專利名稱：一株產(chǎn)堿性果膠酶工程菌及其構(gòu)建和用該菌生產(chǎn)堿性果膠酶的方法
一株產(chǎn)堿性果膠酶工程菌及其構(gòu)建和用該菌生產(chǎn)堿性果膠酶的方法 技術(shù)領(lǐng)域一株產(chǎn)堿性果膠酶工程菌及其構(gòu)建和用該菌生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，屬于 生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景果膠酶是指能分解果膠質(zhì)的一類酶，堿性果膠酶(E.C.4.2.2.2)是指在堿性 范圍內(nèi)具有較高活性的一類果膠酶。堿性果膠酶除了在植物病毒的純化、紙漿 漂白等方面得到應(yīng)用以外，已成為棉織物預(yù)處理過(guò)程中至關(guān)重要的生物酶制劑。 堿性果膠酶的使用將改變傳統(tǒng)的堿精練工藝，不僅減少環(huán)境污染，節(jié)約大量的 工藝用水，而且可提高棉紡織物的品質(zhì)。近十年來(lái)，國(guó)外研究人員一直試圖利用基因工程手段構(gòu)建果膠酯裂解酶高 產(chǎn)菌株，來(lái)源于五rvWw"禾B 5acz7/ws等堿性果膠酶基因已通過(guò)基 因工程得到了表達(dá)，這些表達(dá)主要以E. coli.為表達(dá)宿主，其表達(dá)方式幾乎都以 IPTG作為誘導(dǎo)劑。雖然IPTG廣泛地運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室研究，但由于其價(jià)格昂貴， 因此限制了其在工業(yè)上的使用。國(guó)外研究所構(gòu)建的堿性果膠酶基因絕大多數(shù)為胞內(nèi)表達(dá)，這對(duì)工業(yè)化的提 取該酶帶來(lái)了不便。因此，構(gòu)建出高產(chǎn)、有效分泌到胞外及誘導(dǎo)方式廉價(jià)的基 因工程菌是急待解決的研究課題。我國(guó)從上世紀(jì)90年代初開(kāi)始也對(duì)堿性果膠酶進(jìn)行了研究， 一般均停留在菌 種篩選及對(duì)酶特性研究階段，國(guó)內(nèi)幾乎沒(méi)有關(guān)于堿性果膠酯裂解酶基因工程研 究報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)堿性果膠酶工程菌及其構(gòu)建和用該菌生產(chǎn)堿性 果膠酶的方法，為生物法生產(chǎn)堿性果膠酶的工業(yè)化打下基礎(chǔ)。 本發(fā)明的技術(shù)方案一株產(chǎn)堿性果膠酶(E.C.4.2.2.2)工程菌，其分類命名為重組畢赤酵母i^/z/" pwton^;^/)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏 編號(hào)為CGMCCNo. 2143。產(chǎn)堿性果膠酶(E.C.4.2.2.2)工程菌CGMCCNo.2143的制備方法，是利用 PCR技術(shù)從芽孢桿菌CSacz7/w sp) WSHB04-02中擴(kuò)增出1.2 kb的編碼堿性果膠 酶基因pe/，將其連到表達(dá)載體pPIC9K中，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-pe/,重組質(zhì) 粒整合到畢赤酵母(/^/2/apmton》)染色體上得到重組畢赤酵母菌i^/2/apastoris (pel)，即為產(chǎn)堿性果膠酶(E.C.4.2.2.2)工程菌CGMCC No.2143。 構(gòu)建過(guò)程為(1)基因pe/的克隆根據(jù)戸/相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物Pl: 5'-GCTTACGTAGCTGATTTAGGCCACCAGACG-3'P2: 5'隱AACGCGGCCGCTTAATTTAATTTACCCGCACCCG-3'或P1,: 5'-GCTTACGTAGCTGATTTAGGCCATCAAACG畫(huà)3' P2,: 5'-AACGCGGCCGCTTAATTTAATTTACCAGCACCCG-3' 引物兩端都引入S""5 I和A/of I位點(diǎn)，以芽孢桿菌OBacW^ Sp) WSHB04-02 DNA為模板完成PCR反應(yīng)在200 jiL PCR反應(yīng)管中加入以下成分:Buffer 5 ^L， 2.5mmol/L DNTPs 4[xL，模板DNA lpL， Taq DNA Polymerase l|iL,補(bǔ)水至50|iL; 反應(yīng)條件95。C變性5min，經(jīng)95。C 50s、 42°C卯s、 72°C 5min35個(gè)循環(huán)，獲 得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，I和I 酶切，回收其中1.2kb的片段，連接載體pPIC9K，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-pe/;(2)基因菌構(gòu)建將重組質(zhì)粒pPIC9K-pe/線形化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母并整合至 染色體上，涂布含卡那霉素G418平板，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，得到重組畢赤酵母， 重組菌乃'c/n'a; as/on;s (pe/),即為產(chǎn)堿性果膠酶工程菌CGMCC No.2143。 