專利名稱：一種尖吻蝮蛇毒纖溶酶及其純化方法
現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于使用蝮蛇毒來提取抗血栓藥物的報道較多，例如，中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1989.18(?？?中公開的“抗栓酶1、2、3號研制”一文；CN92102645.5(CN1065680.A)中公開的“提取尖吻蝮蛇蛇毒去纖酶技術(shù)”等，國外目前也有多種蛇制劑，例如Ancrod(英國)等。這些蛇毒類抗栓藥物，是從蛇毒中提取的蛋白酶組分，從其作用機理上看，都是一種凝血酶樣酶，存在著出血副作用，另一方面，由于分離純化手段問題，使其制品不是高純度的單一蛋白酶組分，而是多組分的混合物，從而造成了這類藥物進一步推廣使用的障礙。
本發(fā)明的目的在于改進分離純化方法，從尖吻蝮蛇毒中提取對血栓有直接溶解作用的高純度的纖溶酶。
本發(fā)明所述的纖溶酶，是從尖吻蝮蛇毒中提取并純化含Ca++金屬的蛋白酶溶液，其特征在于，其分子量為2.8-3.2萬，氨基酸組分分析表明，該酶中天冬氨酸，谷氯酸含量均為2～5％，氨基酸序列分析表明，該酶的N末端為天門冬氨酸(ASP)，其纖溶活力為1-3纖溶活力單位/毫克蛋白，該酶對纖維蛋白有直接水解作用，但對酪蛋白無水解作用，具有較高的特異性，能對纖維蛋白原的A(α)鏈起作用。動物藥效學(xué)實驗表明，該酶能有效地溶解動、靜脈血栓，能有效地防止血栓生成，降低血液粘度，改善微循環(huán)，同時該酶對凝血系統(tǒng)影響小，出血可能性小。與現(xiàn)有的其它蝮蛇蛇毒中提取的纖溶酶相比，該酶的分子量較低，纖溶作用明顯提高，出血活性小。
本發(fā)明所述尖吻蝮蛇毒纖溶酶的純化方法，包括(1)將粗蛇毒用緩沖液溶解，然后經(jīng)離心沉淀，陰離子交換柱層析分離，洗脫粗分得到纖溶組分；(2)將該纖溶組分濃縮后經(jīng)凝膠過濾層析得到精制的纖溶酶原液；(3)將該纖溶酶原液脫鹽處理得到純化的纖溶酶液，其特征在于a)在洗脫粗分中，所述緩沖液洗脫是同時進行緩沖液PH直線梯度洗脫和鹽直線梯度洗脫，其中，緩沖液PH直線梯度為PH7.5-8.5至PH6.0-7.0，鹽直線梯度為0-0.5M，洗脫速度為25-80ml/hr；b)全工序操作在4-10℃溫度范圍內(nèi)進行。
在上述分離純化過程中，首先取粗毒用適量緩沖液溶解，所述溶解及粗分洗脫用緩沖液是0.02M，PH7.5-8.5的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)或0.02M PH7.5-8.5的磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4)緩沖液，所述陰離子交換柱層析中，所用的陰離子交換劑為弱酸性陰離子交換劑。例如DEAE sephadex A50，DEAE sepharose Fast Flow等，在所述的凝膠過濾層析中，所用的凝膠是用于分離分子量在5000～30萬范圍之內(nèi)的物質(zhì)的凝膠，例如Sephacryl_S-100HR、S-200HR、S-300HR、Sephadex G75等，所用凝膠過濾層析用緩沖液為0.05-0.30M的氯化鈉(NaCl)溶液，所述脫鹽是指對蒸餾水脫鹽1-6小時，所述濃縮是指超濾濃縮，或者冷風(fēng)吹干(樣品置于透析袋中)，或者冷凍干燥。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述分離并純化尖吻蝮蛇毒纖溶酶的方法簡單，產(chǎn)品純度高，由于同時進行PH直線梯度和鹽梯度洗脫，縮短了工藝流程，尤其是十分明顯地縮短了純化周期，有利于提高工業(yè)化生產(chǎn)效率。
下面通過實施例對其純化過程進一步描述實施例1。
(1)將皖南產(chǎn)尖吻蝮蛇毒3g溶于20ml的0.02M PH8.0 Tris-HCl緩沖液中，在3000轉(zhuǎn)/分離心泵中離心15min，取上清液，沉淀用上述緩沖液5ml攪勻，再離心一次，取上清液，并與上次離心所得的上清液合并，置冰箱中4℃保存。
(2)將DEAE Sephadex A-50陰離子交換劑，經(jīng)堿-酸處理后，用蒸餾水洗滌至中性，再用0.02M PH8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌該膠至洗脫液PH值為8.0，再沸水浴2小時，以脫氣、溶脹，冷卻后裝柱。
(3)取步驟(2)中處理好的膠裝柱，柱體積為3×80cm3，平衡后，取步驟(1)中溶解蛇毒所得的上清液上樣，直線梯度洗脫，貯瓶緩沖液為Tris-HCl 0.02M，PH6.3，含0.5M NaCl，梯度瓶緩沖液為0.02M，Tris-HCl緩沖液，PH8.0，流速42ml/hr，UV280nm檢測洗脫液，上樣48小時后用自動部分收集器收集，每管7ml，每小時6管，共洗脫12個峰，其中第6峰即為粗分的纖溶組分，約120ml，含酶量300mg。
(4)將上述粗分的纖溶酶液，裝入透析袋中，冷風(fēng)吹干至體積約為15ml左右，冰箱中4℃保存。
