTGGAGGCATATAACAGAACACTGACTACTCTGCTCACTCCTCTTGGCGACTCCATCCGCAAGATCCAAGGGTCTGTGTCCACGTCCGGAGGAAGGAGACAACAGCGCTTCATAGGTGCTGTTATTGGCAGTGTAGCTCTTGGGGTTGCAACAGCGGCACAGATAACAGCAGCTGCGGCCCTAATACAAGCCAAACAGGCTGCCGCCAACATCCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCTGCAACCAATGAAGCTGTGCATGAAGTCACCGACGGATTATCACAACTATCAGTGGCAGTTGGGAGGATGCAGCAGTTTGTCAATGACCAGTTTAATAATACGGCGCGAGAATTGGACTGTATAAAAATCACACAACAGGTCGGTGTAGAACTCAACCTATACCTAACTGAATTGACTACAGTATTCGGGCCACAGATCACCTCCCCTGCATTAACTCAGCTGACCATCCAGGCACTTTATAATTTAGCTGGTAGCAATATGGATTACTTATTAACTAAGTTAGGTATAGGAAACAATCAACTCAGTTCATTAATTGGTAGCGGCCTGATCACTGGTTACCCTATATTGTATGACTCACATACTCAACTCTTGGGCATACAAGTAAATTTGCCCTCAGTCGGGAACTTAAATAATATGCGTGCCACCTATTTGGAGACCTTATCTGTAAGTACAACCAAAGGATATGCCTCAGCGCTTGTCCCGAAAGTAGTGACACAAGTCGGTTCTGTGATAGAAGAGCTTGACACCTCATACTGTATAGAGTCTGATCTGGATTTATATTGTACTAGAATAGTGACATTCCCCATGTCCCCAGGTATTTATTCCTGTTTGAGCGGCAACACATCAGCCTGCATGTATTCAAAGACTGAAGGCGCACTCACTACGCCATACATGGCCCTTAGAGGCTCAGTTATTGCCAATTGTAAGATAACAACATGCAGATGTACGGACCCTCCTGGTATTATATCACAAAATTACGGAGAAGCTGTATCCCTGATAGATAGACATTCATGCAATGTCTTATCACTAGACGGAATAACTCTGAGGCTCAGTGGGGAATTTGATGCAACTTATCAAAAGAACATCTCAATATTAGATTCTCAGGTCATCGTGACAGGCAATCTTGATATATCAACTGAACTTGGAAACGTCAACAATTCAGTCAGCAATGCCTTGGATAGGTTGGCAGAGAGCAACGGCAAGCTAGAAAAAGTCAATGTCAGACTAACTAGCACATCTGCTCTCATTACCTATATTGTTCTAACTGTCGTTTCCCTAATTTTCGGTGCACTTAGTCTGGTTTTAGCGTGTTACCTGATGTACAAACAGAAGGCACAACAAAAGACCTTGTTATGGCTTGGGAATAATACCCTCGATCAGATGAGAGCCACCACAAGAGCATGA。

新城疫病毒點突變?nèi)诤系鞍爪的氨基酸序列(SEQ ID No.6)如下：

MGSKPSTRIPAPLMLITRIMLILSCIRLTSSLDGRPLAAAGIVVTGDKAVNVYTSSQTGSIIVKLLPNMPRDKEACAKAPLEAYNRTLTTLLTPLGDSIRKIQGSVSTSGGRRQQRFIGAVIGSVALGVATAAQITAAAALIQAKQAAANILRLKESIAATNEAVHEVTDGLSQLSVAVGRMQQFVNDQFNNTARELDCIKITQQVGVELNLYLTELTTVFGPQITSPALTQLTIQALYNLAGSNMDYLLTKLGIGNNQLSSLIGSGLITGYPILYDSHTQLLGIQVNLPSVGNLNNMRATYLETLSVSTTKGYASALVPKVVTQVGSVIEELDTSYCIESDLDLYCTRIVTFPMSPGIYSCLSGNTSACMYSKTEGALTTPYMALRGSVIANCKITTCRCTDPPGIISQNYGEAVSLIDRHSCNVLSLDGITLRLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSVSNALDRLAESNGKLEKVNVRLTSTSALITYIVLTVVSLIFGALSLVLACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTRA。

優(yōu)選地，所述新城疫病毒融合蛋白F以及新城疫病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN均來源于新城疫病毒的強毒毒株。

優(yōu)選地，所述新城疫病毒的強毒毒株為新城疫病毒基因III型至基因IX型毒株中的一種，優(yōu)選地，所述新城疫病毒的強毒毒株為基因VII型毒株。

一種疫苗，所述疫苗包含上述的新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒。

優(yōu)選地，所述疫苗還包含佐劑，所述佐劑選自白油佐劑，角鯊烯佐劑，植物油佐劑或弗氏佐劑。

上述的新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒的制備方法，該方法為用共同表達逆轉(zhuǎn)錄病毒的Gag前體蛋白，新城疫病毒點突變?nèi)诤系鞍?，新城疫病毒血凝?神經(jīng)氨酸酶蛋白的載體，轉(zhuǎn)染細胞，回收并純化所述細胞的培養(yǎng)液，獲得新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒。

優(yōu)選地，所述載體為桿狀病毒質(zhì)粒；所述細胞為昆蟲細胞。

上述的新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒在制備新城疫病毒抗體檢測制劑或新城疫病毒疫病監(jiān)測制劑中的應(yīng)用，所述制劑包含ELISA檢測試劑盒、膠體金試紙條、化學(xué)發(fā)光檢測盒或熒光發(fā)光檢測盒。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明屬于病毒疫苗領(lǐng)域。常用新城疫病毒商品疫苗株為Lasota,屬NDV基因II型弱毒株，與流行的強毒毒株遺傳距離上相差較遠，不能達到完全的保護效果。本發(fā)明采用目前流行的新城疫強毒毒株基因VII型作為疫苗株，解決了疫苗株與流行株不相匹配的問題。

