專(zhuān)利名稱(chēng):堿性蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以作為一種酶添加到洗滌劑中的堿性蛋白酶，以及編碼這種酶的基因。
背景技術(shù)：
蛋白酶在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用具有很長(zhǎng)的歷史，并且業(yè)已廣泛擴(kuò)展到包括洗滌劑在內(nèi)的各種領(lǐng)域，如衣物洗滌劑，纖維改性劑，皮革處理劑，化妝組合物，洗浴添加劑，食品改性劑，和藥物。其中，用于洗滌劑的蛋白酶是工業(yè)化大量生產(chǎn)的。例如，已知的蛋白酶包括Alcalase(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Savinase(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Maxacal(商標(biāo)；Genencor的產(chǎn)品)，Blap(商標(biāo)；Henkel的產(chǎn)品)，和KAP(Kao的產(chǎn)品)。
將蛋白酶摻入洗滌劑中，是為了降解主要由附著在衣物上的蛋白組成的污漬。實(shí)際上，污漬不僅包括蛋白，而且還包括混在其中的多種成分，包括有機(jī)物和無(wú)機(jī)物，如由皮脂產(chǎn)生的脂類(lèi)和固體顆粒。因此，有必要開(kāi)發(fā)具有足夠高的去污能力的洗滌劑，以便除去這種復(fù)雜的污漬。
由于發(fā)現(xiàn)若干種堿性蛋白酶即使在存在高濃度脂肪酸的條件下，也能保持酪蛋白酶解活性，并且，在去除包括蛋白和皮脂的復(fù)雜污漬方面具有良好的去污能力，并且分子量為大約43000，本發(fā)明人業(yè)已就此提出了一項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。這種堿性蛋白酶在分子量、一級(jí)結(jié)構(gòu)、酶促特性方面有所不同，并且具有來(lái)自枯草蛋白酶的很強(qiáng)的抗氧化劑作用，這種蛋白酶是已知的源于芽孢桿菌屬的微生物的常規(guī)絲氨酸蛋白酶，因此認(rèn)為應(yīng)當(dāng)將其歸入新的枯草蛋白酶亞科(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
上述堿性蛋白酶即使在存在高濃度脂肪酸的條件下，也具有酪蛋白酶解活性，并且在去除不僅包括蛋白，而且還包括皮脂等的復(fù)雜污漬方面具有出色的去污能力。但其產(chǎn)量不夠工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。在考慮進(jìn)一步改善去污力，以及工業(yè)規(guī)模的產(chǎn)量時(shí)，就需要具有與上述堿性磷酸酶類(lèi)似的特性，并且具有更有效的蛋白酶解能力的堿性蛋白酶。
用于增強(qiáng)靶蛋白(酶)分泌的常規(guī)的已知方法的例子，包括通過(guò)宿主菌株(酶生產(chǎn)菌)改良，以及改良編碼所述酶的基因或控制編碼所述酶的基因表達(dá)的基因。不過(guò)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠增加枯草蛋白酶分泌數(shù)量的改良例子。
另一方面，為了改善蛋白酶解能力，常用的方法是改變蛋白酶基因，以便提高每毫克蛋白的蛋白酶解活性，即比活性。有關(guān)為了改善枯草蛋白酶比活性而進(jìn)行的蛋白質(zhì)工程改變，有詳細(xì)的報(bào)導(dǎo)(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2，非專(zhuān)利文獻(xiàn)3，非專(zhuān)利文獻(xiàn)4和非專(zhuān)利文獻(xiàn)5等)。迄今為止所報(bào)導(dǎo)過(guò)的改變，證實(shí)了某些合成肽的比活性的提高，但是，沒(méi)有改善針對(duì)天然底物的活性，這種活性被認(rèn)為對(duì)去污力有影響。
為了提高對(duì)天然底物的比活性，據(jù)報(bào)導(dǎo)，通過(guò)用亮氨酸取代枯草蛋白酶E的31號(hào)位置上的異亮氨酸，可以提高對(duì)酪蛋白的蛋白酶解活性(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。這種情況不能作為參考，因?yàn)樵谏鲜鰤A性蛋白酶中，相應(yīng)的氨基酸實(shí)際上是亮氨酸；并且，上述堿性蛋白酶在酶促特性方面，也與分子量大約為28000的枯草蛋白酶不同。
本發(fā)明的目的是提供一種具有更有效的蛋白酶解能力，在除去復(fù)雜的污漬方面具有出色的去污力，并且具有高的分泌能力的堿性蛋白酶。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1(國(guó)際公開(kāi)號(hào)99/18218)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1(Saeki等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，279，2000，313-319)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2(Wells等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1987，1219-1223)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3(Wells等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1987，5167-5171)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4(Taguchi等，Appl.Environ.Microbiol.64，1998，492-495)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5(Takagi等，Protein Eng.，11，1998，1205-1210，Bryan，Biochem.Biophys.Acta，1543，2000，203-222)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6(Takagi等，J.Biol.Chem.，36，1988，19592-19596)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人找到了一種新型酶，這種酶在培養(yǎng)期間能夠有效分泌，而又沒(méi)喪失上述堿性蛋白酶的特征。結(jié)果，本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在其氨基酸序列的特定位置上具有特定氨基酸殘基的某些堿性蛋白酶，能夠滿(mǎn)足上述要求。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種堿性蛋白酶，其中，在SEQ ID NO1所示氨基酸序列的(a)65號(hào)位置，(b)101號(hào)位置，(c)163號(hào)位置，(d)170號(hào)位置，(e)171號(hào)位置，(f)273號(hào)位置，(g)320號(hào)位置，(h)359號(hào)位置，或(i)387號(hào)位置或與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是從以下氨基酸殘基中選擇的位置(a)脯氨酸殘基，位置(b)天冬酰胺殘基，位置(c)組氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，賴(lài)氨酸，天冬酰胺，絲氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，蘇氨酸或纈氨酸殘基，位置(d)纈氨酸或亮氨酸殘基，位置(e)丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸或蘇氨酸殘基，位置(f)異亮氨酸，甘氨酸或蘇氨酸殘基，位置(g)苯丙氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸或甘氨酸殘基，位置(h)絲氨酸，亮氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，或谷氨酰胺殘基，和位置(i)丙氨酸，賴(lài)氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸或組氨酸殘基。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了含有上述基因的載體，以及含有這種載體的轉(zhuǎn)化體。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種含有所述堿性蛋白酶的洗滌劑組合物。



圖1表示與SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少80％同源性的堿性蛋白酶的氨基酸序列比對(duì)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的堿性蛋白酶在SEQ ID NO1的(a)65號(hào)位置，(b)101號(hào)位置，(c)163號(hào)位置，(d)170號(hào)位置，(e)171號(hào)位置，(f)273號(hào)位置，(g)320號(hào)位置，(h)359號(hào)位置，或(i)387號(hào)位置或與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是從以下氨基酸殘基中選擇的位置(a)脯氨酸殘基，位置(b)天冬酰胺殘基，位置(c)組氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，賴(lài)氨酸，天冬酰胺，絲氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，蘇氨酸或纈氨酸殘基，位置(d)纈氨酸或亮氨酸殘基，位置(e)丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸或蘇氨酸殘基，位置(f)異亮氨酸，甘氨酸或蘇氨酸殘基，位置(g)苯丙氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸或甘氨酸殘基，位置(h)絲氨酸，亮氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，或谷氨酰胺殘基，和位置(i)丙氨酸，賴(lài)氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸或組氨酸殘基。
換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明的堿性蛋白酶具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，其中，位于選自上述(a)-(i)的位置上的或位于相當(dāng)于另一種堿性蛋白酶的氨基酸序列的相應(yīng)位置上的氨基酸殘基，是一種特定的氨基酸殘基。所述堿性蛋白酶可以是野生型的，其變體或人工變體。
當(dāng)本發(fā)明的堿性蛋白酶是一種變體時(shí)，被稱(chēng)為“具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白酶”或“另一種堿性蛋白酶”的蛋白酶，表示誘變之前的堿性蛋白酶(可稱(chēng)之為“親代堿性蛋白酶”)。通過(guò)將突變導(dǎo)入這種親代堿性蛋白酶的理想位點(diǎn)，可以獲得本發(fā)明的堿性蛋白酶。
