本發(fā)明涉及一種使用全懸浮技術(shù)生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗的方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豬偽狂犬病是由豬的偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一種豬急性傳染病。豬偽狂犬病病毒可以感染不同年齡段的豬，但以妊娠母豬和哺乳仔豬感染最為嚴(yán)重：導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎；哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達100％。(鄧仕偉，汪勇，薛春芳。我國偽狂犬病流行現(xiàn)狀及新特點.動物醫(yī)學(xué)進展，2006,27(9)：105-107)(TambaM,CalabreseR,FinelliE,etal.RiskfactorsforAujeszky’s-diseaseseropositivityofswineherdsofaregionofnorthernItaly.PrevVetMed,2002,54(3):203-212)。我國于上世紀(jì)70年代從匈牙利引進了PRVBartha-K61株，該病毒株是公認(rèn)的優(yōu)良疫苗株，上世紀(jì)90年代以來國內(nèi)規(guī)?；i場普遍使用該疫苗進行防治，對豬偽狂犬病起到了很好的控制作用。但是，自2011年以來，在我國華北、華中、華東、東北等地區(qū)的許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)?；i場出現(xiàn)了疑似豬偽狂犬病的流行，發(fā)病豬場數(shù)量多，損失較大，主要表現(xiàn)為豬群gE抗體陽性率顯著升高，母豬產(chǎn)弱仔、死胎，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等。通過對發(fā)病豬群組織器官中PRV病毒的序列分析及致病性研究，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)豬偽狂犬病病毒的抗原性發(fā)生了一定程度的變異，變異偽狂犬毒株對豬的致病性更強。(趙鴻遠等.豬偽狂犬病病毒變異株的分離鑒定及其gE基因的分子特征.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，1008-0589(2014)07-0506-04)。ST細胞，即豬睪丸細胞，屬于成纖維細胞，體外可連續(xù)傳代貼壁培養(yǎng)，該細胞系對多種病毒敏感，如：豬細小病毒、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等，是疫苗生產(chǎn)中繁殖病毒的主要原輔材料之一。ST細胞培養(yǎng)是病毒類疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)，直接影響到疫苗的質(zhì)量，如何穩(wěn)定獲得足量的細胞對于保證生產(chǎn)能力和產(chǎn)品質(zhì)量尤為重要。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)ST細胞技術(shù)是目前獸用病毒類疫苗生產(chǎn)中使用最為普遍的細胞培養(yǎng)方法，優(yōu)勢是工藝簡單、成本低廉，然而生產(chǎn)效率低、勞動強度高、產(chǎn)品均一度差等問題一直很難從根本上得以解決。(陳文慶,王建超,劉華杰等.懸浮培養(yǎng)工藝與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的比較分析[J].中國獸藥雜志,2010,44(10):37-41)?；谵D(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的弊端，懸浮培養(yǎng)開始應(yīng)用于生產(chǎn)實際之中。ST細胞懸浮培養(yǎng)工藝可控制一系列細胞培養(yǎng)參數(shù)，具有培養(yǎng)病毒含量高，無須混合，批間差異小，培養(yǎng)方式自動化，無須大量生產(chǎn)人員，培養(yǎng)需求面積小、污染小、成本低等優(yōu)點，且避免了BVDV等外源病原污染，是疫苗制備中首選的細胞培養(yǎng)技術(shù)。目前懸浮培養(yǎng)應(yīng)用主要是微載體懸浮培養(yǎng)。全懸浮培養(yǎng)在獸用疫苗方面，率先應(yīng)用于口蹄疫疫苗的生產(chǎn)，之后懸浮培養(yǎng)工藝在生物制藥行業(yè)引發(fā)一定的效應(yīng)，疫苗生產(chǎn)企業(yè)越來越關(guān)注新工藝。本申請人在為豬場提供疾病診斷的過程中，從送檢病料中分離到一株gE基因自然缺失的變異株弱毒HZ株。