病毒樣顆粒疫苗是用現(xiàn)代生物學(xué)原理和方法制備的新型疫苗。本發(fā)明用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)制備的新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒疫苗，抗原含量高，容易生產(chǎn)。表達產(chǎn)物的翻譯后加工與新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白相似，顆粒表面上的新城疫病毒膜蛋白保持了其天然結(jié)構(gòu)、生物活性和免疫活性。在制備過程中采用昆蟲細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，封閉式調(diào)控操作，保證了批次間的均一性和疫苗的優(yōu)異質(zhì)量。本發(fā)明所制備的疫苗抗原只是一個新城疫病毒蛋白空殼，不含新城疫病毒的任何遺傳物質(zhì)，沒有新城疫病毒活性，不具傳染性，非常安全，不會對環(huán)境造成污染和散毒。

新城疫病毒在自然界能引起感染的宿主細胞融合，造成宿主紅細胞溶血。用帶有強毒毒株的融合蛋白F基因、基質(zhì)蛋白M基因和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN基因構(gòu)建重組桿狀病毒來感染昆蟲細胞制備新城疫病毒常規(guī)病毒樣顆粒時，可以觀察到受感染的昆蟲細胞生長不良，細胞之間有融合現(xiàn)象出現(xiàn)，細胞變得巨大而不規(guī)則，易于死亡，因而影響了病毒樣顆粒的產(chǎn)量。本發(fā)明用分子生物學(xué)方法對融合蛋白F第147位的氨基酸進行定向點突變后，能有效地消除受感染的昆蟲細胞融合，提高昆蟲細胞的存活率和細胞生長數(shù)量，從而提高新城疫病毒病毒樣顆粒的合成。

用新城疫病毒的M基因、F基因和HN基因可以合成出新城疫病毒病毒樣顆粒，但這種含基質(zhì)蛋白M的新城疫病毒病毒樣顆粒產(chǎn)量不高，尤其當選用強毒基因VII型株的這幾個結(jié)構(gòu)蛋白基因制備病毒樣顆?？乖瓡r，情況尤為明顯。因此給實際生產(chǎn)和應(yīng)用新城疫病毒樣顆粒疫苗造成了不便。本發(fā)明用逆轉(zhuǎn)錄病毒的Gag前體蛋白取代了新城疫病毒的基質(zhì)蛋白M，所制備的新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒不但產(chǎn)量高，而且很穩(wěn)定，是非常理想的新城疫病毒病毒樣顆?？乖?。動物免疫攻毒保護實驗結(jié)果證明，制備的新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒疫苗能有效保護免疫雞只抵抗新城疫病毒強毒毒株的攻擊，是理想的預(yù)防新城疫強毒病毒侵染的新型疫苗，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖；

圖2A和圖2B為基因DNA凝膠電泳圖；

圖3為Western blots顯示NDV嵌合病毒樣顆粒的HIV-1-Gag前體蛋白或NDV嵌合病毒樣顆粒的ALV-Gag前體蛋白；

圖4A為NDV嵌合病毒樣顆粒雞紅細胞血凝效價檢測；

圖4B為用雞白血病病毒ALV的Gag前體蛋白基因制備的NDV嵌合病毒樣顆粒和用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前體蛋白基因制備的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品血凝效價示意圖；

圖5為超速離心純化NDV嵌合病毒樣顆粒；

圖6A為電鏡下的NDV嵌合病毒樣顆粒圖片；

圖6B為圖6A的局部放大圖；

圖7A為用未突變的融合蛋白F制備病毒樣顆粒(pFastBac-M-HN-F)與用點突變的融合蛋白ΔF制備病毒樣顆粒(pFastBac-M-HN-ΔF)時，細胞感染后的生長曲線比較圖；

圖7B為用未突變的融合蛋白F制備病毒樣顆粒(pFastBac-M-HN-F)與用點突變的融合蛋白ΔF制備病毒樣顆粒(pFastBac-M-HN-ΔF)時，細胞感染后的成活率比較圖；

圖8A為帶有未突變的融合蛋白F的NDV病毒樣顆粒血凝效價檢測和帶有點突變的融合蛋白ΔF的NDV病毒樣顆粒血凝效價檢測結(jié)果；

圖8B為帶有未突變的融合蛋白F的NDV病毒樣顆粒樣品與帶有點突變的融合蛋白ΔF的NDV病毒樣顆粒樣品血凝效價示意圖；

圖9A為含基質(zhì)蛋白M的常規(guī)NDV病毒樣顆粒樣品與含Gag前體蛋白的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品血凝效價檢測結(jié)果；

圖9B為含基質(zhì)蛋白M的常規(guī)NDV病毒樣顆粒樣品與含Gag前體蛋白的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品血凝效價示意圖；

圖10A為免疫雞只血清抗體效價示意圖；

圖10B為免疫雞只攻毒保護示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

研究結(jié)果顯示，只有疫苗株與流行毒株高度同源時方能產(chǎn)生理想的免疫保護效力，即不僅對流行株攻擊提供高度的臨床保護，而且能有效降低排毒和病毒的載量。