“另一種堿性蛋白酶”可以是野生型的或野生型的變體。這種蛋白酶優(yōu)選具有抗氧化劑作用，并且，在通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定的分子量為43000±2000。其例子包括其氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸序列至少有80％的同源性的堿性蛋白酶。特別優(yōu)選的是這樣的堿性蛋白酶，它的氨基酸序列與SEQ IDNO1的氨基酸序列具有至少80％，優(yōu)選至少87％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的同源性，在pH8或更高pH的堿性范圍內(nèi)工作，具有抗氧化劑作用，在50℃下，在pH10的條件下處理10分鐘之后，能保留至少80％的原始活性，能被二異丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制，并且通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的分子量為43000±2000。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“具有抗氧化劑作用”，表示當(dāng)在30℃下，在含有50mM過(guò)氧化氫和5mM氯化鈣的20mM Britton-Robinson緩沖液(pH10)中處理20分鐘之后，所述蛋白酶的殘余活性至少為原始活性的50％。
“具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的堿性蛋白酶”的例子包括KP43[源于芽孢桿菌菌株KSM-KP43(FERM BP-6532)，WO99/18218]，而“其氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有至少80％的同源性的堿性蛋白酶”的例子包括蛋白酶KP9860(Genbank保藏號(hào)AB046403)[源于芽孢桿菌菌株KSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218]，蛋白酶KP9865(Genbank保藏號(hào)AB084155)[源于芽孢桿菌菌株KSM-KP9865(FERM P-18566)，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?002-002653]，蛋白酶E-1(Genbank保藏號(hào)AB046402)[源于芽孢桿菌菌株No.D-6(FERM P-1592)，日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)49-71191]，蛋白酶Ya(Genbank保藏號(hào)AB046404)[源于芽孢桿菌菌株YFERM BP-1029]，日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)昭61-280268]，蛋白酶SD521[源于芽孢桿菌菌株SD-521(Genbank保藏號(hào)AB046405)(FERM P-11162)，日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)Hei3-191781]，蛋白酶A-1(Genbank保藏號(hào)AB046406)[源于NCIB122489，WO88/01293]，和蛋白酶A-2(源于NCIB12513，WO98/56927)；通過(guò)用亮氨酸取代SEQ ID NO1的氨基酸序列46號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)用丙氨酸取代57號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)用精氨酸取代103號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)用賴(lài)氨酸取代107號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)分別用賴(lài)氨酸和丙氨酸取代124號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)用丙氨酸取代136號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)用丙氨酸取代193號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)分別用天冬酰胺、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、組氨酸、絲氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酰胺、天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸取代195號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)用纈氨酸取代257號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)用丙氨酸取代342號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)分別用天冬氨酸和絲氨酸取代66和264號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體(日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?000-355166)；通過(guò)用精氨酸取代SEQ ID NO1的84號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)用脯氨酸取代104號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，通過(guò)分別用丙氨酸和絲氨酸取代256號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，和通過(guò)用天冬酰胺取代369號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體(日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?001-114048)；和通過(guò)分別用天冬酰胺、蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和谷氨酰胺取代SEQ ID NO1氨基酸序列的251號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體，以及通過(guò)分別用絲氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、纈氨酸和丙氨酸取代256號(hào)位置上的氨基酸殘基獲得的變體(日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?001-329472)；與上述任意一種氨基酸序列具有至少80％，優(yōu)選至少87％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的同源性的堿性蛋白酶。
氨基酸序列的同源性是通過(guò)Lipman-Pearson’s方法計(jì)算的(Science，227，1435，1985)。
SEQ ID NO1所示堿性蛋白酶的氨基酸殘基優(yōu)選為位置(a)上的蘇氨酸，位置(b)上的甘氨酸，位置(c)上的谷氨酸，位置(d)上的異亮氨酸，位置(e)上的絲氨酸，位置(f)上的纈氨酸，位置(g)上的酪氨酸，位置(h)上的蘇氨酸，和位置(i)上的絲氨酸。與SEQ ID NO1所示氨基酸序列具有至少80％的同源性的其他堿性蛋白酶優(yōu)選具有蘇氨酸作為相當(dāng)于位置(a)的位置上的氨基酸殘基，絲氨酸作為相當(dāng)于位置(b)的位置上的氨基酸殘基，谷氨酸作為相當(dāng)于位置(c)的位置上的氨基酸殘基，異亮氨酸作為相當(dāng)于位置(d)的位置上的氨基酸殘基，絲氨酸作為相當(dāng)于位置(e)的位置上的氨基酸殘基，纈氨酸作為相當(dāng)于位置(f)的位置上的氨基酸殘基，酪氨酸作為相當(dāng)于位置(g)的位置上的氨基酸殘基，蘇氨酸作為相當(dāng)于位置(h)的位置上的氨基酸殘基，和酪蘇氨酸作為相當(dāng)于位置(i)的位置上的氨基酸殘基。
當(dāng)本發(fā)明的堿性蛋白酶是一種變體時(shí)，所述親代堿性蛋白酶的優(yōu)選例子除了具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的堿性蛋白酶之外，還包括與SEQ ID NO1所示氨基酸序列具有至少80％，優(yōu)選至少87％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的同源性，并且具有上述酶促特性和/或在相當(dāng)于SEQ ID NO1的位置(a)-(i)的位置上具有上述氨基酸殘基的蛋白酶。
“與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基”可以通過(guò)使用諸如Lipman-Pearson’s方法的已知程序比較氨基酸序列，并且得出與存在于每一種堿性蛋白酶的氨基酸序列上的保守氨基酸殘基的最大同源性進(jìn)行鑒定。通過(guò)以不考慮氨基酸序列的插入或缺失的方式比較蛋白酶的氨基酸序列，可以確定相應(yīng)氨基酸殘基在每一種蛋白酶序列上的位置。據(jù)推測(cè)，所述相應(yīng)位置存在于相同的三維位置上，并且能對(duì)有關(guān)蛋白酶的特定功能產(chǎn)生類(lèi)似影響。
根據(jù)圖1，其中，通過(guò)上述方法對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，(a)SEQ ID NO1的65號(hào)位置上的氨基酸殘基是蘇氨酸殘基。通過(guò)采用上述方法，與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基可以被確定為諸如蛋白酶KP9860的65號(hào)位置上的蘇氨酸殘基。在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，65號(hào)位置上的氨基酸殘基優(yōu)選是脯氨酸殘基。
(b)盡管SEQ ID NO1的101號(hào)位置上的氨基酸殘基是甘氨酸殘基，通過(guò)上述方法可以確定諸如蛋白酶E-1的與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是100號(hào)位置上的絲氨酸殘基。在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，101號(hào)位置上的氨基酸殘基優(yōu)選是天冬酰胺殘基。
(c)盡管SEQ ID NO1的163號(hào)位置上的氨基酸殘基是谷氨酸殘基，通過(guò)上述方法可以確定諸如蛋白酶E-1的與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是162號(hào)位置上的谷氨酸殘基。在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，163號(hào)位置上的氨基酸殘基優(yōu)選是組氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，賴(lài)氨酸，天冬酰胺，絲氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，蘇氨酸或纈氨酸殘基，特別優(yōu)選的是蘇氨酸或纈氨酸殘基。
(d)盡管SEQ ID NO1的170號(hào)位置上的氨基酸殘基是異亮氨酸殘基，通過(guò)上述方法可以確定諸如蛋白酶E-1的與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是169號(hào)位置上的異亮氨酸殘基。在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，170號(hào)位置上的氨基酸殘基優(yōu)選是纈氨酸或亮氨酸殘基。
(e)盡管SEQ ID NO1的171號(hào)位置上的氨基酸殘基是絲氨酸殘基，通過(guò)上述方法可以確定諸如蛋白酶E-1的與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是170號(hào)位置上的絲氨酸殘基。在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，171號(hào)位置上的氨基酸殘基優(yōu)選是丙氨酸，谷氨酸、甘氨酸或蘇氨酸，特別優(yōu)選的是甘氨酸或蘇氨酸殘基。
(f)盡管SEQ ID NO1的273號(hào)位置上的氨基酸殘基是纈氨酸殘基，通過(guò)上述方法可以確定諸如蛋白酶A-2的與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是272號(hào)位置上的纈氨酸殘基。在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，273號(hào)位置上的氨基酸殘基優(yōu)選是異亮氨酸，甘氨酸或蘇氨酸殘基，特別優(yōu)選的是異亮氨酸殘基。
