病毒樣顆粒的純化的制作方法
【專利說(shuō)明】病毒樣顆粒的純化
[0001] 相關(guān)專利申請(qǐng)相互參考
[0002] 本申請(qǐng)要求獲得美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/663, 218和美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng) No. 61/794, 086 的優(yōu)先權(quán)，No. 61/663, 218 于 2012 年 6 月 22 日提出申請(qǐng)，No. 61/794, 086 于2013年3月15日提出申請(qǐng)，本文引用其每一個(gè)的全部?jī)?nèi)容作為參考。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，包括諾如病毒疫苗。本發(fā)明的各方面涉及制備和純化疫苗 組合物的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 病毒樣顆粒（VLP)的生產(chǎn)一般涉及VLP在宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)和組裝。為 了從最終的生產(chǎn)培養(yǎng)物中除去傳染劑（infectious agent),普遍使用病毒過(guò)濾，雖然也可 以使用其他方法，例如UV失活或化學(xué)失活（單獨(dú)使用或者與基于過(guò)濾的方法聯(lián)合使用）。 然而，對(duì)于更大的生物組分如VLP，病毒過(guò)濾無(wú)效，因?yàn)閂LP的大小經(jīng)常與傳染劑（例如，病 毒）太接近，以致不能夠僅通過(guò)過(guò)濾將之與這些傳染劑分離。
[0006] 在具體的實(shí)施例中，在Sf9昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行VLP的桿狀病毒表達(dá)之后，所得的大 量生產(chǎn)培養(yǎng)物含有高水平的處理污染物，包括宿主細(xì)胞蛋白、核酸和活的傳染劑，包括桿狀 病毒。盡管通過(guò)低速離心和過(guò)濾收獲VLP生產(chǎn)培養(yǎng)物可以產(chǎn)生澄清的適合于下游純化的 樣品，但是這些方法不適合除去宿主細(xì)胞蛋白和活病毒，包括桿狀病毒。因此，在制備VLP 時(shí)，在收獲期間需要使用其它的方法使傳染劑失活和/或清除處理污染物，以方便下游的 處理。 發(fā)明概要
[0007] 本文提供了可用于從VLP細(xì)胞裂解物和生產(chǎn)培養(yǎng)物中清除處理污染物的方法，以 及由此生產(chǎn)的VLP組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括產(chǎn)生或獲得含有所述VLP 的細(xì)胞裂解物、培養(yǎng)物上清液或?yàn)V出液，和將裂解物、上清液或?yàn)V出液的pH調(diào)節(jié)到小于大 約5的pH值，從而產(chǎn)生pH被調(diào)節(jié)的溶液。該方法進(jìn)一步包括從pH被調(diào)節(jié)的溶液中除去非 VLP微粒/聚集物，從而產(chǎn)生包含VLP的純化溶液。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的pH處理方法可用于分離結(jié)構(gòu)上多樣的（diverse) VLP群體，其中VLP至少包括VLP的第一亞群和第二亞群。分離非VLP微粒/聚集物可以包 括將VLP第二亞群與pH被調(diào)節(jié)的溶液分離，從而產(chǎn)生純化溶液，其中純化溶液基本上保留 VLP的第一亞群。該方法可以進(jìn)一步包括，在將VLP第二亞群與純化溶液分離之后，將VLP 第一亞群與純化溶液分離。在一些實(shí)施方案中，VLP是諾如病毒VLP，其中第一亞群包括具 有全長(zhǎng)VPl亞單位的諾如病毒VLP，并且其中第二亞群包括具有截短的VPl亞單位的諾如病 毒VLP。在這種處理之后，VLP第一亞群與殘余污染蛋白之間的比值被增加至少大約50%。 在一些實(shí)施方案中，在這種處理之后，VLP第一亞群與殘余污染蛋白之間的比值被增加至少 大約80%。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，分離包括一種或多種如下的處理：離心、沉淀、絮凝、沉降和過(guò) 濾。在一些實(shí)施方案中，除去VLP包括使用一種或多種色譜處理將VLP第一亞群與純化溶 液分離。