本發(fā)明的發(fā)明人選用的作為疫苗的抗原蛋白基因全取自于中國新城疫流行優(yōu)勢強毒株基因VII亞型，這種新型疫苗將會有效地降低新城疫強毒流行株在免疫雞群里的進一步擴散傳播。本發(fā)明制備的疫苗抗原是一個復(fù)合蛋白聚合顆粒，不含新城疫病毒的任何遺傳物質(zhì)，沒有傳染性，非常安全，不會對環(huán)境造成污染和散毒。

發(fā)明人用逆轉(zhuǎn)錄病毒的Gag前體蛋白取代了新城疫病毒的基質(zhì)蛋白M，所制備的新城疫病毒嵌合病毒樣顆粒不但產(chǎn)量高，而且很穩(wěn)定，是非常理想的新城疫病毒病毒樣顆?？乖瑸橹苽淇箯姸拘鲁且咭呙缣峁┝藦V闊的應(yīng)用前景。

實施例1

新城疫病毒(NDV)嵌合病毒樣顆粒蛋白載體的構(gòu)建及檢測

根據(jù)新城疫病毒強毒株流行趨勢同時結(jié)合抗原分析和密碼子優(yōu)化，人工合成了新城疫病毒強毒株基因VII型的F蛋白和HN蛋白的基因，以及兩個反轉(zhuǎn)錄病毒(雞白血病病毒ALV，人免疫缺陷病毒HIV-1)的Gag前體蛋白基因。

新城疫病毒融合蛋白F和血凝素—神經(jīng)氨酸酶HN做為新城疫病毒(NDV)嵌合病毒樣顆粒的膜糖蛋白，具有強毒株基因VII型病毒表面抗原的功能。而Gag前體蛋白將作為NDV嵌合病毒樣顆粒的基質(zhì)蛋白，以出芽方式，從宿主細胞釋放，自組裝成嵌合病毒樣顆粒。具體構(gòu)建步驟簡述如下：將Gag基因、F基因和HN基因通過PCR擴增后，分別用限制性內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)。用凝膠電泳收集純化酶切后的三個基因DNA片段。用上述同樣的方法步驟處理pFastBac質(zhì)粒載體，然后用T4聯(lián)接酶將三個基因的DNA片段分別聯(lián)接到pFastBac質(zhì)粒載體上，用以表達上述的三個目的蛋白。將所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，采用菌落藍白斑篩選法，挑選白色菌落。37C°搖床培養(yǎng)所選菌落細菌，進行DNA質(zhì)粒抽提，獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid，見圖1。

在一個6孔細胞培養(yǎng)板中鋪上昆蟲細胞sf-9,用獲得的重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid做細胞轉(zhuǎn)染，六天后收獲含有重組桿狀病毒的細胞培養(yǎng)上清液。加入含有SDS的裂解液至細胞上清液中裂解重組桿狀病毒，用氯仿抽提、乙醇沉淀獲得重組桿狀病毒DNA；以此DNA做模板，加入對應(yīng)F基因、HN基因和Gag基因的不同PCR引物，分別進行PCR擴增反應(yīng)；

其中，F(xiàn)基因的上游引物序列為SEQ ID No.9所示序列；

F基因的下游引物序列為SEQ ID No.10所示序列；

HN基因的上游引物序列為SEQ ID No.11所示序列；

HN基因的下游引物序列為SEQ ID No.12所示序列；

雞白血病病毒ALV的Gag基因的上游引物序列為SEQ ID No.13所示序列；

雞白血病病毒ALV的Gag基因的下游引物序列為SEQ ID No.14所示序列；

人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag基因的上游引物序列為SEQ ID No.15所示序列；

人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag基因的下游引物序列為SEQ ID No.16所示序列。

擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，獲得預(yù)期的三個DNA片段，圖2A中M:DNA分子大小標記；F：NDV融合蛋白F基因DNA片段，1662個堿基對；HN：NDV血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN基因DNA片段，1716個堿基對；Pr55Gag：人免疫缺陷病毒HIV-1Gag前體蛋白基因DNA片段，1503個堿基對；圖2B中M:DNA分子大小標記；F：NDV融合蛋白F基因DNA片段，1662個堿基對；HN：NDV血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN基因DNA片段，1716個堿基對；Pr61Gag：雞白血病病毒ALV Gag前體蛋白基因DNA片段，1734個堿基對。圖2A和2B可以證明所制備的重組桿狀病毒帶有所需的三個外源基因。

實施例2

NDV嵌合病毒樣顆粒蛋白的表達及自組裝

將帶有F基因、HN基因和Gag基因(來自于雞白血病病毒ALV，或人免疫缺陷病毒HIV-1)的重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細胞sf9，六天后收取細胞上清液，獲得第一代重組桿狀病毒毒種，稱為P1代。用P1代毒種感染昆蟲細胞進行毒種放大，獲得第二代重組桿狀病毒毒種，稱為P2代。再用P2代毒種進行放大，獲得P3代。以P3代作為生產(chǎn)毒種制備NDV嵌合病毒樣顆粒。簡單而言，將生長狀態(tài)良好的Sf-9細胞接種到搖瓶中，待細胞成長至對數(shù)生長期時，稀釋細胞濃度至每毫升3.0×10⁶個細胞。將P3代毒種按MOI為0.1比率，接種病毒到細胞搖瓶中，3到4天后收獲細胞上清液，檢測NDV嵌合病毒樣顆粒的生成。