我們用HZ株作為制苗用毒株，在對HZ株進行安全性、免疫原性等研究的基礎(chǔ)上，嘗試了ST細胞全懸浮生產(chǎn)豬偽狂犬疫苗的工藝。該工藝關(guān)鍵技術(shù)在于細胞馴化，ST細胞全懸浮馴化成功后，可用于豬偽狂犬病毒的培養(yǎng)。較其它微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有操作簡單、可控性強、培養(yǎng)效率和自動化程度高、不需要載體等優(yōu)勢，為細胞或疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了一條新的路徑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種ST細胞全懸浮生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗的工藝，從而降低生產(chǎn)成本，進行規(guī)?；⒕恍陨a(chǎn)，以應(yīng)對目前國內(nèi)豬偽狂犬病毒病流行形勢。本發(fā)明的技術(shù)方案1.一種使用全懸浮技術(shù)生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗的方法，其特征在于其制備方法包括細胞培養(yǎng)、更換細胞培養(yǎng)液并接毒和收獲工序，即先將ST細胞用搖瓶進行懸浮培養(yǎng)擴增后接入生物反應(yīng)器進行懸浮培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至病毒接種密度后更換一部分細胞培養(yǎng)液并接入病毒種子液，在生物反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束后收獲病毒液，加入適宜的凍干保護劑混勻分裝后經(jīng)真空凍干而成。2.如權(quán)利要求1所述一種使用全懸浮技術(shù)生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述更換細胞培養(yǎng)液并接毒工序為使用ST細胞在生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)至可接毒狀態(tài)時，將細胞培養(yǎng)液的1/3換成新的細胞培養(yǎng)液，并接種豬偽狂犬病病毒。3.如權(quán)利要求1所述一種使用全懸浮技術(shù)生產(chǎn)偽狂犬病病毒的方法，其特征在于所述方法具體為：(1)將ST細胞用搖瓶懸浮培養(yǎng)48h～72h后離心，用細胞培養(yǎng)液將經(jīng)離心的細胞再懸浮后以密度3×105～3×106/ml接入生物反應(yīng)器，進行ST細胞全懸浮培養(yǎng)；(2)待ST細胞全懸浮培養(yǎng)至密度為6×105/ml～6×106/ml，生物反應(yīng)器15℃沉降2小時，泵出上層1/3的原培養(yǎng)液注入新的細胞培養(yǎng)液，并按照體積比1％～5％接種偽狂犬病病毒種毒；(3)在生物反應(yīng)器中繼續(xù)培養(yǎng)懸浮細胞，待80％左右的細胞出現(xiàn)典型CPE時，收獲病毒液，加入適宜的凍干保護劑混勻后分裝，經(jīng)冷凍真空干燥制成疫苗。4.如權(quán)利要求1-3所述一種使用全懸浮技術(shù)生產(chǎn)偽狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述的病毒為保藏號為CGMCCNo.11912的偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus)HZ株。5.如權(quán)利要求1所述一種使用全懸浮技術(shù)生產(chǎn)豬偽狂犬病的方法，其特征在于所述ST細胞株的建立，是由豬睪丸傳代細胞(ST細胞系)經(jīng)貼壁培養(yǎng)階段的低血清馴化過程和低血清培養(yǎng)液懸浮馴化過程而獲得，該株細胞被命名為豬睪丸細胞系(Porcinetestis)懸浮適應(yīng)株，簡稱ST-1株。該株細胞已于2016年08月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.12698。以上本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)液系指低血清細胞培養(yǎng)液，其血清含量(V/V)為0.5％～2％。使用的細胞生物反應(yīng)器為APPLIKON公司30L～2000L細胞生物反應(yīng)器。本發(fā)明公開的ST細胞全懸浮培養(yǎng)豬偽狂犬病疫苗的工藝，其操作簡單、可控性強、培養(yǎng)效率和自動化程度高、不需要載體，可以在低血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，為細胞或疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)提供了一條新的路徑。