利用工程菌CGMCC No.2143生產(chǎn)堿性果膠酶的工藝為 (1)出發(fā)菌株CGMCCNo.2143;(2) 種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成以g/1000mL計(jì)，蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄 糖10-20，氯化鈉5-15;種子培養(yǎng)250mL三角瓶，裝液量50mL，培養(yǎng)溫度28°C-30°C，搖床轉(zhuǎn)速 200r/min，培養(yǎng)24 h (穩(wěn)定期)；(3) 菌體培養(yǎng)菌體培養(yǎng)基組成以g/1000mL計(jì)，酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15，生物素 0.0002-0.0005，甘油7-10。菌體培養(yǎng)離心收集種子，生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)入100mL培養(yǎng)基(加入l mL100X生物素)中；培養(yǎng)溫度28r 3(rC，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)48h;(4) 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/1000mL計(jì)，酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15，生物素 0.0002-0.0005，甲醇10-50， (NH4)2S04 1-3， MgS04.7H20 0.1-0.4， FeS04.7H20 0.003-0.007， CaCl2 0.1-0.2，微量元素溶液0.5-20ml，用2 mol/L KOH調(diào)pH值 6.5-7.5， 121 。C滅菌15min;所述微量元素溶液以mg/1000mL計(jì)，MnSO4'4H2O100,ZnCl2 70,Na2Mo04 2H20 35， H3B03 60， CoCl2 6H20 200， CuS04 5H20 29, NiCl2 6H20 25, 37%鹽酸0.9ml;發(fā)酵培養(yǎng):500ml三角瓶，裝液量30-80ml，發(fā)酵溫度30°C ，搖床轉(zhuǎn)速150-250 r/min，發(fā)酵時(shí)間3 — 4天。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供一種新型基因工程菌CGMCCNo.2143，以 該菌產(chǎn)堿性果膠酶的方法，發(fā)酵液中堿性果膠酶的產(chǎn)量可達(dá)到300U/mL。本發(fā) 明方法的優(yōu)點(diǎn)在于該基因工程菌目標(biāo)蛋白胞外分泌且胞外蛋白種類少，簡(jiǎn)化了 微生物生產(chǎn)堿性果膠酶的提純工藝，降低了生產(chǎn)成本，縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高 了生產(chǎn)效率，為產(chǎn)堿性果膠酶微生物發(fā)酵法工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。 生物材料樣品保藏重組畢赤酵母尸/c/^/ 似ton's (; e/)菌株,已于2007年8月30日保藏于中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC,保藏編號(hào)為 CGMCC No,2143。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l重組產(chǎn)堿性果膠酶工程菌CGMCC No. 2143構(gòu)建(1) 基因pe/的克隆根據(jù)pe/相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物 Pl: 5'-GCTTACGTAGCTGATTTAGGCCACCAGACG-3'P2: 5'-AACGCGGCCGCTTAATTTAATTTACCCGCACCCG-3' 引物兩端都引入S""B I和A^1位點(diǎn)，以芽孢桿菌C^"7/wssp)WSHB04-02 DNA為模板完成PCR反應(yīng)在200PCR反應(yīng)管中加入以下成分:Buffer 5 |iL， 2.5mmol/L DNTPs 4jiL，模板DNA ljiL， Taq DNA Polymerase ljiL，補(bǔ)水至50(iL; 反應(yīng)條件95。C變性5min，經(jīng)95。C 50s、 42°C 90s、 72°C 5min35個(gè)循環(huán)，獲 得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后I和I 酶切，回收其中1.2kb的片段，連接載體pPIC9K，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K卞e(cuò)/;(2) 基因菌構(gòu)建將重組質(zhì)粒pPIC9K卞e(cuò)/線形化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母并整合至 染色體上，涂布含卡那霉素G418平板，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，得到重組畢赤酵母， 重組菌尸/cWa;7aston、 (pe/)，即為產(chǎn)堿性果膠酶工程菌CGMCCNo.2143。