Western Blot檢測收獲的細胞上清液中是否含有Gag基質(zhì)蛋白。具體操作簡述如下：在10μL細胞上清液中加入10μL電泳上樣液混合，進行SDS-PAGE電泳，然后做Western Blot的印膜轉(zhuǎn)印。用抗HIV-1Gag p24兔源多抗(檢測用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前體基因制備的病毒樣顆粒蛋白)，或用抗ALV Gag p26兔源多抗(檢測用雞白血病病毒ALV的Gag基因制備的病毒樣顆粒蛋白)作為一抗進行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光膠片，顯影后可見膠片上清晰的Gag前體蛋白條帶，如圖3所示。說明上清液樣品與Gag抗體有特異性反應(yīng)，重組桿狀病毒能夠正確表達Gag前體蛋白。且Gag前體蛋白以自組裝成顆粒的形式釋放到細胞上清液中。

血凝效價檢測細胞上清液中病毒樣顆粒的存在。NDV中的HN蛋白具有血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)活性。HN蛋白能結(jié)合紅細胞表面的受體，這一特性可用來做為血凝效價檢測的判斷指標。因此可以用雞紅細胞凝集反應(yīng)來檢測細胞上清液中的病毒樣顆粒。具體步驟是：在一塊微量血凝板上，用移液器從第1孔至12孔各加入PBS 0.025mL，用移液器吸取收獲的細胞上清液0.025mL，從第1孔起，依次做2倍倍比稀釋，至最后一個孔，棄去移液器內(nèi)0.025mL液體。再向每孔加入1％雞紅細胞懸液0.025mL，并設(shè)不加樣品的紅細胞對照孔，立即在微量板振蕩器上搖勻，放置于25℃孵育30min。當對照孔中的紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結(jié)果。以使紅細胞完全凝集的最高稀釋度，作為判定終點。結(jié)果見圖4A和圖4B，圖4A中A行：顯示用雞白血病病毒ALV的Gag前體蛋白基因制備的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品一的血凝效價為8；

B行：顯示用雞白血病病毒ALV的Gag前體蛋白基因制備的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品二的血凝效價為8；

C行：顯示用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前體蛋白基因制備的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品一的血凝效價為9；

D行：顯示用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前體蛋白基因制備的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品二的血凝效價為9；

E行：用PBS作為空白對照。

圖4B為用雞白血病病毒ALV的Gag前體蛋白基因制備的NDV嵌合病毒樣顆粒和用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前體蛋白基因制備的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品血凝效價示意圖。

圖中顯示，用兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag前體蛋白分別制備的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品，在細胞上清液中達到2log8或2log9的水平。說明Gag前體蛋白與NDV膜糖蛋白一起，以自組裝成NDV嵌合病毒樣顆粒的形式釋放到了細胞上清液中。

實施例3

NDV嵌合病毒樣顆粒的純化及電鏡觀察

采用不連續(xù)蔗糖密梯超速離心來純化NDV嵌合病毒樣顆粒。將收集的20mL細胞上清液用角轉(zhuǎn)超速離心機4℃，100000xg，離心1個小時，棄掉離心的上清，加入5ml PBS懸浮溶解過夜。配制蔗糖溶液，質(zhì)量百分比濃度分別配成20％、45％及60％，小心裝入超速離心管中制成不連續(xù)蔗糖密度梯度。在頂層加入過夜的5ml PBS懸浮液，用水平轉(zhuǎn)頭進行超速離心，4℃，100000xg，時間1小時。在20％與45％交界處以及45％及60％交界處各有一條帶，而位于20％與45％交界處的條帶最為顯著(見圖5)。收集此處的條帶，其內(nèi)含有純化的NDV嵌合病毒樣顆粒。電鏡拍片實驗操作如下：將少量的純化濃縮后的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品固定處理后，置于銅網(wǎng)上，加2％磷鎢酸鈉溶液進行負染。電子顯微鏡下觀察并拍片。如圖6A和圖6B所示，NDV嵌合病毒樣顆粒呈圓形，有囊膜，囊膜上有一圈明顯的放射狀纖突，即表達的NDV膜表面的融合蛋白F和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN。

實施例4

對融合蛋白F基因進行點突變有助于受感染的昆蟲細胞存活因而增加NDV病毒樣顆粒的生成

新城疫(ND)病毒在自然界能引起感染的宿主細胞融合，造成宿主紅細胞溶血。在本實施例中，用帶有NDV強毒毒株的融合蛋白F基因、基質(zhì)蛋白M基因和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN基因構(gòu)建重組桿狀病毒。當用其感染昆蟲細胞制備VLP顆粒時，可以觀察到受感染的昆蟲細胞生長不良，細胞之間有融合現(xiàn)象出現(xiàn)，細胞變得巨大而不規(guī)則，易于死亡，圖7A為用未突變的融合蛋白F制備病毒樣顆粒(pFastBac-M-HN-F)與用點突變的融合蛋白ΔF制備病毒樣顆粒(pFastBac-M-HN-ΔF)時，細胞感染后的生長曲線比較；圖7B為用未突變的融合蛋白F制備病毒樣顆粒(pFastBac-M-HN-F)與用點突變的融合蛋白ΔF制備病毒樣顆粒(pFastBac-M-HN-ΔF)時細胞感染后的成活率比較；圖中Fwt:帶有未突變?nèi)诤系鞍譌的重組桿狀病毒感染的細胞生長曲線；Fmut:帶有點突變?nèi)诤系鞍爪的重組桿狀病毒感染的細胞生長曲線。用血凝效價檢測細胞上清液，所測得血凝效價很低。

用分子生物學(xué)方法對融合蛋白F基因進行定向點突變，所述點突變是將第147位的天冬酰胺突變?yōu)楸彼?，命名為N147A。具體操作如下：設(shè)計合成帶有突變位點的寡核苷酸片段做為引物，這兩個寡核苷酸片段序列分別是：