具體實施方式一、全懸浮培養(yǎng)的ST細胞株的建立馴化過程1.ST細胞貼壁培養(yǎng)階段的馴化(降低血清)：從液氮罐中取ST貼壁細胞種子(CVCC，No.CL27，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國微生物菌種保藏管理中心，見《中國獸醫(yī)菌種目錄》(第二版)，p171))，在T75培養(yǎng)瓶中加入10％新生牛血清的細胞生長液，進行ST細胞復(fù)蘇，并貼壁培養(yǎng)，使用逐步降低血清的貼壁培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)馴化。血清含量從10％、8％、5％、3％、2％、1％降至0.5％。2.ST細胞(低血清培養(yǎng)基)的懸浮馴化將馴化成功的ST細胞F39的一部分收獲，并凍存，記為ST-1F0。ST細胞馴化過程可以看出，該細胞在貼壁階段血清含量由10％降至低血清水平(0.5％～2％)，細胞的數(shù)量和活力均能達到實驗要求。而從貼壁到懸浮，通過39代的馴化培養(yǎng)，細胞才能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)狀態(tài)，并能穩(wěn)定增值到1.2×106/ml，細胞活力達到90％以上。通過對全懸浮培養(yǎng)條件(pH、轉(zhuǎn)速)的工藝優(yōu)化，確定了pH7.0±0.1、轉(zhuǎn)速120r/min，實現(xiàn)了ST細胞從三角培養(yǎng)瓶到生物反應(yīng)器的擴大培養(yǎng)，并對生物反應(yīng)器中的溶氧量進行了改進，從而完成了ST細胞從貼壁到全懸浮的整個馴化過程，并將馴化成功后的懸浮細胞命名為豬睪丸細胞系(Porcinetestis)懸浮適應(yīng)株(簡稱ST-1株)。該株細胞已于2016年08月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為此CGMCCNo.12698。(詳見實施例1)二、全懸浮細胞的制備1.細胞搖瓶擴大培養(yǎng)：細胞復(fù)蘇后以5×105/ml的密度接入到125ml三角培養(yǎng)瓶中，以120r/min轉(zhuǎn)速于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至1.2×106/ml時，進行傳代，按照比例補加新鮮培養(yǎng)基，使細胞初始密度為5×105/ml。2.細胞接種生物反應(yīng)器：細胞接種前矯正溶氧電極，通CO2調(diào)整pH至7.0±0.1，取需要量的搖瓶細胞(密度約1.2×106/ml)離心后，用200ml(200ml/1000ml)細胞培養(yǎng)液回懸后接入生物反應(yīng)器。三、制苗用毒液的制備及配苗1.接毒：待ST細胞全懸浮培養(yǎng)密度約6×105/ml～6×106/ml，生物反應(yīng)器15℃沉降2小時，泵出上層1/3的原培養(yǎng)液，注入新的細胞培養(yǎng)液，并接種2％(V/V)生產(chǎn)用毒種(保藏編號為CGMCCNo.11912的豬偽狂犬病病毒HZ株)。2.收獲病毒液及配苗：在生物反應(yīng)器中繼續(xù)培養(yǎng)懸浮細胞，待80％左右的細胞出現(xiàn)典型CPE時，收獲病毒液，加適宜耐熱凍干保護劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成疫苗。3.豬偽狂犬病疫苗的檢驗(1)性狀微黃白色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。(2)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會，中華人民共和國獸藥典，二〇一五年版三部，中國農(nóng)業(yè)出版社，2016，以下稱《中國獸藥典》)附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。(3)支原體檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無支原體生長。(4)外源病毒檢驗將疫苗與豬偽狂犬病病毒特異性抗血清中和后，接種Vero細胞、MDBK細胞、ST細胞單層，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無外源病毒污染。(5)鑒別檢驗1)血清中和試驗將疫苗稀釋至200TCID50/0.1ml，與等量1:10稀釋的豬偽狂犬病病毒特異性抗血清混合，經(jīng)37℃中和1小時后，接種已長成單層的ST細胞96孔微量細胞培養(yǎng)板，共接種12孔，每孔100μl。同時設(shè)不中和對照組(將疫苗稀釋至200TCID50/0.1ml，與等量培養(yǎng)液混合)和正常細胞對照組，各接種6孔，每孔100μl。每孔補加含2％新生牛血清的細胞培養(yǎng)液100μl。將細胞培養(yǎng)板置37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察96～120小時。