(g)盡管SEQ ID NO1的320號(hào)位置上的氨基酸殘基是酪氨酸殘基，通過(guò)上述方法可以確定諸如蛋白酶SD-521的與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是319號(hào)位置上的酪氨酸殘基。在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，320號(hào)位置上的氨基酸殘基優(yōu)選是苯丙氨酸，纈氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸或甘氨酸殘基，特別優(yōu)選的是苯丙氨酸殘基。
(h)盡管SEQ ID NO1的359號(hào)位置上的氨基酸殘基是蘇氨酸殘基，通過(guò)上述方法可以確定諸如蛋白酶Ya的與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是358號(hào)位置上的蘇氨酸殘基。在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，359號(hào)位置上的氨基酸殘基優(yōu)選是絲氨基，亮氨酸，纈氨酸，異亮氨酸或谷氨酸殘基，特別優(yōu)選的是絲氨酸殘基。
(i)盡管SEQ ID NO1的387號(hào)位置上的氨基酸殘基是絲氨酸殘基，通過(guò)上述方法可以確定諸如蛋白酶D-521的與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是386號(hào)位置上的酪氨酸殘基。在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，387號(hào)位置上的氨基酸殘基優(yōu)選是丙氨基，賴(lài)氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸或組氨酸殘基，特別優(yōu)選的是丙氨酸殘基。
與蛋白酶KP43的氨基酸序列(SEQ ID NO1)的位置(a)65，(b)101，(c)163，(d)170，(e)171，(f)273，(g)320，(h)359和(i)387相應(yīng)的位置以及這些位置上的氨基酸殘基的具體例子優(yōu)選用“其他堿性蛋白酶”中的堿性蛋白酶表示(表1)。
表1


在位置位置(a)65，(b)101，(c)163，(d)170，(e)171，(f)273，(g)320，(h)359或(i)387或與之相應(yīng)的位置上具有預(yù)定氨基酸殘基的本發(fā)明的堿性蛋白酶具有增強(qiáng)了的分泌能力，特別是當(dāng)它是轉(zhuǎn)化體時(shí)尤其如此(參見(jiàn)例2)，而在位置(c)163，(d)170或(e)171或與之相應(yīng)的位置上具有預(yù)定氨基酸殘基的堿性蛋白酶對(duì)酪蛋白具有特別強(qiáng)的比活性(參見(jiàn)例3)。
在本發(fā)明的堿性蛋白酶中，可以同時(shí)取代位置(a)-(i)中的兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸殘基，因?yàn)檫@種取代既不會(huì)導(dǎo)致酶促活性的改變，也不會(huì)導(dǎo)致酶促特性的改變。以下是在兩個(gè)或兩個(gè)以上位置上同時(shí)進(jìn)行取代的優(yōu)選的具體例子。氨基酸用三個(gè)字母表示，而“+”表示在緊隨一個(gè)位置上的取代之后是另一個(gè)取代，而“/”表示所標(biāo)出的任何氨基酸都可以使用。
從提高分泌能力的角度出發(fā)，優(yōu)選的雙重取代例子包括Thr65Pro+Gly101Asn，Thr65Pro+Val273(Ile/Gly/Thr)，Gly101Asn+Thr359(Ser/Leu/Val/Ile/Gln)，和Val273(Ile/Gly/Thr)+Tyr320(Phe/Val/Thr/Leu/Ile/Gly)，特別優(yōu)選的是Thr65Pro+Ser387Ala和Thr359Ser+Ser387Ala。從增強(qiáng)比活性的角度出發(fā)，優(yōu)選的例子包括Glu163(Phe/Leu/Gln/Val)+Ser171Ala，Glu163(Ala/Asp/Ile/Leu/Ser/Thr/Val)+Ser171Gly，和Glu163(Ala/His/Ile/Lys/Leu/Gln/Thr/Val)+Serl71Thr，特別優(yōu)選的是Glu163Thr+Serl71Thr，Glu163Thr+Ser171Gly和Glu163Val+Ser171Gly。
從提高分泌能力角度出發(fā)，優(yōu)選的三重取代的例子包括Thr65Pro+Gly101Asn+Val273(Ile/Gly/Thr)，Tyr320(Phe/Val/Thr/Ileu/Ile/Gly)+Val273(Ile/Gly/Thr)+Ser387(Ala/Lys/Gln/Glu/Arg/His)，和Thr65Pro+Tyr320(Phe/Val/Thr/Leu/Ile/Gly)+Thr359(Ser/Leu/Val/Ile/Gln)，優(yōu)選Thr65Pro+GlyAsn+Ser387Ala，Thr65Pro+Val673Ile+Tyr320Phe和Thr65Pro+Tyr320Phe+Ser387Ala，特別優(yōu)選的是Thr65Pro+Val273Ile+Thr359Ser，Thr65Pro+Val273Ile+Ser387Ala和Thr65Pro+Tyr320Gly+Ser387Ala。
從提高分泌能力角度出發(fā)，四重取代的例子包括Thr65Pro+Gly101Asn+Val273(Ile/Gly/Thr)+Tyr320(Phe/Val/Thr/Ieu/Ile/Gly)，Thr65Pro+Tyr320(Phe/Val/Thr/Ieu/Ile/Gly)+Thr359(Ser/Leu/Val/Ile/Gln)+Ser387(Ala/Lys/Gln/Glu/Arg/His)，和Gly101Asn+Val273(Ile/Gly/Thr)+Tyr320(Phe/Val/Thr/Ieu/Ile/Gly)+Ser387(Ala/Lys/Gln/Glu/Arg/His)，優(yōu)選Thr65Pro+Val273Ile+Thr359(Ser/Leu/Ile/Val/Thr)+Ser387(Glu/Ala)，Thr65Pro+Val273Ile+Tyr320(Val/Leu/Phe/Thr)+Ser387(Ala/His/Gln)；特別優(yōu)選的是Thr65Pro+Val273Ile+Thr359Ser+Ser387(Ala/Lys)，Thr65Pro+Val273Ile+Thr359Gln+Ser387Ala，Thr65Pro+Val273Ile+Tyr320Phe+Ser387(Gln/Lys)，和Thr65Pro+Val273Ile+Tyr320Ile+Sen387Gln。
還可以采用五重或六重取代。
例如，本發(fā)明的堿性蛋白酶可以通過(guò)以下方法獲得。具體地講，可以通過(guò)以下步驟獲得將突變導(dǎo)入編碼親代堿性蛋白酶的克隆的基因(SEQ ID NO2)，用所得到的突變基因轉(zhuǎn)化合適的宿主，培養(yǎng)所得到的重組宿主，以及隨后從培養(yǎng)液中收集目標(biāo)堿性蛋白酶。編碼親代堿性蛋白酶的基因的克隆可以用常用的重組DNA技術(shù)進(jìn)行，例如按照披露于WO99/18218或WO98/56927中的方法進(jìn)行。
為了誘變編碼親代堿性蛋白酶的基因，可以采用常用的隨機(jī)誘變或位點(diǎn)專(zhuān)一誘變中的任一種。更具體地講，可以用諸如“定點(diǎn)誘變系統(tǒng)Mutan-Super Express Km試劑盒”(Takara Bio的產(chǎn)品)的試劑盒進(jìn)行誘變?？梢酝ㄟ^(guò)重組PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法(PCR方法，Academic Press，New York，1990)，用另一種基因的與目標(biāo)序列相應(yīng)的序列取代一種基因的目標(biāo)序列。
為了用所得到的突變基因生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白酶，例如，可以使用將所述突變基因連接在能夠穩(wěn)定擴(kuò)增它的載體上的方法，從而導(dǎo)致宿主細(xì)菌的轉(zhuǎn)化，或者將所述突變基因?qū)肽軌蚍€(wěn)定維持該突變基因的宿主細(xì)菌的染色體DNA上。滿(mǎn)足上述條件的宿主細(xì)胞包括屬于芽孢桿菌屬、大腸桿菌、霉菌、酵母和放線(xiàn)菌屬的微生物。使用上述菌株，可以將業(yè)已導(dǎo)入了所述突變基因的宿主細(xì)胞接種到含有碳源、氮源和其他必需養(yǎng)分的可同化的培養(yǎng)基中，然后按常規(guī)方法培養(yǎng)。
可以按照常用的酶收獲和純化方法，從由此獲得的培養(yǎng)液中收獲所述堿性蛋白酶，并進(jìn)行純化。例如，可以通過(guò)離心分離或過(guò)濾除去培養(yǎng)液中的細(xì)菌，然后按常規(guī)方法純化所述酶獲得目標(biāo)酶。由此獲得的酶溶液可以直接使用，或者按已知方法進(jìn)一步純化、結(jié)晶、粉碎或顆?；?。
由此獲得的具有抗氧化劑能力的蛋白酶，不會(huì)因?yàn)楦邼舛鹊闹舅岫种破淅业鞍酌附饣钚?。通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定其分子量為43000±2000，在堿性范圍內(nèi)具有活性。當(dāng)它是轉(zhuǎn)化體形式時(shí)，具有增強(qiáng)了的分泌能力，和/或與親代堿性蛋白酶相比，增強(qiáng)了對(duì)酪蛋白的比活性。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“具有高的分泌能力”，表示在與類(lèi)似于親代堿性蛋白酶的條件下測(cè)定上清液中的蛋白酶活性和蛋白含量時(shí)(例如，在接種到一種培養(yǎng)基中之后，在37℃下?lián)u晃培養(yǎng)3天，該培養(yǎng)基包括8％(w/v)聚蛋白胨S，0.3％酵母提取物，10％麥芽糖，0.04％硫酸鎂7水合物，0.2％磷酸二氫鉀，1.5％無(wú)水碳酸鈉，和30ppm四環(huán)素)，所述堿性蛋白酶變體至少表現(xiàn)出預(yù)定的酶活性或蛋白含量。例如，這意味著可能發(fā)現(xiàn)酶活性或蛋白含量提高了至少5％，優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少20％。當(dāng)不能確定比活性的任何變體時(shí)，可以測(cè)定酶活性或蛋白含量中的任意一項(xiàng)，因?yàn)橛H代堿性蛋白酶和堿性蛋白酶變體被認(rèn)為在酶活性與蛋白含量的比例上是相似的。
與具有抗氧化劑作用的親代堿性蛋白酶相比，對(duì)酪蛋白底物具有增強(qiáng)了的比活性的堿性蛋白酶變體，不會(huì)因?yàn)楦邼舛鹊闹舅岫种破淅业鞍酌附饣钚裕ㄟ^(guò)SDS-PAGE測(cè)定該變體的分子量為43000±2000，并且在堿性范圍內(nèi)具有活性。特別優(yōu)選的是具有親代堿性蛋白酶的上述各種特性的蛋白酶變體。
因此，本發(fā)明的堿性蛋白酶可以作為一種酶摻入各種洗滌劑組合物中。盡管對(duì)添加到洗滌劑組合物中的本發(fā)明的堿性蛋白酶的用量沒(méi)有具體限制，只要它能發(fā)揮其活性就行，不過(guò)，通常是以每千克洗滌劑組合物0.1-5000Pu的用量添加的。出于經(jīng)濟(jì)方面的考慮，優(yōu)選500Pu或更低。