[0010] 在本發(fā)明的一些方面中，用于純化VLP的方法包括產(chǎn)生或獲得含有VLP的細(xì)胞裂 解物、培養(yǎng)物上清液或?yàn)V出液；和使用多步色譜處理純化VLP，從而產(chǎn)生純化溶液。多步色 譜處理的至少一個(gè)色譜處理包括使裂解物、上清液或?yàn)V出液與色譜材料接觸，其中VLP與 所述色譜材料結(jié)合；用溶劑和/或去污劑處理色譜材料；和在所述處理后，將VLP從色譜材 料洗脫。每一個(gè)色譜處理均獨(dú)立地從下組中選出：羥基磷灰石色譜、疏水相互作用色譜、尺 寸排阻色譜、離子交換色譜、混合模式色譜、基于膜的色譜和親和色譜。在一些實(shí)施方案中， 多步色譜處理的第一色譜處理是離子交換色譜，其中離子交換色譜從陰離子交換色譜和陽(yáng) 離子交換色譜中選出。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，多步色譜處理的第一色譜處理是陽(yáng)離子交換色譜，并且所述 處理步驟在陽(yáng)離子交換色譜處理的陽(yáng)離子交換柱上執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，多步色譜處 理的第一色譜處理是羥基磷灰石色譜，并且所述處理步驟在羥基磷灰石色譜處理的羥基磷 灰石柱上執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，多步色譜處理的第一色譜處理是親和色譜，并且所述處 理步驟在親和色譜處理的親和柱上執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，多步色譜處理的第一色譜處 理是混合模式色譜，并且所述處理步驟在混合模式色譜處理的混合模式柱上執(zhí)行。在一些 實(shí)施方案中，多步色譜處理的第一色譜處理是疏水相互作用色譜，并且所述處理步驟在疏 水相互作用色譜處理的疏水相互作用柱上執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括一 種或多種額外的色譜處理。
[0012] 溶劑和/或去污劑包括如下的一種或多種：磷酸三丁酯（TnBP)，非離子去污 劑（包括Triton X-100和聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯（polyoxyethylene sorbitan monooleate))，兩性離子去污劑（包括CHAPS和Zwittergent 3-12))和離子去污劑（包括 膽酸鈉和二甲基二（十八燒基）溴化銨（Dimethyldioctadecylammonium bromide))。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，VLP是如下的一種或多種：諾如病毒基因群I VLP、諾如病毒 基因群II VLP、諾如病毒基因群IV VLP、嵌合諾如病毒VLP，工程化的諾如病毒VLP變體、和 沙波病毒（sap〇Virus)VLP。在一些實(shí)施方案中，VLP是一種或多種沙波病毒VLP。在一些 實(shí)施方案中，VLP與殘余污染蛋白的比值被增加至少2倍。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，與裂解物、上清液或?yàn)V出液相比，VLP與殘余污染蛋白的比值 被增加至少10倍。在一些實(shí)施方案中，至少大約50 %的殘余污染蛋白被從裂解物、上清液 或?yàn)V出液中除去。在一些實(shí)施方案中，在所述純化期間，不超過(guò)大約50%的VLP被損失。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，裂解物、上清液或?yàn)V出液使用重組方法產(chǎn)生，并且VLP在細(xì)菌 細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。VLP還可以在植物細(xì)胞中產(chǎn)生。
[0016] 在本發(fā)明的一些方面中，純化VLP的方法包括產(chǎn)生或獲得含有VLP的細(xì)胞裂解物 或培養(yǎng)物上清液/濾出液，所述VLP至少包含VLP的第一亞群和第二亞群。該方法進(jìn)一步 包括將裂解物、上清液或?yàn)V出液的PH調(diào)節(jié)到低于大約5的pH，并使用過(guò)濾處理從pH被調(diào)節(jié) 的溶液中除去VLP的第二亞群，從而產(chǎn)生過(guò)濾溶液。過(guò)濾溶液基本上保留VLP的第一亞群。 該方法額外包括使用多步色譜處理將VLP的第一亞群與過(guò)濾溶液分離，其并入至少一個(gè)柱 上溶劑和/或去污劑處理步驟。在一些實(shí)施方案中，VLP第一群與殘余污染蛋白的比值被 增加至少大約2倍。在一些實(shí)施方案中，過(guò)濾處理包括深層過(guò)濾處理。