中和組和細胞對照組應(yīng)不出現(xiàn)CPE，不中和對照組應(yīng)全部出現(xiàn)CPE。2)病毒基因鑒定采用基因鑒定PCR檢測法，用擴增gB基因的引物(序列1、序列2)進行PCR檢測，應(yīng)擴增出大小約為600bp的特異性條帶。用擴增gE基因的引物(序列3、序列4)進行PCR檢測，應(yīng)擴增不出大小約為298bp的特異性條帶。(6)安全檢驗用3～4周齡健康易感仔豬5頭，每頭肌肉接種疫苗10頭份，觀察14日，仔豬應(yīng)全部健活。(7)效力檢驗將疫苗稀釋至1頭份/ml后，免疫5頭3～4周齡健康易感仔豬，每頭肌肉接種疫苗1頭份，同時設(shè)對照仔豬5頭。免疫后21日，連同對照豬用豬偽狂犬病病毒S12株強毒(106.5TCID50/ml)攻毒，每頭滴鼻2ml、肌肉注射2ml，攻毒后觀察10日。對照豬應(yīng)全部發(fā)病，免疫豬應(yīng)全部保護。(8)真空度測定按《中國獸藥典》附錄進行測定，應(yīng)符合規(guī)定。(9)剩余水分測定按《中國獸藥典》附錄進行測定，應(yīng)符合規(guī)定。本發(fā)明涉及的生物材料資源信息本發(fā)明涉及到的豬偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus)HZ株，系本申請人自行由菏澤某豬場采集病死豬腦和扁桃體組織病料中分離、鑒定而獲得，該毒株為gE基因自然缺失的變異株弱毒。該毒株已于2016年05月10日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCNo.11912；豬睪丸傳代細胞ST株，保藏編號為CVCC，No.CL27，(中國微生物菌種保藏管理中心編著《中國獸醫(yī)菌種目錄》(第二版)，中國農(nóng)業(yè)出版社，2002，p171)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬睪丸細胞系(Porcinetestis)懸浮培養(yǎng)適應(yīng)株(簡稱ST-1株)該株細胞已于2016年08月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為此CGMCCNo.12698。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明一種使用全懸浮技術(shù)生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗的方法。本發(fā)明涉及的ST細胞全懸浮培養(yǎng)的工藝，其關(guān)鍵技術(shù)在于ST細胞全懸浮馴化成功后可在生物反應(yīng)器進行豬偽狂犬病毒的大規(guī)模培養(yǎng)，具有操作簡單、可控性強、培養(yǎng)效率和自動化程度高、不需要載體等優(yōu)勢，為細胞或疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了一條新的路徑。實施例以下是本發(fā)明具體的實施方案，以進一步闡述本發(fā)明，但不能解釋為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1——全懸浮培養(yǎng)的ST細胞株的建立1.ST細胞貼壁培養(yǎng)階段的馴化(低血清馴化過程)從液氮罐中取ST貼壁細胞種子，在T75培養(yǎng)瓶中加入10％MEM細胞生長液，進行細胞復(fù)蘇培養(yǎng)，接種比例為1:1，24h后換液。待細胞長成致密單層且生長狀態(tài)良好時，0.05％胰酶消化2遍，用移液管輕輕吹打成單細胞懸浮液，按照1:3的比例傳代，進行ST細胞貼壁培養(yǎng)，并向下繼續(xù)傳代至F3。用0.05％胰酶消化液將細胞進行分離，500～1000r/min離心，使用低血清貼壁培養(yǎng)基重新混合均勻，以3×105～5×105個/ml進行傳代培養(yǎng)馴化。血清含量從10％、8％、5％、3％、2％、1％降至0.5％，每個血清含量細胞狀態(tài)穩(wěn)定后繼續(xù)傳代三代，然后轉(zhuǎn)到下一個血清含量。觀察細胞的生長情況。見表1。表1ST細胞貼壁培養(yǎng)低血清馴化試驗結(jié)果血清含量接種密度貼壁情況生長狀況數(shù)量活力10％3.2×105++++++++3.4×10698％8％2.7×105++++++++3.5×10699％5％2.9×105+++++++3.0×10696％3％3.0×105+++++++3.1×10697％2％2.8×105+++++++2.9×10697％1％3.1×105+++++++2.8×10696％0.5％3.1×105+++++++3.0×10698％經(jīng)過緩慢(37代)的細胞馴化傳代培養(yǎng)，試驗結(jié)果顯示用10％～5％血清含量的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，48h左右即可長成致密細胞單層；從3％降至0.5％血清含量的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，傳第1代時，有少許死細胞，但不影響細胞貼壁和生長，傳3到5代后可按照常規(guī)方法進行分瓶傳代，馴化穩(wěn)定后，72h左右長成致密細胞且細胞狀態(tài)良好。