可以將各種酶與本發(fā)明的堿性蛋白酶組合應(yīng)用于本發(fā)明的洗滌劑組合物中。其例子包括水解酶，氧化酶，還原酶，轉(zhuǎn)移酶，裂合酶，異構(gòu)酶，連接酶和合成酶。其中，除了本發(fā)明堿性蛋白酶以外的蛋白酶，優(yōu)選是纖維素酶，角蛋白酶，酯酶，角化酶，淀粉酶，脂酶，支鏈淀粉酶，果膠酶，甘露糖酶，葡糖苷酶，葡聚糖酶，膽甾醇氧化酶，過(guò)氧化物酶，和漆酶，其中特別優(yōu)選的蛋白酶是纖維素酶，淀粉酶和脂酶。蛋白酶包括商業(yè)化銷(xiāo)售的Alcalase(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Esperase(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Savinase(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Everlase(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Kannase(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Properase(商標(biāo)；Genencor International的產(chǎn)品)，Purafect(商標(biāo)；Genencor International的產(chǎn)品)和KAP(Kao的產(chǎn)品)。纖維素酶包括Celluzyme(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Carezyme(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，KAC(Kao的產(chǎn)品)，披露于日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)Hei10-313859中的由芽孢桿菌菌株KSM-S237生產(chǎn)的堿性纖維素酶，和披露于日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?002-116553中的突變的堿性纖維素(都是Kao的產(chǎn)品)。淀粉酶包括Termamyl(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Duramyl(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，Purastar(商標(biāo)；Genencor International的產(chǎn)品)和KAM(Kao的產(chǎn)品)。脂酶包括Lipolase(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)，和Lipolase Ultra(商標(biāo)；Novozymes的產(chǎn)品)。
當(dāng)除了本發(fā)明的堿性蛋白酶以外的蛋白酶也被摻入洗滌劑組合物中時(shí)，其用量?jī)?yōu)選為每千克0.1-500PU。當(dāng)組合使用所述纖維素酶時(shí)，其添加量?jī)?yōu)選為每千克洗滌劑組合物300-3000000KU，這一用量是根據(jù)通過(guò)披露于
日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)Hei10-313859中的酶促活性測(cè)定方法測(cè)定的單位(KU)確定的。當(dāng)組合使用淀粉酶時(shí)，其用量?jī)?yōu)選為每千克0.1-500PU。當(dāng)組合使用所述纖維素酶時(shí)，其添加量?jī)?yōu)選為每千克洗滌劑組合物50-500000IU，這一用量是根據(jù)通過(guò)披露于
日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)Hei11-43690中的淀粉酶活性測(cè)定方法測(cè)定的單位(IU)確定的。當(dāng)組合使用脂酶時(shí)，其添加量?jī)?yōu)選為每千克洗滌劑組合物10000-100000LU，這一用量是根據(jù)通過(guò)披露于日文公開(kāi)(PCT)號(hào)Hei8-500013的例1中的脂酶活性測(cè)定方法測(cè)定的單位(LU)確定的。
可以將已知的洗滌成分摻入本發(fā)明的洗滌劑組合物中。所述已知洗滌成分如下。
(1)表面活性劑將用量為0.5-60wt.％的表面活性劑摻入洗滌劑組合物中。優(yōu)選分別向粉狀洗滌劑組合物和液體洗滌劑組合物中添加10-45wt.％和20-50wt.％的表面活性劑。當(dāng)本發(fā)明的洗滌劑組合物是漂白洗滌劑或自動(dòng)洗碗洗滌劑時(shí)，洗滌劑的添加量通常為1-10wt.％，優(yōu)選1-5wt.％。
作為用于本發(fā)明洗滌劑組合物的表面活性劑，可以單獨(dú)或組合使用陰離子型表面活性劑，非離子型表面活性劑，兩性離子表面活性劑和陽(yáng)離子型表面活性劑。其中，優(yōu)選陰離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑。
非離子型表面活性劑的例子包括C10-18醇的硫酸鹽，烷氧基化C8-20醇的硫酸鹽，烷基苯磺酸鹽，石蠟磺酸鹽，α-烯屬磺酸鹽，α-磺基脂肪酸鹽，α-磺基脂肪酸的烷基酯鹽和脂肪酸鹽。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的是具有C10-14，更優(yōu)選C18-15烷基直鏈的直鏈烷基苯磺酸鹽。作為平衡離子，優(yōu)選堿金屬鹽和銨，其中特別優(yōu)選的是鈉和/或鉀，單乙醇胺和二乙醇胺。
非離子型表面活性劑的優(yōu)選例子包括聚氧化亞烴烷基(C8-20)醚，烷基聚糖苷，聚氧化亞烴烷基(C8-20)苯基醚，聚氧化亞烴山梨聚糖脂肪酸(C8-22)酯，和聚氧化亞烴二醇脂肪酸(C8-22)酯，和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物。其中，特別優(yōu)選的非離子型表面活性劑是通過(guò)將4-20摩爾的諸如氧化乙烯或氧化丙烯的氧化亞烴添加到C10-18醇中獲得的聚氧化亞烴烷基醚[HLB數(shù)量(通過(guò)Griffin方法計(jì)算)為10.5-15.0，優(yōu)選11.0-14.5]。
(2)二價(jià)金屬離子清除劑以0.01-50wt％，優(yōu)選5-40wt％的用量將二價(jià)金屬離子清除劑添加到洗滌劑組合物中?？梢該饺氡景l(fā)明洗滌劑組合物中的二價(jià)金屬離子清除劑的例子包括諸如三聚磷酸鹽，焦磷酸鹽和正磷酸鹽的縮聚磷酸鹽，諸如沸石的硅鋁酸鹽，合成的層狀結(jié)晶硅酸鹽，次氮基三乙酸鹽，乙二胺四乙酸，檸檬酸鹽，異檸檬酸鹽和聚縮醛羧酸鹽。其中，特別優(yōu)選的是結(jié)晶硅鋁酸鹽(合成的沸石)。在A型、X型和P型的沸石中，A型沸石是特別優(yōu)選的。平均一級(jí)粒度為0.1-10微米，特別是0.1-5微米的合成沸石是適合使用的。
(3)堿性試劑以0.01-80wt％，優(yōu)選1-40wt％的用量將堿性試劑添加到洗滌劑組合物中。添加到粉狀洗滌劑中的堿性試劑包括堿金屬碳酸鹽，如碳酸鈉，通常被稱(chēng)為稠蘇打或輕蘇打，以及JIS No.1，2或3的非晶堿金屬硅酸鹽。所述無(wú)機(jī)堿性試劑在干燥洗滌劑時(shí)能有效形成每個(gè)顆粒的核心，因此，能夠制備具有良好流動(dòng)性的比較堅(jiān)硬的洗滌劑。除了上述試劑之外，碳酸氫三鈉和碳酸氫鈉也可用作堿性試劑。諸如三聚磷酸鹽的磷酸鹽也具有堿性試劑的作用。除了上述堿性試劑之外，可以添加到液體洗滌劑中的堿性試劑的例子還包括氫氧化鈉和1-，2-，和3-乙醇胺?？蓪⑵溆米鞅砻婊钚詣┑钠胶怆x子。
(4)抗再沉積劑以0.001-10wt％，優(yōu)選1-5wt％的用量將抗再沉積劑添加到洗滌劑組合物中。添加到本發(fā)明洗滌劑組合物中的抗再沉積劑的例子包括聚乙二醇，羧酸聚合物，聚乙烯醇，和聚乙烯吡咯烷酮。其中，羧酸聚合物具有金屬離子清除功能，和將來(lái)自衣物的固體顆粒狀污物分散到洗滌液中的能力，還具有抗再沉積作用。羧酸聚合物包括丙烯酸，異丁烯酸或亞甲基丁二酸等的均聚物或共聚物。作為共聚物，優(yōu)選通過(guò)共聚上述單體和馬來(lái)酸獲得的共聚物。共聚物的分子量?jī)?yōu)選為數(shù)千-100000。同樣，作為上述羧酸聚合物，優(yōu)選諸如聚縮水甘油的聚合物，諸如羧甲基纖維素的纖維素衍生物，或諸如聚天冬氨酸的氨基羧酸聚合物，因?yàn)樗鼈兺瑯泳邆浣饘匐x子清除劑和分散劑的能力，并且具有抗再沉積作用。
(5)漂白劑優(yōu)選以1-10wt％的用量將諸如過(guò)氧化氫或過(guò)碳酸鹽的漂白劑添加到洗滌劑組合物中。在使用漂白劑時(shí)，可以根據(jù)洗滌劑組合物的量添加0.01-10wt％的漂白激活劑，如四乙基乙二胺(TAED)或披露于日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)Hei6-316700中的漂白激活劑。
(6)熒光增白劑作為熒光增白劑，可以將聯(lián)苯類(lèi)(如Tinopal CBS-X)和二苯乙烯類(lèi)(如DM熒光染料)增白劑添加到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。優(yōu)選以占洗滌劑組合物0.001-2％的用量添加。
(7)其他成分在本發(fā)明的洗滌劑組合物中，可以添加衣物洗滌劑領(lǐng)域公知的助洗劑、軟化劑、還原劑(如亞硫酸氫鹽)、消泡劑(如硅氧烷)、芳香劑和其他添加劑。
可以通過(guò)組合使用通過(guò)上述方法獲得的本發(fā)明的堿性蛋白酶和上述已知洗滌劑成分，用常規(guī)方法制備本發(fā)明的洗滌劑組合物。洗滌劑形式可以根據(jù)使用目的進(jìn)行選擇。例如，包括液體、粉末、顆粒、糊劑和固體。
由此獲得的本發(fā)明的洗滌劑組合物可以用作衣物洗滌劑，漂白劑，硬表面清潔劑，管道清洗劑，人工牙齒清潔劑，用于醫(yī)療器械的消毒清潔劑等。
實(shí)施例[蛋白酶活性測(cè)定方法——酪蛋白方法]在30℃下，將1.0毫升含有1％(w/v)酪蛋白的50mM硼酸緩沖液(pH10.5)保持5分鐘，然后添加0.1毫升的酶溶液，并且讓所得到的混合物反應(yīng)15分鐘。將2.0毫升反應(yīng)終止溶液(0.11M三氯乙酸-0.22M乙酸鈉-0.33M乙酸)添加到該反應(yīng)混合物中。將該混合物在室溫下放置30分鐘，然后過(guò)濾。通過(guò)Lowry等的改進(jìn)方法測(cè)定濾液中的酸溶性蛋白。具體地講，將2.5毫升堿性銅溶液[1％酒石酸鈉.鉀∶1％5水合硫酸銅∶2％碳酸鈉∶0.1N氫氧化鈉＝1∶1∶100]添加到0.5毫升的濾液中，然后將所得到的混合物在室溫下放置10分鐘。然后添加0.25毫升的苯酚溶液[用蒸餾水稀釋2倍的苯酚試劑(Kanto Kagaku的產(chǎn)品)]。將所得到的混合物在30℃下保持30分鐘，然后測(cè)定660納米波長(zhǎng)下的吸收值。一個(gè)蛋白酶單位(1PU)被定義為在上述反應(yīng)條件下，在1分鐘內(nèi)釋放出相當(dāng)于1mM酪氨酸的酸溶性蛋白酶解產(chǎn)物所需要的酶的量。
例1將隨機(jī)誘變導(dǎo)入堿性蛋白酶結(jié)構(gòu)基因中，該基因源于芽孢桿菌菌株KSM-KP43，它具有大約2.0kb，包括一個(gè)終止密碼子。為了導(dǎo)入隨機(jī)誘變，將沒(méi)有錯(cuò)誤整合回收能力的Taq聚合酶Takara Taq(TakaraBao的產(chǎn)品)用作DNA聚合酶，以便在PCR中使用一個(gè)堿基的錯(cuò)誤整合。首先，使用能夠擴(kuò)增該2.0kb DNA的引物1(SEQ ID NO3)和引物2(SEQ ID NO4)進(jìn)行PCR。引物1通過(guò)BamHI接頭連接在正義鏈的5’末端，而引物2通過(guò)XbaI接頭連接在反義鏈的5’末端。作為使用的反應(yīng)系統(tǒng)，在100微升混合物中含有10納克模板DNA，10皮摩爾每一種引物，20納摩爾dNTP，10微升Takara Taq-加成反應(yīng)緩沖液和2.5U Taq聚合酶。在94℃下，在PCR條件下對(duì)模板DNA進(jìn)行變性2分鐘，然后進(jìn)行30輪PCR，每一輪包括以下處理94℃1分鐘，55℃1分鐘，和72℃2分鐘。通過(guò)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Roche的產(chǎn)品)純化PCR產(chǎn)物，然后用100微升無(wú)菌水洗脫。用1微升的洗脫物作為DNA模板，進(jìn)行第2輪PCR。純化由此獲得的PCR產(chǎn)物，并用于下文披露的檢測(cè)。
用BamHI和XbaI(Roche)裂解大約2.0kb的擴(kuò)增DNA片段的限制酶接頭。作為用于整合擴(kuò)增DNA的表達(dá)載體，pHA64(日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朒ei8-323050；在啟動(dòng)子64下游具有BamHI和XbaI位點(diǎn))能夠在屬于芽孢桿菌的細(xì)菌中復(fù)制。混合用BamHI和XbaI處理過(guò)的擴(kuò)增DNA片段和用BamHI和XbaI作過(guò)類(lèi)似處理的pHA64，然后用“LigationHigh”(Toyobo產(chǎn)品)進(jìn)行連接酶反應(yīng)。通過(guò)乙醇沉淀從連接酶反應(yīng)混合物中收集DNA，并將它用作隨后轉(zhuǎn)化的DNA。