(5)取Sephacryl S-200HR為凝膠層析介質(zhì)，裝凝膠層析柱，柱體積為2.5×70cm3，用0.5M的NaCl溶液以99ml/hr的流速清洗1小時后，用0.15M的NaCl溶液平衡，取上述濃縮好的粗分的纖溶酶液上樣，用0.15M NaCl溶液洗脫，流速為18ml/min，第2峰即為精制的纖溶酶原液，共70ml，酶量為170mg。
(6)取上述精制的纖溶酶原液裝入透析袋中，對蒸餾水透析3小時，即得純化的纖溶酶。酶量為170mg，經(jīng)檢測，該酶纖溶活力為1個活力單位/毫克蛋白(纖溶活力單位)，等電點為5.8，其分子量為3萬，經(jīng)檢查無出血毒副作用。
實施例2(1)取皖南尖吻蝮蛇毒4.5g用0.02M，PH7.8的磷酸鹽緩沖液溶解，其他操作同實施例(1)中步驟(1)，取上清液合并后，冰箱中4℃保存。
(2)同實施例(1)步驟(2)。
(3)取上述步驟處理好的膠裝柱，柱體積增大至1600ml(4.6×100cm3)其它條件不變，層析后可得酶量460mg。
(4)將上述粗分纖溶酶液，裝入透析袋中，冷風(fēng)吹干至體積約為20ml左右；(5)取Sephacryl S-300HR為凝膠層析介質(zhì)，裝凝膠層析柱，柱體積為3.1×70cm3，用0.5M的NaCl溶液以99ml/hr的流速清洗1小時后，用0.2M的NaCl平衡，取上述濃縮好的樣品上樣，洗脫液為0.20M NaCl溶液，流速24ml/min，第2峰即為精制的纖溶酶原液，經(jīng)脫鹽處理得純酶共100ml，酶量為280mg。
實施例3(1)取尖吻蝮蛇毒3g溶解，方法同實施例1步驟(1)。
(2)陰離子交換劑為DEAE sepharose Fast Flow，膠處理與裝柱同實施例1步驟(2)，柱體積為3×80cm3，用0.02M PH8.0的Tris-HCl緩沖液以1.5ml/min的流速沖洗平衡，上樣，直線梯度洗脫，洗脫液同實施例1步驟(3)，流速80ml/hr，收集可得酶量285mg。
(3)余下操作同實施例1，可得精制纖溶酶60ml，酶量160mg，經(jīng)檢查纖溶活力合格，無出血副作用。
權(quán)利要求
1.一種尖吻蝮蛇毒纖溶酶，是從尖吻蝮蛇蛇毒中提取并純化的含Ca++的金屬蛋白酶溶液，其特征在于其分子量2.8-3.2萬，氨基酸組分分析表明，該酶中天冬氨酸、谷氨酸的含量均為2～5％；由氨基酸序列分析表明，該酶的N末端為天門冬氨酸(ASP)，其纖溶活力為1-3纖溶活力單位/毫克蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的尖吻蝮蛇毒纖溶酶的純化方法，包括(1)將粗蛇毒用緩沖液溶解，然后經(jīng)離子沉淀、陰離子交換柱層析分離，洗脫粗分得到纖溶組分；(2)將該纖溶組分濃縮后經(jīng)凝膠過濾柱層析得到精制的纖溶酶原液；(3)將該纖溶酶原液脫鹽處理得到純化的纖溶酶液，其特征在于a)在洗脫粗分中，所述用緩沖液洗脫是同時進行緩沖液PH直線梯度和鹽直線梯度洗脫，其中緩沖液PH直線梯度為PH7.5-8.5至PH6.0-7.0；鹽直線梯度為0-0.5M，洗脫速度為25-80ml/hr。b)全工序操作在4-10℃溫度范圍內(nèi)進行。
3.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于所述溶解粗蛇毒及粗分洗脫緩沖液是0.02M，PH7.5-8.5的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，或0.02M PH7.5-8.5的磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4)溶液。
4.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于凝膠過濾層析所用膠是用于分離分子量在5000-30萬范圍的物質(zhì)的凝膠；所用緩沖液為0.05-0.30M的氯化鈉(NaCl)溶液。
5.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于在陰離子交換柱層析中，所用的陰離子交換劑為弱酸性陰離子交換劑。
6.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于所述對纖溶酶原液脫鹽處理是指其對蒸餾水脫鹽1-6小時。
7.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于所述對纖溶組分濃縮是指超濾濃縮，或冷風(fēng)吹干(樣品置透析袋中)，或冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及從尖吻蝮蛇毒中提取的抗血栓藥物纖溶酶及其純化方法，該纖溶酶的分子量2.8-3.2萬，含有Ca
文檔編號A61K38/48GK1120070SQ9510988
公開日1996年4月10日 申請日期1995年10月9日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月26日
發(fā)明者王淳, 黃婉治, 承新, 康蓮娣, 羅丹 申請人:合肥兆峰科大藥業(yè)有限公司