考慮到生產(chǎn)成本問題，將細胞生長液的血清含量定為0.5％～2％。2.ST細胞(含0.5％～2％新生牛血清的低血清培養(yǎng)基)的懸浮馴化(1)不同代次細胞懸浮培養(yǎng)的馴化將馴化好的低血清細胞培養(yǎng)液(0.5％～2％新生牛血清的細胞培養(yǎng)液)培養(yǎng)的長成致密單層的ST貼壁細胞穩(wěn)定傳代3代后，記為STF0。1)待馴化好的低血清細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)ST貼壁細胞(F5)生長成致密細胞單層時，0.05％胰酶消化，用移液管輕輕吹打成單細胞懸浮液，以5×105個/ml的密度接入到125ml三角培養(yǎng)瓶中，用低血清培養(yǎng)液補足至40ml，以120r/min轉(zhuǎn)速于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔72h離心換液(含2％新生牛血清的細胞培養(yǎng)液)，并依此方法連續(xù)培養(yǎng)傳代，直至50代，培養(yǎng)過程中對每代細胞取樣計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。2)待馴化好的低血清細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)ST貼壁細胞(F8)生長成致密細胞單層時，0.05％胰酶消化，用移液管輕輕吹打成單細胞懸浮液，以5×105個/ml的密度接入到125ml三角培養(yǎng)瓶中，用低血清培養(yǎng)液補足至40ml，以120r/min轉(zhuǎn)速于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔72h離心換液(含2％新生牛血清的細胞培養(yǎng)液)，并依此方法連續(xù)培養(yǎng)傳代，直至50代，培養(yǎng)過程中對每代細胞取樣計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。3)待馴化好的低血清細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)ST貼壁細胞(F11)生長成致密細胞單層時，0.05％胰酶消化，用移液管輕輕吹打成單細胞懸浮液，以5×105個/ml的密度接入到125ml三角培養(yǎng)瓶中，用低血清培養(yǎng)液補足至40ml，以120r/min轉(zhuǎn)速于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔72h離心換液(含2％新生牛血清的細胞培養(yǎng)液)，并依此方法連續(xù)培養(yǎng)傳代，直至50代，培養(yǎng)過程中對每代細胞取樣計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。試驗結(jié)果：從上述第2)項F8開始將貼壁細胞馴化為懸浮細胞，剛開始細胞死亡數(shù)較多，經(jīng)過不斷地離心換液傳代，傳至F39時，全懸浮培養(yǎng)72h，細胞密度達到2.26×106/ml，細胞活力達到94％。第1)項和第3)項的細胞均未馴化成功。將馴化成功的ST細胞F39的一部分收獲，并凍存，記為ST-1F0。(2)培養(yǎng)液pH對懸浮培養(yǎng)細胞的影響在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，將細胞培養(yǎng)液的pH分別設(shè)置為6.8±0.1、7.0±0.1、7.2±0.1和7.4±0.1，37℃培養(yǎng)72h后，取樣計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。當(dāng)ST細胞培養(yǎng)液pH為7.0±0.1時，培養(yǎng)液的pH下降較快，細胞生長快，細胞密度比同期其他試驗組高，細胞活性也較好。當(dāng)pH在6.8±0.1或7.4±0.1時，培養(yǎng)48h后細胞生長緩慢，細胞密度顯著低于其他試驗組。所以ST細胞培養(yǎng)液理想pH為7.0±0.1。(3)轉(zhuǎn)速對懸浮培養(yǎng)細胞的影響培養(yǎng)條件同“(2)”，以不同轉(zhuǎn)速進行懸浮培養(yǎng)，第1種:80r/min，第2種:120r/min，均在37℃培養(yǎng)72h后，取樣計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。80r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)ST細胞，細胞聚團嚴(yán)重，細胞貼覆在罐壁和罐底的情況較多，而采用120r/min轉(zhuǎn)速更有利于ST細胞的生長。