實(shí)施例2重組產(chǎn)堿性果膠酶工程菌CGMCC No.2143構(gòu)建 引物改用Pl， 5'-GCTTACGTAGCTGATTTAGGCCATCAAACG-3'P2， 5'-AACGCGGCCGCTTAATTTAATTTACCAGCACCCG-3'其余操作方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3利用工程菌CGMCCNo.2143生產(chǎn)堿性果膠酶的工藝為 (l)出發(fā)菌株CGMCCNo.2143;(2)種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基組成以g/1000mL計(jì)，蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄 糖10-20，氯化鈉5-15;種子培養(yǎng)250mL三角瓶，裝液量50mL，培養(yǎng)溫度28°C-30°C ，搖床轉(zhuǎn)速 200r/min，培養(yǎng)24 h (穩(wěn)定期)；(3) 菌體培養(yǎng)菌體培養(yǎng)基組成以g/1000mL計(jì)，酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15，生物素 0.0002-0.0005，甘油7-10。菌體培養(yǎng)離心收集種子，生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)入100 mL培養(yǎng)基(加入1 mL100X生物素)中；培養(yǎng)溫度28。C-30。C，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)48h;(4) 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/1000mL計(jì)，酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15，生物素 0.0002-0.0005，甲醇10-50， (NH4)2S04 1-3， MgS04'7H20 0.1-0.4， FeS04'7H20 0.003-0.007， CaCl2 0.1-0.2，微量元素溶液0.5-20mL，用2 mol/L KOH調(diào)pH值 6.5-7.5， 121 。C滅菌15min;所述微量元素溶液以mg/1000mL計(jì)，MnS04 4H20 100, ZnCl2 70， Na2Mo04 2H20 35, H3B03 60 ， CoCl2 6H20 200, CuS04 5H20 29, NiCl2 6H20 25, 37%鹽酸0.9mL;發(fā)酵培養(yǎng)500mL三角瓶，裝液量30-80mL，發(fā)酵溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速 150-250 r/min，發(fā)酵時(shí)間3-4天。
權(quán)利要求
1、一株產(chǎn)堿性果膠酶工程菌，其分類命名為重組畢赤酵母菌Pichia pastoris(pel)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.2143。
2、 如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)堿性果膠酶工程菌CGMCCNo.2143的制備方法， 其特征是利用PCR技術(shù)從芽孢桿菌08acz7/w sp)WSHB04-02中擴(kuò)增出1.2 kb的 編碼堿性果膠酶基因^/，將其連到表達(dá)載體pPIC9K中，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-pe/，重組質(zhì)粒整合到畢赤酵母(P/c/z/"/^to^)染色體上得到重組畢赤 酵母菌，重組畢赤酵母菌尸/c/n'a/7^ton's (pe/)即為產(chǎn)堿性果膠酶工程菌CGMCC No.2143;構(gòu)建過(guò)程為(1) 基因pe/的克隆根據(jù)pe/相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物 Pl: 5'-GCTTACGTAGCTGATTTAGGCCACCAGACG-3'P2: 5'-AACGCGGCCGCTTAATTTAATTTACCCGCACCCG-3' 或 Pl， 5'-GCTTACGTAGCTGATTTAGGCCATCAAACG畫(huà)3'P2， 5'-AACGCGGCCGCTTAATTTAATTTACCAGCACCCG-3' 引物兩端都引入I和M f I位點(diǎn)，以芽孢桿菌(5a"7/船sp) WSHB04-02 DNA為模板完成PCR反應(yīng)在200 PCR反應(yīng)管中加入以下成分Buffer 5 (iL， 2.5mmol/L DNTPs 4|iL，模板DNA l(iL， Taq DNA Polymerase 1jiL，補(bǔ)水至50pL; 反應(yīng)條件95。C變性5min，經(jīng)95。