將芽孢桿菌菌株KSM-KP43(下面將簡(jiǎn)稱(chēng)為“菌株KP-43”)用作轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法采用電穿孔方法，并且用“SSH-10”(Shimadzu的產(chǎn)品)和基因脈沖池(BioRad的產(chǎn)品)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
在含有脫脂乳的堿性瓊脂培養(yǎng)基[含有1％脫脂乳(Difco的產(chǎn)品)，1％細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Difco的產(chǎn)品)，0.5％酵母提取物(Difco的產(chǎn)品)，0.5％氯化鈉，1.5％瓊脂，0.05％無(wú)水碳酸鈉和15ppm四環(huán)素]上培養(yǎng)KP43菌株的轉(zhuǎn)化體，并且觀察光暈的形成，以便判斷是否導(dǎo)入了所述蛋白酶基因。
選擇具有在pHA64上插入了蛋白酶基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化過(guò)的菌株KP43，并用于隨后的培養(yǎng)。
例2在分離單菌落并且證實(shí)光暈形成之后，將在例1中獲得的轉(zhuǎn)化體分別接種到5毫升種子培養(yǎng)基A[6.0％(w/v)聚蛋白胨S(NipponPharmaceutical的產(chǎn)品)，0.1％酵母提取物，1.5％麥芽糖，0.02％硫酸鎂7水合物，0.1％磷酸二氫鉀，0.3％無(wú)水碳酸鈉和30ppm四環(huán)素]中，并且在30℃下以320rpm的旋轉(zhuǎn)速度預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜。將由此獲得的種子培養(yǎng)基(1％(v/v))接種到500毫升Sakaguchi燒瓶中的20毫升主培養(yǎng)基[8％(w/v)聚蛋白胨S，0.3％酵母提取物，10％麥芽糖，0.04％硫酸鎂7水合物，0.2％磷酸二氫鉀，1.5％無(wú)水碳酸鈉和30ppm四環(huán)素]中，并且在30℃下以121rpm的旋轉(zhuǎn)速度培養(yǎng)3天。將由此獲得的培養(yǎng)基進(jìn)行離心，并測(cè)定培養(yǎng)上清液中的蛋白酶活性。采用所述酪蛋白方法測(cè)定蛋白酶活性，同時(shí)用蛋白測(cè)定試劑盒(Wako Pure Chemicals的產(chǎn)品)測(cè)定蛋白含量。篩選突變的蛋白酶基因，該基因在蛋白酶活性方面的增強(qiáng)，被認(rèn)為是與通過(guò)在類(lèi)似條件下培養(yǎng)具有野生型酶基因的轉(zhuǎn)化體獲得的培養(yǎng)上清液的蛋白酶活性進(jìn)行比較的結(jié)果。培養(yǎng)上清液中蛋白含量表現(xiàn)出大體上與蛋白酶活性成比例地提高，這表明增強(qiáng)蛋白含量分泌所需要的突變業(yè)已被導(dǎo)入由此獲得的變體中。
用“高純度質(zhì)粒分離試劑盒”(Roche產(chǎn)品)從篩選的轉(zhuǎn)化體中收集所述質(zhì)粒，并且測(cè)定其核苷酸序列。用300納克質(zhì)粒DNA作模板，使用一種引物和“Big Dye DNA測(cè)序試劑盒”(Applied Biosystems產(chǎn)品)在20微升反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行PCR。用“DNA測(cè)序儀377型”(AppliedBiosystems產(chǎn)品)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有增強(qiáng)了的蛋白酶活性的變體在65號(hào)位置上的蘇氨酸，在101號(hào)位置上的甘氨酸，在273號(hào)位置上的纈氨酸，在320號(hào)位置上的酪氨酸，在359號(hào)位置上的蘇氨酸，和在387號(hào)位置上的絲氨酸分別被脯氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸、苯丙氨酸，絲氨酸和丙氨酸所取代。發(fā)現(xiàn)通過(guò)這種取代可以將蛋白酶活性提高大約5％(表2)。
研究了由于組合使用上述突變位點(diǎn)所導(dǎo)致的蛋白酶活性的增強(qiáng)。使用下文所披露的引物和“定點(diǎn)誘變系統(tǒng)Mutan-Super Express Km試劑盒”作為位點(diǎn)專(zhuān)一性誘變手段，研究了突變位點(diǎn)的組合。
引物365號(hào)位置上的蘇氨酸(T)被脯氨酸(P)取代(SEQ ID NO5)引物4101號(hào)位置上的甘氨酸(G)被天冬酰胺(N)取代(SEQ IDNO6)引物5273號(hào)位置上的纈氨酸(V)被異亮氨酸(I)取代(SEQ IDNO7)引物6320號(hào)位置上的酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)取代(SEQ IDNO8)引物7359號(hào)位置上的蘇氨酸(T)被絲氨酸(S)取代(SEQ IDNO9)引物8387號(hào)位置上的絲氨酸(S)被丙氨酸(A)取代(SEQ IDNO10)通過(guò)將上述篩選獲得的突變蛋白酶基因?qū)刖哂杏糜诳敲顾睾Y選的琥珀突變標(biāo)記的pKF18k的多克隆位點(diǎn)中的BamHI和XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建用于導(dǎo)入突變的模板質(zhì)粒。
為了進(jìn)行導(dǎo)入位點(diǎn)專(zhuān)一性突變的PCR，采用“Takara LA Taq”(Takara的產(chǎn)品)。用于導(dǎo)入突變的PCR是使用5’末端磷酸化篩選引物(“Mutan-Super Express Km”的試劑盒成分)和向其中導(dǎo)入了突變的引物3-8各5皮摩爾，并使用10納克模板質(zhì)粒。在94℃下，在反應(yīng)條件下，將模板DNA變性2分鐘，然后進(jìn)行30輪PCR，每一輪包括以下處理94℃1分鐘，55℃1分鐘，和72℃4分鐘。用所獲得的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株MV1184，以便獲得突變質(zhì)粒。按照上述核苷酸序列測(cè)定方法，證實(shí)所得到的突變質(zhì)粒的突變位點(diǎn)。
將通過(guò)位點(diǎn)專(zhuān)一性誘變導(dǎo)入了突變的蛋白酶基因?qū)雙HA64，用于轉(zhuǎn)化菌株KP-43，然后在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。與研究過(guò)的野生型酶相比，所述突變位點(diǎn)的組合能夠加強(qiáng)蛋白酶活性。
結(jié)果，在以下組合中發(fā)現(xiàn)蛋白酶活性提高了10-30％(突變位點(diǎn)的組合通過(guò)+表示，表2)T65P+S387A，T359S+S387A，T65P+V273I+Y320F，T65P+V273I+T359S，T65P+V273I+S387A，T65P+Y320F+S387A，T65P+G101N+S387A，和T65P+V273U+T359S+S387A。
采用以下引物，分別用需要的氨基酸殘基取代了65、101、273、320、359和387號(hào)位置上的氨基酸殘基。然后研究所述每一個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸殘基是否能夠用除了上述取代氨基酸殘基以外的氨基酸殘基取代，并且證實(shí)所述氨基酸殘基的組合是可以取代的。
引物965號(hào)位置上的蘇氨酸(T)被需要的氨基酸殘基(X)所取代(SEQ ID NO11)引物10101號(hào)位置上的甘氨酸(G)被需要的氨基酸殘基(X)所取代(SEQ ID NO12)引物11273號(hào)位置上的纈氨酸(V)被需要的氨基酸殘基(X)所取代(SEQ ID NO13)引物12320號(hào)位置上的蘇氨酸(T)被需要的氨基酸殘基(X)所取代(SEQ ID NO15)引物14387號(hào)位置上的絲氨酸(S)被需要的氨基酸殘基(X)所取代(SEQ ID NO16)
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，當(dāng)273號(hào)位置上的纈氨酸被異亮氨酸、甘氨酸或蘇氨酸所取代，320號(hào)位置上的酪氨酸被苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或甘氨酸所取代，359號(hào)位置上的蘇氨酸被絲氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺所取代，并且387號(hào)位置上的絲氨酸被丙氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸或組氨酸所取代時(shí)，酶的分泌增加，這表明可以在每一個(gè)位置上實(shí)現(xiàn)所述氨基酸的取代。
下面是某些組合的結(jié)果在以下組合中發(fā)現(xiàn)蛋白酶活性提高了10-30％(表2)T65P+Y320F+S387E，T65P+Y320G+S387A，T65P+V273I+T359S+S387E，T65P+V273I+T359L+S387A，T65P+V273I+T359I+S387A，T65P+V273G+T359S+S387A，T65P+V373I+T359S+S387K，T65P+V273I+T359V+S387A，T65P+V273I+T359Q+S387A，T65P+V273I+Y320F+S387K，T65P+V273I+Y320F+S387E，T65P+V273I+Y320F+S387K，T65P+V273I+Y320F+S387A，T65P+V273I+Y320L+S387H，T65P+V273I+Y320V+S387Q，和T65P+V273I+Y320I+S387Q。
表2


業(yè)已證實(shí)，通過(guò)上述突變位點(diǎn)的任意一種組合所獲得的堿性蛋白酶在其轉(zhuǎn)化體形式下增強(qiáng)了所述酶的分泌，同時(shí)又保持了其親代堿性蛋白酶的特征，更具體地講，具有抗氧化劑作用，不會(huì)因?yàn)楦邼舛戎舅岫种破淅业鞍酌附饣钚裕ㄟ^(guò)SDS-PAGE測(cè)定其分子量為43000±2000，并且在堿性范圍內(nèi)具有活性。
例3在分離單菌落并且證實(shí)光暈形成之后，將在例1中獲得的轉(zhuǎn)化體分別接種到試管中的5毫升種子培養(yǎng)基[6.0％(w/v)聚蛋白胨S(NipponPharmaceutical的產(chǎn)品)，0.1％酵母提取物，0.1％麥芽糖，0.02％硫酸鎂7水合物，0.1％磷酸二氫鉀，0.3％無(wú)水碳酸鈉和30ppm四環(huán)素]中，并且在30℃下以320rpm的旋轉(zhuǎn)速度預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜。將由此獲得的種子培養(yǎng)基(1％(v/v))接種到500毫升Sakaguchi燒瓶中的20毫升主培養(yǎng)基[8％(w/v)聚蛋白胨S，0.3％酵母提取物，10％麥芽糖，0.04％硫酸鎂7水合物，0.2％磷酸二氫鉀，1.5％無(wú)水碳酸鈉和30ppm四環(huán)素]中，并且在30℃下以121rpm的旋轉(zhuǎn)速度培養(yǎng)3天。將由此獲得的培養(yǎng)基進(jìn)行離心，并測(cè)定培養(yǎng)上清液中的蛋白酶活性。蛋白酶活性是通過(guò)采用酪蛋白作底物的活性測(cè)定方法測(cè)定的，同時(shí)用“蛋白測(cè)定試劑盒”(Wako Pure Chemicals的產(chǎn)品)測(cè)定蛋白含量。篩選突變的蛋白酶基因，該基因在蛋白酶活性方面的增強(qiáng)被認(rèn)為是與通過(guò)在類(lèi)似條件下培養(yǎng)具有野生型酶基因的轉(zhuǎn)化體獲得的培養(yǎng)上清液的蛋白酶活性進(jìn)行比較的結(jié)果。與培養(yǎng)上清液中蛋白酶活性的增強(qiáng)相比，蛋白含量的增加不太明顯，這表明增強(qiáng)所述酶的比活性所必需的突變被導(dǎo)入了由此獲得的突變蛋白酶基因中。