3.低血清全懸浮培養(yǎng)ST-1細胞在生物反應(yīng)器中放大細胞接種前一天，生物反應(yīng)器中打入800ml(800ml/1000ml)細胞培養(yǎng)液(含2％新生牛血清)，通飽和空氣過夜。用常規(guī)方法從液氮中復(fù)蘇馴化好的ST-1懸浮細胞，經(jīng)500～1000r/min進行離心，將細胞加入到250ml三角瓶內(nèi)，加入0.5％～2％MEM懸浮培養(yǎng)液，將細胞密度調(diào)整為5×105/ml，置于37℃，120rpm在搖床內(nèi)進行培養(yǎng)。細胞生長到1.2×106/ml以上即可進行傳代培養(yǎng)，以此方法進行放大培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)體積達到200ml時，可以將懸浮細胞轉(zhuǎn)至3L生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。依此將細胞轉(zhuǎn)入10L、30L生物反應(yīng)器中，摸索細胞生長的最佳條件。將pH分別設(shè)定為7.0±0.1，溶氧量設(shè)定為40％、80％，觀察在兩種情況下低血清懸浮細胞ST-1在生物反應(yīng)器中的增殖情況。溶氧量為40％與80％時，最高細胞密度均大于2.0×106/ml，且活力均能達到90％以上，二者相差不大。因此，選擇40％溶氧量作為ST細胞全懸浮培養(yǎng)通氣量。試驗結(jié)果見表2。表2ST-1懸浮細胞在各反應(yīng)器中生長試驗結(jié)果從ST細胞馴化過程可以看出，該細胞在貼壁階段血清含量由10％降至低血清水平(0.5％～2％)，細胞的數(shù)量和活力均能達到實驗要求。而從貼壁到懸浮，通過39代的馴化培養(yǎng)，細胞才能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)狀態(tài)，并能穩(wěn)定增值到1.2×106/ml，細胞活力達到90％以上。通過對全懸浮培養(yǎng)條件(pH、轉(zhuǎn)速)的工藝優(yōu)化，確定了pH7.0±0.1、轉(zhuǎn)速120r/min，實現(xiàn)了ST細胞從三角培養(yǎng)瓶到生物反應(yīng)器的擴大培養(yǎng)，并對生物反應(yīng)器中的溶氧量進行了改進，從而完成了ST細胞從貼壁到全懸浮的整個馴化過程，并將馴化成功后的懸浮細胞命名為豬睪丸細胞系(Porcinetestis)懸浮適應(yīng)株(簡稱ST-1株)。該株細胞已于2016年08月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.12698。實施例2——適應(yīng)全懸浮培養(yǎng)的ST細胞株的擴增培養(yǎng)將液氮保存的豬睪丸細胞懸浮適應(yīng)株ST-1復(fù)蘇傳代培養(yǎng)，后接種到生物反應(yīng)器中進行全懸浮放大培養(yǎng)，得到ST-1細胞懸浮培養(yǎng)液。具體步驟如下：1.取液氮凍存的ST-1細胞株，快速復(fù)蘇后加入裝有培養(yǎng)液的搖瓶中，于36～37℃培養(yǎng)60～72h，按照1:3～1:5的比例傳代放大培養(yǎng)；2.細胞接種前一天，生物反應(yīng)器中打入800ml(800ml/1000ml)培養(yǎng)基(含2％新生牛血清)，通飽和空氣過夜。3.細胞接種：細胞接種前矯正溶氧電極，通CO2調(diào)整pH至7.0±0.1，培養(yǎng)溫度為36～37℃，轉(zhuǎn)速120r/min，溶氧量為40％，取需要量的搖瓶細胞(密度約1.2×106/ml)離心后，用200ml(200ml/1000ml)培養(yǎng)基回懸后接入生物反應(yīng)器中進行懸浮培養(yǎng)。實施例3——ST細胞全懸浮生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗的工藝1.生產(chǎn)用毒種制備取生長良好的ST細胞單層，棄去生長液，換以含1％～5％毒種的維持液，置34～35℃繼續(xù)培養(yǎng)，待80％左右的細胞出現(xiàn)典型CPE時收獲。定量分裝，注明收獲日期、毒種代數(shù)等，冷凍保存。2.制苗用毒液的繁殖(1)細胞生物反應(yīng)器清洗、滅菌：將細胞生物反應(yīng)器清洗干凈，121℃滅菌30min。(2)細胞接種：在搖瓶中懸浮培養(yǎng)擴增ST-1細胞，達到一定密度1.2×106/ml后，接種入生物反應(yīng)器，細胞培養(yǎng)條件為：反應(yīng)器工作體積30L，細胞接種前矯正溶氧電極，通CO2調(diào)整pH至7.0±0.2，培養(yǎng)溫度為36～37℃，溶氧量為40％，取需要量的搖瓶細胞(密度約1.2×106/ml)離心后，用細胞培養(yǎng)液回懸后接入生物反應(yīng)器中進行懸浮培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2～3日。