C 50s、 42°C 90s、 72°C 5min35個(gè)循環(huán)，獲 得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，5V7flS I和M fI 酶切，回收其中1.2kb的片段，連接載體pPIC9K，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K卞e(cuò)/;(2) 基因菌構(gòu)建將重組質(zhì)粒pPIC9K-pe/線形化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母并整合至 染色體上，涂布含卡那霉素G418平板，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，得到重組畢赤酵母， 重組畢赤酵母菌尸/c/n'a posto^ (/ e/),即為產(chǎn)堿性果膠酶工程菌CGMCC No.2143。
3、 用權(quán)利要求1所述產(chǎn)堿性果膠酶工程菌CGMCC No.2143發(fā)酵生產(chǎn)堿性 果膠酶的方法，其特征是(1) 出發(fā)菌株CGMCCNo.2143;(2) 種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成以g/1000mL計(jì)，蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄 糖10-20，氯化鈉5-15;種子培養(yǎng)250mL三角瓶，裝液量50mL，培養(yǎng)溫度28°C-30°C ，搖床轉(zhuǎn)速 200r/min，培養(yǎng)24h;(3) 菌體培養(yǎng) 菌體培養(yǎng)基組成以g/1000mL計(jì)，酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15，生物素 0.0002-0.0005，甘油7誦10;菌體培養(yǎng)離心收集種子，生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)入加有l(wèi)mL100X生物素 的lOOmL菌體培養(yǎng)基中；培養(yǎng)溫度28。C-3(TC，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)48 h; (4)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/1000mL計(jì)，酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15，生物素 0,0002-0.0005，甲醇10-50， (NH4)2S04 1-3， MgS04.7H20 0.1-0.4， FeS04.7H20 0.003-0.007， CaCl2 0.1-0.2，微量元素溶液0.5-20ml，用2 mol/L KOH調(diào)pH值 6.5-7.5， 121 。C滅菌15min;所述微量元素溶液以mg/1000mL計(jì)，MnS04 4H20 100, ZnCl2 70， Na2Mo04 '2H20 35, H3B03 60， CoCl2 '6H20 200， CuS04 '5H20 29， NiCl2 '6H20 25， 37。/。鹽酸0.9mL;發(fā)酵培養(yǎng)500mL三角瓶，裝液量30-80mL，發(fā)酵溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速 150-250 r/min，發(fā)酵時(shí)間3-4天。
全文摘要
一株產(chǎn)堿性果膠酶工程菌及其構(gòu)建和用該菌生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以非致病的芽孢桿菌(Bacillus sp)WSHB04-02基因組DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，獲得包含1.2kb的編碼堿性果膠酶基因片段的序列pel。同時(shí)從工業(yè)化生產(chǎn)的需要考慮，利用穿梭表達(dá)載體構(gòu)建重組酵母菌Pichiapastoris(pel)即為產(chǎn)堿性果膠酶(E.C.4.2.2.2)工程菌CGMCC No.2143。還提供了CGMCC No.2143為發(fā)酵菌株生產(chǎn)堿性果膠酶的方法。該基因工程菌目標(biāo)蛋白胞外分泌且胞外蛋白種類少，簡(jiǎn)化了微生物生產(chǎn)堿性果膠酶的提純工藝，降低了生產(chǎn)成本，縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，為產(chǎn)堿性果膠酶微生物發(fā)酵法工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101157900SQ20071013097
公開(kāi)日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2007年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月4日
發(fā)明者堵國(guó)成, 諸葛斌, 堅(jiān) 陳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)