一種口蹄疫全病毒顆粒疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種口蹄疫全病毒顆 粒疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的偶蹄動(dòng)物烈性接觸性傳染病，主要危害牛、羊、豬、駱駝等，發(fā) 病率極高，傳播速度極快。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為A類人獸共患病首位。雖然該病的 死亡率不高（幼畜除外），但可造成動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，且撲殺動(dòng)物需花費(fèi)大量的人力、物 力和財(cái)力，還會(huì)影響國際貿(mào)易，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生物恐怖。
[0003] 口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬。目前已知有7個(gè)血清型，A、0、C、 SAT1、SAT2、SAT3、ASIA1，每個(gè)血清型又有很多亞型。我國流行3個(gè)血清型且致病力最強(qiáng)、 分布最廣泛，分別為A型、0型以及ASIAl型。
[0004] 疫苗接種是特異性預(yù)防FMD的有效手段，制備安全有效的疫苗是成功地預(yù)防、控 制乃至最終消滅FMD的先決條件。FMD滅活疫苗具有良好的免疫原性，在預(yù)防和控制FMD的 過程中發(fā)揮著重要作用，但在疫苗制備過程中和產(chǎn)品中的一些宿主細(xì)胞殘余蛋白、核酸、牛 血清白蛋白、化學(xué)試劑等如果不加以控制去除，免疫接種動(dòng)物則引起動(dòng)物嚴(yán)重副反應(yīng)甚至 死亡、特別是可能使動(dòng)物致癌或影響肉類動(dòng)物食品安全。
[0005] 口蹄疫疫苗生產(chǎn)環(huán)節(jié)、冷鏈運(yùn)輸、田間使用中，適合的溫度保存原液、半成品、成品 對疫苗抗原活性或效價(jià)非常重要，但疫苗抗原活性穩(wěn)定的溫度范圍非常狹窄，一般在每段 工藝單元完成之間、疫苗庫或抗原庫、冷鏈運(yùn)輸、使用時(shí)保存在2-8°C，但不能冷凍，避免溫 度升高或低于零下破環(huán)抗原結(jié)構(gòu)或活性。為保持疫苗穩(wěn)定性或工藝過程中貯備抗原的穩(wěn) 定，多對疫苗或抗原進(jìn)行凍干或冷凍，但由于滅活純化抗原需要加入佐劑如鋁鹽、油佐劑增 強(qiáng)其免疫作用，凍干或冷凍使抗原凝聚變性或分層，失去免疫原性和生物活性，因此有必要 對口蹄疫抗原的穩(wěn)定保護(hù)劑進(jìn)行研宄，篩選，以便應(yīng)對規(guī)模化生產(chǎn)大量抗原處理、貯存或抗 原庫穩(wěn)定需要，但不能影響后續(xù)乳化工藝配制疫苗和疫苗的最終田間使用，選擇醫(yī)學(xué)或獸 醫(yī)學(xué)允許使用安全疫苗抗原保護(hù)劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種含有新型穩(wěn)定冷凍保護(hù)劑的口蹄疫全病 毒顆粒疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0008] 本發(fā)明的一種口蹄疫全病毒顆粒疫苗組合物，其特征在于含有口蹄疫病毒的全病 毒顆粒以及穩(wěn)定冷凍保護(hù)劑，所述的穩(wěn)定冷凍保護(hù)劑由以下物質(zhì)組成：多元醇、緩沖溶液以 及非離子表面活性劑。
[0009] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，在一個(gè)有效劑量的疫苗組合物中含有口蹄疫病毒的全病毒 顆粒1-20微克/mL，多元醇10-50% (v/v)，非離子表面活性劑0. 003-0. 03mg/mL，IO-IOOmM 的緩沖溶液，疫苗pH介于7. 0和9. 0之間。
[0010] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多元醇為甘油、聚乙二醇以及聚氧丙烯甘油醚 (polyoxypropylene glycerol ether)中的至少一種。
[0011] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的聚乙二醇為聚乙二醇300或聚乙二醇400。
[0012] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的非離子表面活性劑為吐溫-20或土溫-80。
[0013] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的緩沖溶液是磷酸緩沖液、Tris緩沖液或HEPES緩沖液 的一種或幾種的混合物。
[0014] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了以上任一項(xiàng)所述的疫苗組合物在制備預(yù)防或治療口蹄 疫疾病藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明提供口蹄疫標(biāo)記疫苗穩(wěn)定冷凍保護(hù)劑配方和制備工藝方法涉及病毒學(xué)、免 疫學(xué)、疫苗學(xué)和過程工藝學(xué)，特別涉及口蹄疫病毒標(biāo)記疫苗配方以及制法，包括規(guī)?；谔?疫病毒的純化工藝、質(zhì)量控制方法和指標(biāo)。配方的制法包括生物反應(yīng)器全懸浮無血清培養(yǎng) BHK-21和口蹄疫病毒疫苗株生產(chǎn)種子批，經(jīng)過反復(fù)凍融、裂解或超聲、核酸酶解、深層過濾、 陰離子交換層析、滅活、PEG沉淀、酚氯仿抽取、蔗糖密度梯度離心純化、分子篩凝膠純化、除 菌過濾、稀釋乳化配制?？捎糜谏逃肂HK-21適應(yīng)或減毒株口蹄疫疫苗的純化，也包括在其 他敏感細(xì)胞系增殖的各型或亞型口蹄疫病毒疫苗，主要為BHK-21細(xì)胞系作為口蹄疫疫苗 生產(chǎn)基質(zhì)的各型或亞型的口蹄疫病毒標(biāo)記抗原制備和貯存、運(yùn)輸、使用。
[0016] 本發(fā)明所使用的穩(wěn)定冷凍保護(hù)劑的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 1、本發(fā)明提供的標(biāo)記冷凍保護(hù)性配方，使疫苗抗原穩(wěn)定，保護(hù)了標(biāo)記疫苗的效價(jià) 和效果；可在液體、冷凍的條件下較長時(shí)間保持標(biāo)記抗原的效價(jià)或活性，有利于生產(chǎn)過程、 冷鏈過程標(biāo)記疫苗抗原的貯存。
[0018] 2、配方中不含外源性的蛋白、多肽、寡肽，降低了動(dòng)物疫病的傳播風(fēng)險(xiǎn)。
[0019] 本發(fā)明提供了 口蹄疫標(biāo)記疫苗改良、貯存穩(wěn)定配方以及制法、使用。本發(fā)明的一種 口蹄疫全病毒顆粒疫苗組合物含純化滅活的完整的口蹄疫顆粒146S標(biāo)記抗原和穩(wěn)定冷凍 保護(hù)劑。穩(wěn)定冷凍保護(hù)劑可使口蹄疫標(biāo)記抗原在4-8 °C貯存24月。本發(fā)明的穩(wěn)定冷凍保護(hù) 劑由以下物質(zhì)組成：多元醇、緩沖溶液以及非離子表面活性劑，該冷凍保護(hù)劑有效維持口蹄 疫標(biāo)記抗原146S的完整性、活性，在具體實(shí)施中貯存在不同溫度下仍能夠保持70-99. 9% 的病毒完整性或感染性。40°C液體貯存6個(gè)月，口蹄疫標(biāo)記抗原仍能夠保持80%的感染性 或完整性。在本發(fā)明提供的多元醇為甘油、聚乙二醇以及聚氧丙烯甘油醚中的至少一種，在 疫苗有效劑量中含10-50% (v/v)，研宄表明甘油在疫苗原液中含30% (v/v)可維持口蹄 疫病毒99. 9%的感染性。根據(jù)發(fā)明，非離子表面活性劑為吐溫-20或土溫-80,在疫苗有效 劑量中的含〇. 003-0. 03mg/mL。疫苗配方pH介于7. 0和9. 0之間。緩沖液是磷酸緩沖液、 Tris緩沖液，HEPES緩沖液的一種或混合物，摩爾濃度介于10和IOOmM之間。
[0020] 本發(fā)明實(shí)例中提供長期穩(wěn)定貯存口蹄疫抗原的方法，包括口蹄疫病毒原液、半成 品、成品的方法以及用多元醇和緩沖液混合后，口蹄疫病毒液完整病毒顆粒保持的情況。
[0021] 本發(fā)明的主要目的之一是口蹄疫病毒原液和疫苗成品在4_8°C以外的條件下保持 其效價(jià)的穩(wěn)定性或免疫原性的穩(wěn)定性，在生產(chǎn)過程和使用過程超低溫保存（_60°C以下）病 毒制備液，克服貯存、運(yùn)輸和臨床使用或田間使用時(shí)疫苗效價(jià)下降或無效的問題。發(fā)明提 供了液體配方，保持口蹄疫病毒146S顆粒的完整性和含量穩(wěn)定，在4°C下至少保存6月， 60-100%的病毒完整、含量穩(wěn)定。
[0022] 本發(fā)明提供更重要的是凍干配方，可保持高度純化口蹄疫病毒長期穩(wěn)定，以便高 效穩(wěn)定的抗原庫的建立和維持。
[0023] 液體配方
[0024] 本發(fā)明提供的液體長期貯存穩(wěn)定的口蹄疫完整病毒顆粒配方需要多元醇，單獨(dú)使 用甘油時(shí)，甘油的濃度可達(dá)20-30% v/v，4°C貯存完整口蹄疫病毒長達(dá)6月，易于高壓消毒， 多用于藥用的注射制劑，安全，是各個(gè)國家和地區(qū)批準(zhǔn)使用的賦型劑之一。可保護(hù)多種病毒 的完整性。
[0025] 另外一種多元醇是聚乙二醇，由多種分子量的形式，只有PEG 400和PEG 300用于 注射制劑，濃度可達(dá)30% v/v，無毒和無輻射。此外，聚氧丙烯甘油醚也無毒、多用于口服和 注射藥用制劑，并有防腐抗菌的作用。
[0026] Tween-20或Tween-80,本發(fā)明篩選醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)允許使用的原輔材料，非動(dòng)物來 源的非離子表面活性劑Tween-20或Tween-80,和傳統(tǒng)有佐劑中的司本-80,性質(zhì)類似，可使 用在本發(fā)明的賦型劑或病毒保護(hù)劑中，但需要低濃度使用方可發(fā)揮保護(hù)病毒結(jié)構(gòu)、大小和 活性的作用，高濃度則起反作用，使疫苗效果降低或失效。選用吐溫-20,在疫苗有效劑量中 的含 0· 003-0. 03mg/mL。
[0027] 藥