(3)接毒及收獲：待ST-1細胞全懸浮培養(yǎng)至密度約1.2×106/ml，生物反應(yīng)器15℃沉降2小時，1/3換1％～2％新生牛血清的MEM(低血清)病毒培養(yǎng)維持液，并按照病毒培養(yǎng)維持液培養(yǎng)基終體積的1％～5％接種豬偽狂犬病毒HZ株，病毒培養(yǎng)條件為溫度33～35℃，pH值為7.0±0.2，溶氧為40％，待80％左右的細胞出現(xiàn)典型CPE時收獲并撤罐。共生產(chǎn)3批病毒液。3.半成品檢驗(1)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。(2)病毒含量每毫升病毒含量均≥106.8TCID50。4.配苗及分裝將檢驗合格的病毒液與適宜保護劑按一定比例混合均勻后，定量分裝。每頭份疫苗含豬偽狂犬病病毒≥106.5TCID50。5.凍干分裝后迅速進行冷凍真空干燥。實施例4——豬偽狂犬病疫苗成品檢驗1.性狀微黃白色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。2.無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，均無菌生長。3.支原體檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，均無支原體生長。4.外源病毒檢驗將疫苗與豬偽狂犬病病毒特異性抗血清中和后，接種Vero細胞、MDBK細胞、ST細胞單層，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，均無外源病毒污染。5.鑒別檢驗(1)血清中和試驗將疫苗稀釋至200TCID50/0.1ml，與等量1:10稀釋的豬偽狂犬病病毒特異性抗血清混合，經(jīng)37℃中和1小時后，接種已長成單層的ST細胞96孔微量細胞培養(yǎng)板，共接種12孔，每孔100μl。同時設(shè)不中和對照組(將疫苗稀釋至200TCID50/0.1ml，與等量培養(yǎng)液混合)和正常細胞對照組，各接種6孔，每孔100μl。每孔補加含2％新生牛血清的細胞培養(yǎng)液100μl。將細胞培養(yǎng)板置37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察96～120小時。中和組和細胞對照組未出現(xiàn)CPE，不中和對照組全部出現(xiàn)CPE。(2)病毒基因鑒定采用基因鑒定PCR檢測法，用擴增gB基因的引物(序列1、2)進行PCR檢測，均擴增出大小約為600bp的特異性條帶。用擴增gE基因的引物(序列3、4)進行PCR檢測，均擴增不出大小約為298bp的特異性條帶。擴增gB基因的引物：gB-P1:5’-GGATCCGCGCACGTGAACGACAT-3’23(序列1)；gB-P2:5’-AAGCTTGAGCGCGTGCAGCTGGTT-3’24(序列2)。擴增片段大小為600bp。擴增gE基因的引物：gE-P1:5’-GCCCACGCACGAGGACTACTACGA-3’24(序列3)；gE-P2:5’-TTAAGCGGGGCGGGACATCAACAG-3’24(序列4)。擴增片段大小為298bp。6.安全檢驗用3～4周齡健康易感仔豬5頭，每頭肌肉接種疫苗10頭份，觀察14日，仔豬全部健活。7.效力檢驗將疫苗稀釋至1頭份/ml后，免疫5頭3～4周齡健康易感仔豬，每頭肌肉接種毒種1頭份，同時設(shè)對照仔豬5頭。免疫后21日，連同對照豬用豬偽狂犬病病毒S12株強毒(106.5TCID50/ml)攻毒，每頭滴鼻2ml、肌肉注射2ml，攻毒后觀察10日。結(jié)果對照豬全部發(fā)病，免疫豬全部保護。8.真空度測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行測定，均為紫色輝光。9.剩余水分測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行測定，均低于4％。序列表<110>齊魯動物保健品有限公司<120>一種使用全懸浮技術(shù)生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗的方法<130><160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>DNA<213>擴增gB基因的引物gB-P1<400>1GGATCCGCGCACGTGAACGACAT23<210>2<211>24<212>DNA<213>擴增gB基因的引物gB-P2<400>2AAGCTTGAGCGCGTGCAGCTGGTT24<210>3<211>24<212>DNA<213>擴增gE基因的引物gE-P1<400>3GCCCACGCACGAGGACTACTACGA24<210>4<211>24<212>DNA<213>擴增gE基因的引物gE-P2<400>4TTAAGCGGGGCGGGACATCAACAG24。1當(dāng)前第1頁1 2 3