用“高純度質(zhì)粒分離試劑盒”(Roche產(chǎn)品)從篩選的轉(zhuǎn)化體中收集所述質(zhì)粒，并且測(cè)定其堿基序列。用300納克質(zhì)粒DNA作模板，使用一種引物和“Big Dye DNA測(cè)序試劑盒”(Applied Biosystems產(chǎn)品)在20微升反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行PCR。用“DNA測(cè)序儀377型”(AppliedBiosystems產(chǎn)品)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有增強(qiáng)了的蛋白酶活性的變體在163號(hào)位置上的谷氨酸，170號(hào)位置上的異亮氨酸，171號(hào)位置上的絲氨酸分別被組氨酸，纈氨酸和丙氨酸所取代。
對(duì)一部分培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋?zhuān)缓蠹訕拥接煤?mM氯化鈣的10mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡的“DEAE-Toyopearl”(Tosoh的產(chǎn)品)上，以便收集非吸收性級(jí)份，從而獲得基本上均勻的蛋白酶。測(cè)定由此純化的酶的蛋白含量和酪蛋白酶解活性，并且計(jì)算其比活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)導(dǎo)入上述突變會(huì)導(dǎo)致蛋白酶比活性提高大約15-20％(表3)。
研究了通過(guò)用一種需要的氨基酸取代上述突變位點(diǎn)而增強(qiáng)的蛋白酶活性。使用下文所披露的引物和“定點(diǎn)誘變系統(tǒng)Mutan-SuperExpress Km試劑盒”作為位點(diǎn)專(zhuān)一性誘變手段，研究了突變位點(diǎn)的組合。
引物15163號(hào)位置上的谷氨酸(E)被需要的氨基酸殘基(X)所取代(SEQ ID NO17)引物16170號(hào)位置上的異亮氨酸(I)被需要的氨基酸殘基(X)所取代(SEQ ID NO18)引物17171號(hào)位置上的絲氨酸(S)被需要的氨基酸殘基(X)所取代(SEQ ID NO19)引物18163號(hào)位置上的谷氨酸(E)和171號(hào)位置上的絲氨酸(S)分別被需要的氨基酸殘基(X)所取代(SEQ ID NO20)通過(guò)將上述篩選獲得的突變蛋白酶基因?qū)刖哂杏糜诳敲顾睾Y選的琥珀突變標(biāo)記的pKF18k的多克隆位點(diǎn)中的BamHI和XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建用于導(dǎo)入突變的模板質(zhì)粒。
為了進(jìn)行導(dǎo)入位點(diǎn)專(zhuān)一性突變的PCR反應(yīng)，采用“Takara LA Taq”(Takara的產(chǎn)品)。使用5’末端磷酸化篩選引物(“Mutan-SuperExpress Km”的試劑盒成分)，導(dǎo)入了突變的引物3-8各5皮摩爾和10納克模板質(zhì)粒進(jìn)行導(dǎo)入突變的PCR。在94℃下，在PCR反應(yīng)條件下將模板DNA變性2分鐘，然后進(jìn)行30輪PCR，每一輪包括以下處理94℃1分鐘，55℃1分鐘和72℃4分鐘。用所獲得的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株MV1184，以便獲得突變基因。按照上述堿基序列測(cè)定方法證實(shí)所得到的突變基因的突變位點(diǎn)。
將通過(guò)位點(diǎn)專(zhuān)一性誘變導(dǎo)入了突變的蛋白酶基因?qū)雙HA64，用于轉(zhuǎn)化菌株KP-43，然后在上述條件下培養(yǎng)并純化。與研究過(guò)的野生型酶相比，所述氨基酸取代能夠加強(qiáng)蛋白酶比活性。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以下組合中所述比活性提高了10-30％(表3)E163I，E163L，E163N，E163T，E163V，I170L，S171D，S171G，S171T，E163F+S171A，E163L+S171A，E163Q+S171A，E163V+S171A，E163A+171G，E163D+S171G，E163I+S171G，E163L+S171G，E163S+171G，E163T+S171G，E171V+S171G，E163A+171T，E163H+S171T，E163I+S171T，E163K+S171T，E163L+S171T，E163Q+S171T，E163T+S171T和E163V+S171T。
表3


業(yè)已證實(shí)通過(guò)上述任意一種突變組合獲得的堿性蛋白酶具有增強(qiáng)了的針對(duì)酪蛋白的比活性，同時(shí)保留了其親代堿性蛋白酶的特征，例如，具有抗氧化劑作用，不會(huì)因?yàn)楦邼舛戎舅岫种破淅业鞍酌附饣钚裕ㄟ^(guò)SDS-PAGE測(cè)定其分子量為43000±2000，并且在堿性范圍內(nèi)具有活性。
例4(1)洗滌劑的制備向體積為1立方米的裝有攪拌葉片的水箱中注入465千克水，當(dāng)水箱中的水溫達(dá)到55℃時(shí)，添加135千克40％(w/v)聚丙烯酸鈉的水溶液。攪拌所得到的混合物15分鐘，然后添加120千克碳酸鈉，60千克硫酸鈉，9千克亞硫酸鈉和3千克熒光染料。再攪拌15分鐘，然后添加300千克沸石。攪拌該混合物30分鐘，以便得到均勻的糊劑(該糊劑的含水量為50％wt)。通過(guò)從安裝在噴霧干燥塔頂部附近的高壓噴頭中噴出該糊劑，獲得基礎(chǔ)顆粒(從噴霧干燥塔的底部輸入225℃的高溫氣體，并且以105℃的溫度從其頂部排出氣體。
然后將100份重量的所得到的基礎(chǔ)顆粒填充到Loedige混合器中(Matsuzaka Giken的產(chǎn)品，容量20升，裝有一個(gè)套管)。在主軸攪拌條件下(150rpm)用3分鐘時(shí)間添加含有20份重量的非離子型表面活性劑，22份重量的直鏈烷基(C10-13)-苯磺酸鈉，4份重量的脂肪酸(C14-18)的鈉鹽，2份重量的聚乙二醇和4份重量的水組成的混合物，然后攪拌5分鐘。向所述攪拌器中添加20份重量的結(jié)晶硅酸鈉和10份重量的沸石，以便覆蓋其表面，從而獲得洗滌劑基料。
通過(guò)將99％wt的洗滌劑基料與0.5％wt的蛋白酶顆粒和0.5％wt的芳香劑混合，獲得顆粒狀洗滌A的成品。
(2)所使用的原材料非離子型表面活性劑“Emulgen 108KM”(Kao的產(chǎn)品)，向其中添加了平均8.5M的還氧乙烷聚丙烯酸鈉的水溶液平均分子量為10000(按照在日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)Hei2-24283的實(shí)施例中披露的方法制備)碳酸鈉稠蘇打(Central Glass的產(chǎn)品)沸石“沸石A”，平均粒度為3.5微米(Tosoh的產(chǎn)品)聚乙二醇“K-PEG6000”(平均分子量為8500，Kao的產(chǎn)品)結(jié)晶硅酸鈉“SKS-6粉”(Hoechst Tokuyama的產(chǎn)品)本發(fā)明的蛋白酶顆粒按照日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)昭62-257990的例1中披露的方法獲得顆粒(PU/克)，如表2和3所披露的，將本發(fā)明的每一種溶化的堿性蛋白酶制劑顆粒化熒光染料“Tinopal CBS-X”(Ciba Geizy的產(chǎn)品)
例5(1)洗滌劑的制備在250℃的熱空氣溫度下對(duì)固體含量為50wt％的糊劑進(jìn)行噴霧干燥，以便基礎(chǔ)顆粒含有7wt％的聚丙烯酸鈉(平均分子量為100000)，26wt％的碳酸鈉，20wt％的硫酸鈉，6wt％的氯化鈉，0.5wt％的熒光染料，40wt％的沸石和0.5wt％的水。
然后，將100份重量的所得到的基礎(chǔ)顆粒裝入Loediege攪拌器(Matsuzaka Giken的產(chǎn)品，容量20升，裝有一個(gè)套管)中。在主軸攪拌條件下(150rpm)用3分鐘時(shí)間添加含有20份重量的非離子型表面活性劑，22份重量的直鏈烷基(C10-13)-苯磺酸鈉，4份重量的脂肪酸(C14-18)的鈉鹽，2份重量的聚乙二醇和4份重量的水組成的混合物，然后攪拌5分鐘。向所述攪拌器中添加20份重量的結(jié)晶硅酸鈉和10份重量的沸石，以便覆蓋其表面，從而獲得洗滌劑基料。
通過(guò)混合95％wt的洗滌劑基料與2.8％wt的漂白顆粒，1.2％wt的漂白激活劑顆粒，0.5％wt的本發(fā)明的蛋白酶顆粒和0.5％wt的芳香劑獲得顆粒狀洗滌B的成品。
(2)所使用的原材料非離子型表面活性劑“Emulgen 108KM”(Kao的產(chǎn)品)，向其中添加了平均8.5M的還氧乙烷聚丙烯酸鈉的水溶液平均分子量為10000(按照在日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)Hei2-24283的實(shí)施例中披露的方法制備)碳酸鈉稠蘇打(Central Glass的產(chǎn)品)沸石“沸石A”，平均粒度為3.5微米(Tosoh的產(chǎn)品)聚乙二醇“K-PEG6000”(平均分子量為8500，Kao的產(chǎn)品)結(jié)晶硅酸鈉“SKS-6粉”(Hoechst Tokuyama的產(chǎn)品)本發(fā)明的蛋白酶顆粒按照日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)昭62-257990的例1中披露的方法獲得顆粒(PU/克)，如表2和3所披露的，將本發(fā)明的每一種溶化的堿性蛋白酶制劑顆粒化熒光染料“Tinopal CBS-X”(Ciba Geizy的產(chǎn)品)漂白顆粒碳酸鈉.過(guò)氧化氫加成物(以用于制備
的日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2000-256699中披露的漂白顆粒的類(lèi)似方法獲得)漂白激活劑顆粒顆粒狀月桂酰羥苯磺酸鈉(以用于制備
的日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2000-256699中披露的漂白顆粒的類(lèi)似方法獲得)例6制備了表4所示的液體洗滌劑組合物(洗滌劑C和洗滌劑D)表4


1)聚氧乙烯(平均添加7摩爾)烷基醚，烷基基團(tuán)源于C12-14仲醇(“Softanol 70”，Nippon Shokubai的產(chǎn)品)。
2)聚氧乙烯(平均添加12摩爾)烷基醚，烷基基團(tuán)源于C12-14仲醇(“Softanol 120”，Nippon Shokubai的產(chǎn)品)。
3)通過(guò)按以下順序向C10-14直鏈伯醇中團(tuán)塊添加平均5摩爾的EO、平均2摩爾的PO和平均3摩爾的EO獲得的。
4)平均添加了8摩爾的EO的聚氧乙烯月桂基乙醚。
5)平均添加了15.5摩爾的EO的聚氧乙烯月桂基乙醚。
6)小范圍聚氧乙烯烷基(仲-C12/C13)醚。
7)C15-14直鏈烷基苯磺酸鈉。
8)酰胺/醚改性的硅氧烷聚合物(“BY16-96”)，Dow CorningToray Silicone的產(chǎn)品)。
9)按照披露于日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)Hei10-60476的第11頁(yè)第6-13行披露的方法合成苯氧聚乙二醇-丙烯酸-馬來(lái)酸共聚物(平均分子量10000，固體含量51.2％)10)戊烯和馬來(lái)酰(50∶50摩爾比)共聚物的鈉鹽(平均分子量7000)11)表2和3中所示出的每一種本發(fā)明堿性蛋白酶的純化制劑(15PU/克)例7在下面的表5中所示出的成分中添加聚丙烯酸鈉(直鏈烷基)磺酸鈉或非離子型表面活性劑，以及月桂酰羥苯磺酸鈉的40％的水溶液，同時(shí)攪拌并混合過(guò)碳酸鈉和碳酸鈉(稠蘇打)。然后添加按照在日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)昭62-257990的例1中披露的方法制備的本發(fā)明的蛋白酶顆粒。攪拌所得到的混合物，直到所有溶液變均勻，從而制備了一種漂白洗滌劑。
表5


1)粒度為500-700微米2)(C12-14)直鏈烷基苯磺酸鈉3)聚氧乙烯烷基醚(具有C12-14烷基基團(tuán)，平均添加了12摩爾的EO)4)平均分子量為80005)用表2和3所示本發(fā)明的每一種堿性蛋白酶的純化制劑制備的顆粒(6PU/克)，所述制劑是按照在日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)昭62-257990的例1中披露的方法制備的。