F基因點突變上游引物的序列為SEQ ID No.17所示序列；

F基因點突變下游引物序列為SEQ ID No.18所示序列。

采用PCR多聚鏈式反應(yīng)獲得帶有點突變的F融合蛋白基因DNA片段，稱為ΔF融合蛋白基因。用凝膠電泳純化及回收此DNA片段，將其作為模板，用實施例1所提到的F基因的上游引物(SEQ ID No.9)和F基因的下游引物(SEQ ID No.10)再次進行PCR多聚鏈式反應(yīng)擴增模板DNA，然后用凝膠電泳法進行DNA的純化及回收。用T4鏈接酶將回收的DNA片段平端連接到細菌質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化到DHα感受態(tài)細菌細胞中，擴增含有點突變的ΔF基因DNA片段(核苷酸序列見SEQ ID No.5)。抽提擴增后的細菌質(zhì)粒，用內(nèi)切酶將ΔF基因片段從質(zhì)粒中切下，再用T4鏈接酶接入到經(jīng)修飾后帶有NDV強毒毒株的基質(zhì)蛋白M基因和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN基因的pFastBac質(zhì)粒上。經(jīng)轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，采用菌落藍白斑篩選法，挑選陽性的白斑菌落進行培養(yǎng)，抽提DNA質(zhì)粒，獲得重組桿狀病毒pFastBac-M-HN-ΔF的Bacmid質(zhì)粒。

將帶有未突變的融合蛋白F基因的pFastBac-M-HN-F Bacmid質(zhì)粒和帶有點突變的融合蛋白ΔF基因的pFastBac-M-HN-ΔF Bacmid質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染sf-9昆蟲細胞，制備NDV病毒樣顆粒，然后進行血凝效價檢測比較，結(jié)果見圖8A和圖8B。圖8A為帶有未突變的融合蛋白F的NDV病毒樣顆粒血凝效價檢測和帶有點突變的融合蛋白ΔF的NDV病毒樣顆粒血凝效價檢測結(jié)果，圖中A行顯示用點突變的ΔF融合蛋白制備的常規(guī)NDV病毒樣顆粒樣品的血凝效價為6，B行顯示用未突變的F融合蛋白制備的常規(guī)NDV病毒樣顆粒樣品的血凝效價為4；圖8B為帶有未突變的融合蛋白F的常規(guī)NDV病毒樣顆粒樣品與帶有點突變的融合蛋白ΔF的常規(guī)NDV病毒樣顆粒樣品血凝效價示意圖；實驗結(jié)果證明，將融合蛋白F基因進行定向點突變后，能提高受感染的sf-9昆蟲細胞的存活率和細胞數(shù)量，從而提高NDV病毒樣顆粒的生成。

實施例5

用Gag前體蛋白取代NDV的基質(zhì)蛋白M能有效提高NDV病毒樣顆粒的產(chǎn)量

為了便于區(qū)別，將上述實施例4中用重組桿狀病毒pFastBac-M-HN-ΔF制備的VLP產(chǎn)物稱為NDV常規(guī)病毒樣顆粒，即一種含有NDV基質(zhì)蛋白M，點突變的融合蛋白ΔF和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN的病毒樣顆粒。而將本實施例中用Gag前體蛋白取代NDV的基質(zhì)蛋白M獲得的重組桿狀病毒pFastBac-Gag-HN-ΔF來制備的VLP產(chǎn)物稱為NDV嵌合病毒樣顆粒。具體操作簡述如下：人工基因合成Gag前體蛋白基因，抽提帶有此基因DNA片段的質(zhì)粒，進行內(nèi)切酶酶切，凝膠電泳回收和純化酶切后的Gag基因DNA片段。用相同的內(nèi)切酶處理pFastBac-M-HN-ΔF質(zhì)粒，凝膠電泳回收和純化酶切后除去基質(zhì)蛋白M基因DNA片段的pFastBac-HN-ΔF質(zhì)粒。用T4鏈接酶將Gag基因DNA片段連接到上述的質(zhì)粒中，并將此鏈接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細菌細胞中。采用菌落藍白斑篩選法，挑選陽性的白斑菌落進行培養(yǎng)，抽提DNA質(zhì)粒，獲得另一個NDV重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒，即pFastBac-Gag-HN-ΔF。用此重組桿狀病毒所制備的病毒樣顆粒是以Gag前體蛋白作為顆粒的基質(zhì)蛋白，支撐昆蟲細胞出芽，形成具有囊膜的病毒樣顆粒，釋放到細胞上清液中，即為NDV嵌合病毒樣顆粒。

為了比較NDV常規(guī)病毒樣顆粒和NDV嵌合病毒樣顆粒的產(chǎn)量差別，在嚴格控制兩種病毒樣顆粒生產(chǎn)條件使其盡量保持一致的情況下，進行了多次病毒樣顆粒的制備和血凝效價的檢測，見圖9A和9B。圖9A為含基質(zhì)蛋白M的NDV常規(guī)病毒樣顆粒樣品與含Gag前體蛋白的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品血凝效價檢測，圖中，A行顯示用Gag前體蛋白制備的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品一的血凝效價為9；B行顯示用Gag前體蛋白制備的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品二的血凝效價為9；C行顯示用M基質(zhì)蛋白制備的NDV常規(guī)病毒樣顆粒樣品一的血凝效價為7；D行顯示用M基質(zhì)蛋白制備的NDV常規(guī)病毒樣顆粒樣品二的血凝效價為6；圖9B為含基質(zhì)蛋白M的NDV常規(guī)病毒樣顆粒樣品與含Gag前體蛋白的NDV嵌合病毒樣顆粒樣品血凝效價示意圖；結(jié)果顯示，每次生產(chǎn)的NDV嵌合病毒樣顆粒產(chǎn)量都高于NDV常規(guī)病毒樣顆粒產(chǎn)量，而且重復(fù)性好，易于制備。