[0017] 在一些實(shí)施方案中,VLP是如下的一種或多種：諾如病毒基因群I VLP和諾如病毒 基因群II VLP。在其他實(shí)施方案中，VLP是如下的一種或多種：諾如病毒基因群IV VLP和 其他可在將來(lái)被確定感染人類的諾如病毒基因群。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，純化VLP的方法包括產(chǎn)生或獲得含有VLP的細(xì)胞裂解物、培 養(yǎng)物上清液或?yàn)V出液。該方法進(jìn)一步包括將裂解物、上清液或?yàn)V出液的PH調(diào)節(jié)到小于大 約5的pH，產(chǎn)生pH被調(diào)節(jié)的溶液。該方法額外包括從pH被調(diào)節(jié)的溶液中除去非VLP微粒 /聚集物，從而產(chǎn)生純化溶液，所述除去包括通過(guò)深層過(guò)濾處理使PH被調(diào)節(jié)的溶液澄清，從 而產(chǎn)生純化的深層過(guò)濾溶液。在一些實(shí)施方案中，所述深層過(guò)濾處理包括使pH被調(diào)節(jié)的 溶液與一種或多種深層過(guò)濾器（depth filter)接觸，從而產(chǎn)生純化溶液。在一些實(shí)施方案 中，至少一個(gè)深層過(guò)濾器是硅藻土深層過(guò)濾器。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)深層過(guò)濾器 是多個(gè)硅藻土深層過(guò)濾器，其每一個(gè)具有從下述范圍中獨(dú)立選出的過(guò)濾容量：大約50升/ m2-大約1000升/m2。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)深層過(guò)濾器是單深層過(guò)濾器（single depth filter)，其每一個(gè)具有從下述范圍中選出的過(guò)濾容量：大約150升/m2-大約400升 /m 2。在一些實(shí)施方案中，與裂解物、上清液或?yàn)V出液相比，至少大約95 %的殘余污染核酸被 從pH被調(diào)節(jié)的溶液中除去。在一些實(shí)施方案中，與裂解物、上清液或?yàn)V出液相比，至少大約 75%的VLP被從pH被調(diào)節(jié)的溶液中回收。
[0019] 在本發(fā)明的一些方面中，本發(fā)明的溶液包括諾如病毒VLP的純化群，其中通過(guò)尺 寸排阻色譜和ELISA測(cè)量，所述溶液含有不超過(guò)10 %的殘余污染蛋白。在一些實(shí)施方案中， 溶液從含有諾如病毒VLP的細(xì)胞裂解物、培養(yǎng)物上清液或?yàn)V出液中純化。在一些實(shí)施方案 中，與裂解物、上清液或?yàn)V出液相比，溶液含有不超過(guò)35 %殘余污染核酸。在一些實(shí)施方案 中，裂解物、上清液或?yàn)V出液中至少大約50%的諾如病毒VLP被回收。在一些實(shí)施方案中， 與裂解物、上清液或?yàn)V出液相比，諾如病毒VLP與殘余污染蛋白的比值被增加至少大約10 倍。
[0020] 在本發(fā)明的一些方面中，本發(fā)明的溶液包括VLP的純化群體，其中所述溶液含有 至少大約50%的具有全長(zhǎng)VPl亞單位的VLP。在一些實(shí)施方案中，溶液含有高達(dá)大約100% 的具有全長(zhǎng)VPl亞單位的VLP。在一些實(shí)施方案中，溶液基本上沒(méi)有具有截短的VPl亞單位 的VLP。在一些實(shí)施方案中，溶液從含有至少大約10%具有截短的VPl亞單位的VLP的起 始材料中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，起始材料是含有VLP的細(xì)胞裂解物、培養(yǎng)物上清液或?yàn)V 出液。
[0021] 在本發(fā)明的一些方面中，使含有活病毒和進(jìn)一步含有由活宿主細(xì)胞病毒產(chǎn)生的 VLP的溶液中的活病毒清除和/或失活的方法，包括將溶液的pH調(diào)節(jié)到小于大約5的pH 值，從而產(chǎn)生pH被調(diào)節(jié)的溶液。在一些實(shí)施方案中，pH被調(diào)節(jié)的溶液中活病毒的水平被減 少至少大約IO4倍。在一些實(shí)施方案中，pH被調(diào)節(jié)的溶液中活病毒的水平被減少至少大約 IO5倍?；畈《灸軌虬?，但不僅限于，宿主細(xì)胞病毒、生產(chǎn)病毒（例如桿狀病毒）、和其他 污染病毒，例如由于人為處理產(chǎn)生的。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括從pH被調(diào)節(jié)的溶液中除去非VLP微粒/聚集 物，從而產(chǎn)生純化溶液，并且使用至少一種色譜處理對(duì)純化溶液進(jìn)行純化。該至少一種色譜 處理包括使純化溶液與色譜材料接觸，其中VLP與所述色譜材料結(jié)合，和用溶劑和/或去污 劑處理色譜材料。該至少一個(gè)色譜處理進(jìn)一步包括在所述處理之后將VLP從色譜材料洗 脫，從而產(chǎn)生洗脫液。在一些實(shí)施方案中，與含有活病毒的溶液相比，洗脫液中活病毒的水 平被減少至少大約IO2倍。