例8制備了在下面的表6中示出的自動(dòng)洗碗洗滌組合物(洗滌劑G和H)表6


1)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(平均分子量2000)2)C12-14仲醇的7摩爾的環(huán)氧乙烷和8.5摩爾環(huán)氧丙烷的加成物3)JIS No.2的檸檬酸鈉4)丙烯酸-馬來(lái)酸共聚物5)“Duramy160TTM”(NoVozymes的產(chǎn)品)6)用表2和3所示本發(fā)明的每一種堿性蛋白酶的純化制劑制備的顆粒(6PU/克)，所述制劑是按照在日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)昭62-257990的例1中披露的方法制備的。
例9使用在表7中示出的成分制備硬表面洗滌組合物(洗滌劑J)。
表7


1)聚氧乙烯(EOP＝4)烷基(C12)醚硫酸鈉2)聚氧乙烯(EOP＝4)烷基(C12)醚3)烷基(C12)聚葡糖苷(縮合度)1.34)單(長(zhǎng)鏈)叔烷基(C12)氧化二甲胺5)烷基(C12)羥基二甲基磺基甜菜堿6)分子量100007)披露于表2和3中的本發(fā)明的每一種堿性蛋白酶的純化制劑(15PU/克)例10用上述洗滌劑A(參見(jiàn)例2)獲得了在下面的表8中示出的顆粒狀洗滌劑表8


1)由表2和3所示本發(fā)明的每一種堿性蛋白酶的純化制劑制備的顆粒(6PU/克)，所述制劑是按照在日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)昭62-257990的例1中披露的方法制備的。
2)由披露于日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)昭Hei5-25492中的蛋白酶K-16獲得的5PU/克的蛋白酶，該蛋白酶是按照在日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)昭62-257990的例1中披露的方法制備的。
3)“KAC-500”(Kao的產(chǎn)品)4)“Lipolase100TTM”(Novogymes的產(chǎn)品)工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明能夠有效生產(chǎn)并提供一種堿性蛋白酶，這種蛋白酶在即使存在高濃度脂肪酸的條件下也具有活性，并且在去除不僅含有蛋白，而且還含有皮脂等的復(fù)雜污漬方面具有出色的去污力，因此，可以作為一種酶摻入洗滌劑中。
序列表<110>花王株式會(huì)社(KAO CORPORATION)<120>堿性蛋白酶<130>KS0696<150>JP 2002-081428<151>2002-03-22<150>JP 2002-165987<151>2002-06-06<150>JP 2002-304230<151>2002-10-18<150>JP 2002-304231<151>2002-10-18<160>20<170>Patentln Ver.3.1<210>1<211>434<212>PRT<213>芽孢桿菌屬種(Bacillus sp.)<400>1Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser1 5 10 15Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly20 25 30Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly35 40 45Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp50 55 60Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly65 70 75 80Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser85 90 95Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln100 105 110Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn115 120 125Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn130 135 140Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala145 150 155 160Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala165 170 175Lys Asn Ala lle Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe180 185 190Gly Ser Tyr Ala Asp Asn lle Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg195 200 205Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly210 215 220Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe225 230 235 240Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met245 250 255Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe260 265 270Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala275 280 285Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn290 295 300Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr305 310 315 320Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser325 330 335Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser
340 345 350Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu355 360 365Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp370 375 380Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu385 390 395 400Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val405 410 415Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile420 425 430Val Asn<210>2<211>1305<212>DNA<213>芽孢桿菌屬種(Bacillus sp.)KSM-KP43<220><221>CDS<222>(1)..(1305)<400>2aat gat gtt gcg cgt gga att gtc aaa gcg gat gtg gct cag agc agc 48Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser1 5 10 15tac ggg ttg tat gga caa gga cag atc gta gcg gtt gcc gat aca ggg 96Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly20 25 30ctt gat aca ggt cgc aat gac agt tcg atg cat gaa gcc ttc cgc ggg 144Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly35 40 45aaa att act gca tta tat gca ttg gga cgg acg aat aat gcc aat gat 192Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp50 55 60acg aat ggt cat ggt acg cat gtg gct ggc tcc gta tta gga aac ggc 240Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly65 70 75 80tcc act aat aaa gga atg gcg cct cag gcg aat cta gtc ttc caa tct 288Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser85 90 95atc atg gat agc ggt ggg gga ctt gga gga cta cct tcg aat ctg caa 336Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln100 105 110acc tta ttc agc caa gca tac agt gct ggt gcc aga att cat aca aac 384Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn115 120 125tcc tgg gga gca gca gtg aat ggg gct tac aca aca gat tcc aga aat 432Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn130 135 140gtg gat gac tat gtg cgc aaa aat gat atg acg atc ctt ttc gct gcc 480Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala145 150 155 160ggg aat gaa gga ccg aac ggc gga acc atc agt gca cca ggc aca gct 528Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala165 170 175aaa aat gca ata aca gtc gga gct acg gaa aac ctc cgc cca agc ttt 576Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe180 185 190ggg tct tat gcg gac aat atc aac catgtg gca cag ttc tct tca cgt 624Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg195 200 205gga ccg aca aag gat gga cgg atc aaa ccg gat gtc atg gca ccg gga 672Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly210 215 220acg ttc ata cta tca gca aga tct tct ctt gca ccg gat tcc tcc ttc 720Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe225 230 235 240tgg gcg aac cat gac agt aaa tat gca tac atg ggt gga acg tcc atg 768Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met