實施例6

NDV嵌合病毒樣顆粒疫苗能刺激家禽產(chǎn)生抗體并保護其免于強毒攻擊

為了檢測NDV嵌合病毒樣顆粒疫苗是否能有效產(chǎn)生保護作用，使免疫的雞只不受NDV強毒毒株的致命攻擊，本實施例直接用含有NDV嵌合病毒樣顆粒的細胞上清液與市面上出售的商用白油佐劑混合，按規(guī)程要求乳化制備了家禽用NDV嵌合病毒樣顆粒疫苗。疫苗乳化方法簡介如下：取細胞上清液和白油佐劑，按1:1.5的體積比率混合，置于小型電動乳化儀轉(zhuǎn)頭下進行乳化。取1ml乳化完畢的乳液放于一個小型臺式離心機的EP小管中，轉(zhuǎn)速5000rpm，室溫下離心15min。檢查管內(nèi)離心液，沒有出現(xiàn)分層現(xiàn)象，表明乳化完全，疫苗制備合格。

雞只免疫及攻毒保護試驗檢驗NDV嵌合病毒樣顆粒疫苗效力：將11只三周齡的SPF小雞分為兩組，即試驗組6只，空白對照組5只。試驗組每只小雞頸部皮下注射0.3ml的NDV嵌合病毒樣顆粒疫苗，空白對照組不免疫。三周后每只雞翅下靜脈采血1ml，進行血清抗體檢測。檢測方法采用常規(guī)的血凝抑制法。具體操作如下：將96孔微量板橫向放置，除第一列外，每孔各加25μL的PBS，但H1孔內(nèi)加50μL的PBS作為紅細胞對照。用100μL常用微量加樣器，向第一列除H1孔外的各孔中分別加入50μL采集來的各雞只的血清。取8道加樣器，將第一列的各孔樣品向微量板的第二列至第十二列依次做25μL的二倍系列稀釋。依次向除H行的各孔中加入25μL預(yù)先配置好的4單位抗原，H行加25μL的PBS，混勻后室溫靜置30min。然后每孔加入1％紅細胞懸液50μL混勻，室溫孵育30min，觀察紅細胞凝集抑制結(jié)果，血清抗體效價見圖10A，圖10A為免疫雞只血清抗體效價示意圖；采血后的第二天，全部11只雞用NDV強毒基因VII型毒株模擬自然感染途徑進行攻毒。攻毒后兩周內(nèi)連續(xù)觀察雞只生存情況，接受NDV嵌合病毒樣顆粒疫苗免疫的試驗組6只雞全部存活，而非免疫的空白對照組5只雞陸續(xù)全部死亡，見圖10B和表1，圖10B為免疫雞只攻毒保護示意圖；表1為雞只攻毒保護試驗結(jié)果。試驗結(jié)果充分證明，制備的NDV嵌合病毒樣顆粒疫苗能有效保護免疫雞只抵抗NDV強毒毒株的攻擊。

表1

注釋：“+”表示雞只存活。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

<110> 諾華生物科技（武漢）有限責任公司

<120> 新城疫病毒病毒樣顆粒、疫苗及制備方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1734

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggaagctg tgatcaaggt catctcctcc gcttgcaaga cctactgcgg caagacctcc 60

ccctccaaga aagaaatcgg tgctatgctg tccctgctgc agaaagaggg cctgctgatg 120

tccccctccg acctgtactc ccccggttcc tgggacccta tcaccgctgc tctgtcccag 180

cgtgctatga tcctgggcaa gtccggcgaa ctcaagacct ggggcctggt gctgggtgct 240

ctgaaggctg ctcgcgagga acaagtgacc tccgagcagg ctaagttctg gctgggtctg 300

ggtggtggtc gtgtgtcccc ccctggtccc gagtgcatcg agaagcccgc taccgagcgt 360

cgtatcgaca agggcgagga agtgggcgag actaccgtgc agcgtgacgc taagatggct 420

cccgaggaaa ccgctacccc caagaccgtg ggcacctcct gctaccactg cggcaccgct 480

atcggttgca actgcgctac cgcttccgct cccccccctc cttacgtggg ctccggcctg 540

tacccttccc tggctggtgt cggcgagcag caaggacagg gtggagacac ccctcccggt 600

gctgaacagt cccgtgccga gcctggtcac gctggtcaag ctcccggtcc cgctctgact 660

gactgggctc gtgtgcgtga ggaactggct tccaccggtc cccctgtggt ggctatgccc 720

gtggtcatca agaccgaggg tcccgcttgg acccccctgg aacccaagct gatcacccgt 780

ctggctgaca ccgtgcgtac caagggcctg cgttccccaa tcaccatggc tgaggtggag 840

gctctgatgt cctcccccct gctgcctcac gacgtgacca acctgatgcg tgtgatcctg 900

ggtcccgctc cctacgctct gtggatggac gcttggggcg tgcagctgca gaccgtgatc 960

gctgctgcta cccgtgaccc ccgtcaccct gctaacggac agggtcgtgg cgagcgtacc 1020

aacctgaacc gtctgaaggg cctggctgac ggcatggtcg gcaaccctca gggacaggct 1080

gctctgctgc gtcctggcga gctggtcgct atcaccgcca gcgctctgca ggctttccgt 1140

gaggtggccc gtttggccga accagctggt ccctgggctg acatcatgca gggcccctcc 1200

gagtccttcg tggacttcgc taaccgtctg atcaaggctg tggagggctc cgacctccct 1260

ccttccgctc gtgctcccgt gatcatcgac tgcttccgtc agaagtccca gcccgacatc 1320

cagcagctga tccgtaccgc tccctccacc ctgactaccc ctggcgagat catcaagtac 1380

gtgctggacc gtcaaaagac cgctcccctg accgaccaag gtatcgctgc cgctatgtcc 1440

tccgctatcc agcccctgat catggctgtc gtgaaccgcg agagggacgg acagaccggt 1500

tccggtggtc gtgctcgtgg cctgtgctac acttgcggtt cccccggtca ctaccaggct 1560

cagtgcccca agaagcgcaa gtccggaaac tcccgcgagc gctgccagct ctgcaacggc 1620

atgggtcaca acgccaagca gtgccgcaag cgcgacggaa accagggcca gcgtcccgga 1680

aagggactgt cctccggtcc ttggcctggt cctgagcccc ctgctgtgtc ctaa 1734

<210> 2

<211> 577

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Ala Val Ile Lys Val Ile Ser Ser Ala Cys Lys Thr Tyr Cys

Gly Lys Thr Ser Pro Ser Lys Lys Glu Ile Gly Ala Met Leu Ser Leu

Leu Gln Lys Glu Gly Leu Leu Met Ser Pro Ser Asp Leu Tyr Ser Pro

Gly Ser Trp Asp Pro Ile Thr Ala Ala Leu Ser Gln Arg Ala Met Ile

Leu Gly Lys Ser Gly Glu Leu Lys Thr Trp Gly Leu Val Leu Gly Ala

Leu Lys Ala Ala Arg Glu Glu Gln Val Thr Ser Glu Gln Ala Lys Phe

Trp Leu Gly Leu Gly Gly Gly Arg Val Ser Pro Pro Gly Pro Glu Cys

Ile Glu Lys Pro Ala Thr Glu Arg Arg Ile Asp Lys Gly Glu Glu Val

Gly Glu Thr Thr Val Gln Arg Asp Ala Lys Met Ala Pro Glu Glu Thr

Ala Thr Pro Lys Thr Val Gly Thr Ser Cys Tyr His Cys Gly Thr Ala

Ile Gly Cys Asn Cys Ala Thr Ala Ser Ala Pro Pro Pro Pro Tyr Val

Gly Ser Gly Leu Tyr Pro Ser Leu Ala Gly Val Gly Glu Gln Gln Gly

Gln Gly Gly Asp Thr Pro Pro Gly Ala Glu Gln Ser Arg Ala Glu Pro

Gly His Ala Gly Gln Ala Pro Gly Pro Ala Leu Thr Asp Trp Ala Arg

Val Arg Glu Glu Leu Ala Ser Thr Gly Pro Pro Val Val Ala Met Pro

Val Val Ile Lys Thr Glu Gly Pro Ala Trp Thr Pro Leu Glu Pro Lys

Leu Ile Thr Arg Leu Ala Asp Thr Val Arg Thr Lys Gly Leu Arg Ser

Pro Ile Thr Met Ala Glu Val Glu Ala Leu Met Ser Ser Pro Leu Leu

Pro His Asp Val Thr Asn Leu Met Arg Val Ile Leu Gly Pro Ala Pro

Tyr Ala Leu Trp Met Asp Ala Trp Gly Val Gln Leu Gln Thr Val Ile

Ala Ala Ala Thr Arg Asp Pro Arg His Pro Ala Asn Gly Gln Gly Arg

Gly Glu Arg Thr Asn Leu Asn Arg Leu Lys Gly Leu Ala Asp Gly Met

Val Gly Asn Pro Gln Gly Gln Ala Ala Leu Leu Arg Pro Gly Glu Leu

Val Ala Ile Thr Ala Ser Ala Leu Gln Ala Phe Arg Glu Val Ala Arg

Leu Ala Glu Pro Ala Gly Pro Trp Ala Asp Ile Met Gln Gly Pro Ser

Glu Ser Phe Val Asp Phe Ala Asn Arg Leu Ile Lys Ala Val Glu Gly

Ser Asp Leu Pro Pro Ser Ala Arg Ala Pro Val Ile Ile Asp Cys Phe

Arg Gln Lys Ser Gln Pro Asp Ile Gln Gln Leu Ile Arg Thr Ala Pro

Ser Thr Leu Thr Thr Pro Gly Glu Ile Ile Lys Tyr Val Leu Asp Arg

Gln Lys Thr Ala Pro Leu Thr Asp Gln Gly Ile Ala Ala Ala Met Ser

Ser Ala Ile Gln Pro Leu Ile Met Ala Val Val Asn Arg Glu Arg Asp

Gly Gln Thr Gly Ser Gly Gly Arg Ala Arg Gly Leu Cys Tyr Thr Cys

Gly Ser Pro Gly His Tyr Gln Ala Gln Cys Pro Lys Lys Arg Lys Ser

Gly Asn Ser Arg Glu Arg Cys Gln Leu Cys Asn Gly Met Gly His Asn

Ala Lys Gln Cys Arg Lys Arg Asp Gly Asn Gln Gly Gln Arg Pro Gly

Lys Gly Leu Ser Ser Gly Pro Trp Pro Gly Pro Glu Pro Pro Ala Val

Ser

<210> 3

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300

ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360

gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420

caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480

gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540

ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600

ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660

gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720

agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780

atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840

agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900

tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960

ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagga 1020

gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080

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ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200

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taa 1503

<210> 4

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp

Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys

His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro

Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu

Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn

Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp

Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys

Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val

Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His

Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu

Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser

Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly

Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu

Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala

Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr

Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile

Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys

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Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu

Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr

Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala

Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly

Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser

Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg

Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His

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Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn

Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe

Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg

Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp

Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ser Asp

Pro Ser Ser Gln

<210> 5

<211> 1662

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgggctcca aaccttctac caggatccca gcacctctaa tgctgatcac tcggattatg 60

ctgatattga gctgtatccg tctgacaagc tctcttgacg gcaggcccct tgcagctgca 120

ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180

atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agagataagg aggcatgtgc aaaagcccca 240

ttggaggcat ataacagaac actgactact ctgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300

aagatccaag ggtctgtgtc cacgtccgga ggaaggagac aacagcgctt cataggtgct 360

gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420

ctaatacaag ccaaacaggc tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480

accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540

aggatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600

aaaatcacac aacaggtcgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660

ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720

ttagctggta gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtataggaaa caatcaactc 780

agttcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tattgtatga ctcacatact 840

caactcttgg gcatacaagt aaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900

acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc gcttgtcccg 960

aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020

tctgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080

tcctgtttga gcggcaacac atcagcctgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140

acgccataca tggcccttag aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgcaga 1200

tgtacggacc ctcctggtat tatatcacaa aattacggag aagctgtatc cctgatagat 1260

agacattcat gcaatgtctt atcactagac ggaataactc tgaggctcag tggggaattt 1320

gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ttagattctc aggtcatcgt gacaggcaat 1380

cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcag tcagcaatgc cttggatagg 1440

ttggcagaga gcaacggcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaactag cacatctgct 1500

ctcattacct atattgttct aactgtcgtt tccctaattt tcggtgcact tagtctggtt 1560

ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa agaccttgtt atggcttggg 1620

aataataccc tcgatcagat gagagccacc acaagagcat ga 1662

<210> 6

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile

Thr Arg Ile Met Leu Ile Leu Ser Cys Ile Arg Leu Thr Ser Ser Leu

Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys

Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys

Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro

Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly

Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Arg

Arg Gln Gln Arg Phe Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly

Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala

Lys Gln Ala Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala

Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ser

Val Ala Val Gly Arg Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Asn

Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val

Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln

Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

Leu Ala Gly Ser Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly

Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr

Pro Ile Leu Tyr Asp Ser His Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn

Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu

Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Pro

Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser

Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr

Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser

Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met

Ala Leu Arg Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg

Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val

Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile

Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile

Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser

Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Val Ser Asn Ala Leu Asp Arg

Leu Ala Glu Ser Asn Gly Lys Leu Glu Lys Val Asn Val Arg Leu Thr

Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Val Ser Leu

Ile Phe Gly Ala Leu Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys

Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu

Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Arg Ala

<210> 7

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工序列

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atggaccgcg cagttggcag agtcgtgctg gagaatgagg aaagagaagc aaagaacaca 60

tggcgcttag ttttccggat cgcagtctta tttttaatgg taatgactct agctatctcc 120

gcagctgccc tggcatacag catgggggcc agtacgccgc acgacctcgc aggcatatcg 180

actgtgatct ccaaggcaga agataaggtt acgtctttac tcagttcaag tcaagatgtg 240

acaaatagga tatacaagca ggtagctctt gaatccccgc tggcactact aaacactgaa 300

tctataatta tgaatgcaat aacctctctt tcttatcaaa ttaacggggc tgagaacaat 360

agcggatgtg gtgcgcctgt tcatgaccca gattatatcg gggggatagg caaagaactc 420

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cactcacatc aatacttagc acttggtgtg cttcggacat ctgcaacagg gagggtattc 660

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aacaacacat gccccgataa acaagattac caaattcgga tggctaagtc ctcatataaa 1080

cccgggcgat ttggtggaaa gcgcgtacag caagccatcc tatctatcaa agtgtcaaca 1140

tccctgggta aggacccggt gctgactatc ccacctaata caatcacact catgggagcc 1200

gaaggcagaa tcctcacagt agggacatct cacttcttgt accaacgagg gtcttcatat 1260

ttctcccctg ccttattgta tcccatgaca gtaaataaca aaacggctac actccatagt 1320

ccttacatgt ttaatgcttt cactcggcca ggtagtgtcc cctgccaggc atcagcaaga 1380

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<210> 8

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<212> PRT

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Met Asp Arg Ala Val Gly Arg Val Val Leu Glu Asn Glu Glu Arg Glu

Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Ile Ala Val Leu Phe Leu

Met Val Met Thr Leu Ala Ile Ser Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Ser Met

Gly Ala Ser Thr Pro His Asp Leu Ala Gly Ile Ser Thr Val Ile Ser

Lys Ala Glu Asp Lys Val Thr Ser Leu Leu Ser Ser Ser Gln Asp Val

Thr Asn Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu

Leu Asn Thr Glu Ser Ile Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr

Gln Ile Asn Gly Ala Glu Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val His

Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp

Ile Ser Gly Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr Lys Glu His Leu

Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro

Ser Phe Asp Met Ser Thr Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile

Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu

Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Gly

Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Lys Ser Val Ala Pro Thr Ser Met Val His

Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Thr

Thr Val Leu Phe Lys Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly

Gly Ser Phe Ile Asp Gly Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu

Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ala Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile

Tyr Lys Arg His Asn Asn Thr Cys Pro Asp Lys Gln Asp Tyr Gln Ile

Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg

Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Lys

Asp Pro Val Leu Thr Ile Pro Pro Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly Ala

Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg

Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Asn

Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Met Phe Asn Ala Phe Thr

Arg Pro Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser

Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe His Arg

Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Glu Gln

Ala Arg Leu Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Asn Ile Ser Arg Ser

Arg Val Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr

Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Val Tyr Cys Leu Ser

Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro

Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Arg Val

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