[0023] 在本發(fā)明的一些方面中，使含有活病毒和進(jìn)一步含有由活病毒產(chǎn)生的VLP的溶液 中的活病毒清除和/或失活的方法，包括使用至少一種色譜處理對(duì)含有活病毒的溶液進(jìn)行 純化。該至少一種色譜處理包括使含有活病毒的溶液與色譜材料接觸，其中VLP與所述色 譜材料結(jié)合，和用溶劑和/或去污劑處理色譜材料。該至少一種色譜處理進(jìn)一步包括在所 述處理之后將VLP從色譜材料洗脫，從而產(chǎn)生洗脫液。在一些實(shí)施方案中，與含有活病毒的 溶液相比，洗脫液中活殘余污染病毒的水平被減少至少大約IO 5倍。在一些實(shí)施方案中，與 含有活病毒的溶液相比，洗脫液中活病毒的水平被減少至少大約IO7倍。
[0024] 本發(fā)明還包括通過(guò)本文公開的方法產(chǎn)生的VLP組合物，和包含VLP以及一種或多 種佐劑和/或賦形劑的疫苗組合物。本文產(chǎn)生的VLP組合物的優(yōu)點(diǎn)在于，它們具有更少的 處理污染物，并且在生產(chǎn)期間基本上沒(méi)有形成異常的VLP結(jié)構(gòu)。
[0025] 附圖簡(jiǎn)述
[0026] 圖IA圖解了低pH處理，是經(jīng)過(guò)染色的、以Norwalk VPl亞單位為主要條帶的 SDS-PAGE凝膠，其中泳道1是批量（bulk) Norwalk VLP生產(chǎn)培養(yǎng)物（總）；泳道2是VLP生 產(chǎn)培養(yǎng)物-微量離心上清液/濾出液；泳道3是VLP生產(chǎn)培養(yǎng)物-微量離心沉淀（pellet); 泳道4是經(jīng)過(guò)低pH處理之后的批量（bulk) VLP生產(chǎn)培養(yǎng)物（總）；和泳道5是經(jīng)過(guò)低pH處 理、低速離心和0. 2 μ m過(guò)濾之后的VLP生產(chǎn)培養(yǎng)物（最終收獲材料）；
[0027] 圖IB圖解了低pH處理，是經(jīng)過(guò)染色的、以Consensus VPl亞單位為主要條帶的 SDS-PAGE凝膠，其中泳道1是批量Consensus VLP生產(chǎn)培養(yǎng)物（總）；和泳道2是經(jīng)過(guò)低pH 處理、低速離心和0. 2 μ m過(guò)濾之后的VLP生產(chǎn)培養(yǎng)物（最終收獲材料）；
[0028] 圖2A圖解了溶劑/去污劑處理，是在陽(yáng)離子交換捕獲色譜期間結(jié)合和洗脫單元操 作的代表性色譜圖，其中Norwalk VLP條件培養(yǎng)基以lOOmL/min加載于180mL柱床體積的 Sartobind S囊室（capsule)上。色譜圖顯示：1)條件培養(yǎng)基加載；2)溶劑/去污劑清洗； 和 3) Norwalk VLP 洗脫；
[0029] 圖2B圖解了溶劑/去污劑處理，是在羥基磷灰石捕獲色譜期間結(jié)合和洗脫單元操 作的代表性色譜圖，其中Norwalk VLP條件培養(yǎng)基以80mL/min加載于250mL柱床體積的羥 基磷灰石柱上。色譜圖顯示：1)條件培養(yǎng)基加載；2)溶劑/去污劑清洗；和3) IOOmM磷酸 鹽清洗；和4) Norwalk VLP洗脫；
[0030] 圖3A圖解了 VLP完整性分析，是分析型尺寸排阻色譜圖，其中色譜圖證明7. 4分 鐘的峰與組裝的顆粒一致；
[0031] 圖3B圖解了 VLP完整性分析，是透射電子顯微鏡圖，其證明有T3二十面體 (icosohedral)VLP 的預(yù)期?30_40nm 顆粒；
[0032] 圖4A圖解了 VLP生產(chǎn)和通過(guò)離心收獲的流程圖；和
[0033] 圖4B圖解了 VLP生產(chǎn)和通過(guò)深層過(guò)濾收獲的流程圖。
[0034] 發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明書
[0035] 本發(fā)明涉及溶液和/或疫苗組合物的制備，特別地涉及純化VLP的方法。特別地， 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，VLP生產(chǎn)培養(yǎng)物的低pH處理步驟有利于處理污染物，例如活宿主細(xì)胞病毒 和殘余污染蛋白、以及VLP群體的一些變體的清除，同時(shí)保持免疫原性和VLP結(jié)構(gòu)的完整 性。例如，為了純化諾如病毒VLP，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，低pH處理步驟導(dǎo)致使活病毒和具有截短 VPl亞單位的諾如病毒VLP基本上被除去和/或失活。
[0036] 可以理解，本發(fā)明的方