245 250 255gct aca ccg atc gtt gct gga aac gtg gca cag ctt cgt gag cat ttt 816Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe260 265 270gtg aaa aac aga ggc atc aca cca aag cct tct cta tta aaa gcg gca 864Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala275 280 285ctg att gcc ggt gca gct gac atc ggc ctt ggc tac ccg aac ggt aac 912Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn290 295 300caa gga tgg gga cga gtg aca ttg gat aaa tcc ctg aac gtt gcc tat 960Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr305 310 315 320gtg aac gag tcc agt tct cta tcc acc agc caa aaa gcg acg tac tcg 1008Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser325 330 335ttt act gct act gcc ggc aag cct ttg aaa atc tcc ctg gta tgg tct 1056Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser340 345 350gat gcc cct gcg agc aca act gct tcc gta acg ctt gtc aat gat ctg 1104Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu355 360 365gac ctt gtc att acc gct cca aat ggc aca cag tat gta gga aat gac 1152Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp370 375 380ttt act tcg cca tac aat gat aac tgg gat ggc cgc aat aac gta gaa 1200Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu385 390 395 400aat gta ttt att aat gca cca caa agc ggg acg tat aca att gag gta 1248Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val405 410 415cag gct tat aac gta ccg gtt gga cca cag acc ttc tcg ttg gca att 1296Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile420 425 430gtg aat taa 1305Val Asn435<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>3aaatggatcc gtgaggaggg aaccgaatga gaaagaagaa aaaggtg 47<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>4atattctaga cgattaccat attaattcct ctaccc 36<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5aatgccaatg atccgaatgg tcatg 25？<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>6tctatcatgg atagcaatgg gggacttgga gg 32<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>7cttcgtgagc attttatcaa aaacagaggc atc 33<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8aacgttgcct ttgtgaacga gtcc 24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9gcgagcacat ctgcttccgt aacg 24<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>10tgactttact gcgccataca atgataac 28<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>11cgaataatgc caatgatnnn aatggtcatg gtacgc 36<210>12<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>12ctatcatgga tagcnnnggg ggacttggag g 31<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>13cgtgagcatt ttnnnaaaaa cagaggcatc acacc 35<210>14<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>14ccctgaacgt tgccnnngtg aacgagtcc 29<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>15cccctgcgag cacannngct tccgtaacgc 30<210>16<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>16ggaaatgact ttactnnncc atacaatgat aactgg 36<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>17cgctgccggg aatnnnggac cgaacggc 28<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>18ccgaacggcg gaaccnnnag tgcaccaggc aca 33<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>19cggcggaacc atcnnngcac caggcacagc 30<210>20<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>20cgctgccggg aatnnnggac cgaacggcgg aaccatcnnn gcaccaggca cagc 54
權(quán)利要求
1.一種堿性蛋白酶，其中，在SEQ ID NO1所示氨基酸序列的(a)65號(hào)位置，(b)101號(hào)位置，(c)163號(hào)位置，(d)170號(hào)位置，(e)171號(hào)位置，(f)273號(hào)位置，(g)320號(hào)位置，(h)359號(hào)位置，或(i)387號(hào)位置或與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是從以下氨基酸殘基中選擇的位置(a)脯氨酸，位置(b)天冬酰胺，位置(c)組氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，賴(lài)氨酸，天冬酰胺，絲氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，蘇氨酸和纈氨酸，位置(d)纈氨酸和亮氨酸，位置(e)丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和蘇氨酸，位置(f)異亮氨酸，甘氨酸和蘇氨酸，位置(g)苯丙氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸和甘氨酸，位置(h)絲氨酸，亮氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，和谷氨酰胺，和位置(i)丙氨酸，賴(lài)氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸和組氨酸。
2.一種堿性蛋白酶，具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列或與該序列有至少80％的同源性的另一種氨基酸序列，其中，在SEQ ID NO1所示氨基酸序列的(a)65號(hào)位置，(b)101號(hào)位置，(c)163號(hào)位置，(d)170號(hào)位置，(e)171號(hào)位置，(f)273號(hào)位置，(g)320號(hào)位置，(h)359號(hào)位置，或(i)387號(hào)位置或與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是從以下氨基酸殘基中選擇的位置(a)脯氨酸，位置(b)天冬酰胺，位置(c)組氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，賴(lài)氨酸，天冬酰胺，絲氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，蘇氨酸和纈氨酸，位置(d)纈氨酸和亮氨酸，位置(e)丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和蘇氨酸，位置(f)異亮氨酸，甘氨酸和蘇氨酸，位置(g)苯丙氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸和甘氨酸，位置(h)絲氨酸，亮氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，和谷氨酰胺，和位置(i)丙氨酸，賴(lài)氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸和組氨酸。
3.編碼權(quán)利要求
1或2的堿性蛋白酶的基因。
4.含有權(quán)利要求
3的基因的重組載體。
5.含有權(quán)利要求
4的載體的轉(zhuǎn)化體。
6.如權(quán)利要求
5的轉(zhuǎn)化體，其中，所述宿主是微生物。
7.含有權(quán)利要求
1或2的堿性蛋白酶的洗滌劑組合物。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明提供了一種堿性蛋白酶，其中，在SEQ ID NO1所示氨基酸序列的(a)65號(hào)位置，(b)101號(hào)位置，(c)163號(hào)位置，(d)170號(hào)位置，(e)171號(hào)位置，(f)273號(hào)位置，(g)320號(hào)位置，(h)359號(hào)位置，或(i)387號(hào)位置或與之相應(yīng)的位置上的氨基酸殘基是從以下氨基酸殘基中選擇的位置(a)脯氨酸，位置(b)天冬酰胺，位置(c)組氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，賴(lài)氨酸，天冬酰胺，絲氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，蘇氨酸或纈氨酸，位置(d)纈氨酸或亮氨酸，位置(e)丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸或蘇氨酸，位置(f)異亮氨酸，甘氨酸或蘇氨酸，位置(g)苯丙氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸或甘氨酸，位置(h)絲氨酸，亮氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，或谷氨酰胺，和位置(i)丙氨酸，賴(lài)氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸和組氨酸。本發(fā)明能夠有效生產(chǎn)并提供一種堿性蛋白酶，這種蛋白酶在即使存在高濃度脂肪酸的條件下也具有活性，并且在去除不僅含有蛋白，而且還含有皮脂等的復(fù)雜污漬方面具有出色的去污力，因此，可以作為一種酶摻入洗滌劑中。
文檔編號(hào)C12N9/16GKCN1446910SQ03107456
公開(kāi)日2003年10月8日 申請(qǐng)日期2003年3月21日
發(fā)明者奧田光美, 佐藤剛, 齋藤和廣, 住友伸行, 伊澤啟文, 佐伯勝久, 小林徹, 野村昌史 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan