本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及金橙II降解菌AO7-1及其生產(chǎn)的菌劑，是利用微生物的方法降解偶氮染料金橙II，適用于環(huán)境污染的治理。

背景技術(shù)：

偶氮染料（偶氮基兩端連接芳基的一類(lèi)化合物）是紡織品服裝在印染工藝中應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)合成染料，用于多種天然和合成纖維的染色和印花，也用于油漆、塑料、橡膠等的著色。在特殊條件下，它能分解產(chǎn)生20多種致癌芳香胺，經(jīng)過(guò)活化作用改變?nèi)梭w的DNA結(jié)構(gòu)引起病變和誘發(fā)癌癥。

偶氮化合物共同的特征為分子中含有偶氮鍵“-N=N-”。一般來(lái)說(shuō)，偶氮化合物的分子中含有1-3個(gè)“-N=N-”，鍵上連有笨或苯基，苯或苯基又連有-Cl、-NH₂、-CH₃、-SO₃、-NO₂及-OH等基團(tuán)。

偶氮染料污染的主要特點(diǎn)是污染量大，雖然偶氮染料廢水中殘留的染料成分濃度很低，但是排入水體會(huì)造成水體的透光率降低，破壞水體生態(tài)系統(tǒng)。這些染料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有抗堿、抗酸、抗微生物、抗光等特性，可以較長(zhǎng)時(shí)間地滯留在環(huán)境中，因此存在潛在的健康危害。在生產(chǎn)和使用染料的地方，地下水和地表水的重要污染物就是偶氮染料。在很多染料工業(yè)密集的地區(qū)，河流和地下水都面臨著嚴(yán)重污染的危險(xiǎn)。

偶氮染料對(duì)人體的健康也有嚴(yán)重危害。日本人Yoshida等在20世紀(jì)30年代發(fā)現(xiàn)，溶劑黃可以引起老鼠肝細(xì)胞癌變。此后，人們才開(kāi)始意識(shí)到，在生產(chǎn)和使用過(guò)程中，偶氮染料及其中間體具有危險(xiǎn)性。芳香胺作為偶氮染料中間體，已被一些國(guó)家列為可疑致癌物，其中β-萘胺和聯(lián)苯胺已經(jīng)被確認(rèn)為是對(duì)人類(lèi)最具烈性的致癌物。

其中，偶氮基經(jīng)常會(huì)與一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)系統(tǒng)相連，而形成共軛體系，從而作為染料的發(fā)色體。他幾乎分布于所有顏色。偶氮染料不僅僅可以用于紡織品的印染，還可以用來(lái)染紙張、皮革、食品等。應(yīng)該指出的是，在一般情況下，偶氮染料自身不會(huì)危害人體健康，但是部分偶氮染料使用芳香胺類(lèi)中間體合成的，而芳香胺類(lèi)中間體具有致癌性，當(dāng)人體皮膚長(zhǎng)時(shí)間與其接觸后，通過(guò)人體正常的新陳代謝過(guò)程而釋放出的物質(zhì)就會(huì)與其結(jié)合，結(jié)合后會(huì)發(fā)生還原反應(yīng)，該反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致偶氮基斷裂，從而再次生成具有致癌性的芳香胺類(lèi)化合物，假如這些生成的化合物被人體重新吸收，在經(jīng)過(guò)活化作用以后，人體的細(xì)胞就會(huì)在結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)生改變，轉(zhuǎn)變成為人體病變的誘因。這樣的結(jié)果是，導(dǎo)致癌癥的可能性。

偶氮染料金橙II產(chǎn)品可溶于水，偶氮染料金橙II對(duì)環(huán)境的污染已嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康，其污染環(huán)境的綜合治理，未見(jiàn)有比較成熟和穩(wěn)定高效的技術(shù)。金橙II高效降解菌株資源極其匱乏。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種金橙II降解菌AO7-1及其生產(chǎn)的菌劑，能夠高效地降解金橙II，使其脫色率超過(guò)90%，用于相關(guān)染料廢水生物強(qiáng)化處理及水體或土壤的污染治理，豐富金橙II降解菌株資源庫(kù)。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：該金橙II降解菌AO7-1是解糖假蒼白桿菌Pseudochrobactrum saccharolyticum，菌株AO7-1于2016年9月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC M2016501。

利用金橙II降解菌AO7-1生產(chǎn)的菌劑，它的生產(chǎn)方法包括以下步驟：

步驟(1)：用接種環(huán)刮取一環(huán)金橙II降解菌AO7-1的試管種接種于中，30℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；其中，1L發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的重量含量為：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉0.5%，其余去離子水，pH為9.0；

步驟(2)：將步驟（1）培養(yǎng)好的菌種按培養(yǎng)基體積的1%接種入500L種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；1L種子罐培養(yǎng)基中各組分的重量含量為：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉0.5%，其余去離子水，pH為9.0；培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)過(guò)程中通無(wú)菌空氣，每分鐘通入的無(wú)菌空氣與培養(yǎng)基體積之比為1:0.6~1.2，攪拌速度為180~240r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為48~60h；

步驟(3)：將步驟（2）的種子液按培養(yǎng)基體積的10%接入生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)；生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)過(guò)程中通無(wú)菌空氣，每分鐘通入的無(wú)菌空氣與培養(yǎng)基體積之比為1:0.6~1.2，攪拌速度為180~240r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為48~60h；

步驟(4)：生產(chǎn)罐中，當(dāng)菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上時(shí)發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐，直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，該液體劑即為菌劑。

本發(fā)明的有益效果是：金橙II降解菌AO7-1菌劑生產(chǎn)使用成本低，使用方便，該細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度為30oC左右，最適環(huán)境pH為9.0左右，在短時(shí)間內(nèi)使偶氮染料金橙II降解，降解菌AO7-1能使偶氮染料金橙II的殘留量降低90%以上，去除效果好，適合相關(guān)染料廢水生物強(qiáng)化處理及水體和土壤的污染治理，對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境、保護(hù)人類(lèi)身體健康、提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1是菌株AO7-1對(duì)金橙II的降解進(jìn)程；

圖2是溫度對(duì)AO7-1降解效率的影響；

圖3-1是pH對(duì)菌株AO7-1生長(zhǎng)的影響；

圖3-2是pH對(duì)AO7-1降解效率的影響；

圖3-3是系列pH條件下菌株AO7-1對(duì)染料金橙II的吸附；

圖4是鹽濃度對(duì)AO7-1降解效率的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及其附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的分析，但不能理解為是對(duì)技術(shù)方案的限制。

金橙II降解菌AO7-1，其菌株是解糖假蒼白桿菌Pseudochrobactrum saccharolyticum，于2016年9月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC M2016501。

1. 菌株的分離和鑒定：取污染土壤10g，置于100mL的無(wú)菌水中，振蕩5min，得土壤菌懸液；取5mL的土壤菌懸液，加入到100mL的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基[[NH₄NO₃ 1g/L, KH₂PO₄ 1.5g/L, K₂HPO₄ 0.5 g/L, NaCl 0.5g/L, MgSO₄·7H2O, 0.2g/L]中，添加金橙II作為碳源，置于30℃，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)獲得富集液，梯度稀釋富集液涂布于添加金橙II的培養(yǎng)基平板上，直到獲得金橙II的降解菌株；該降解菌命名為AO7-1，菌株經(jīng)16S rRNA基因PCR擴(kuò)增、測(cè)序及比對(duì)分析，鑒定為解糖假蒼白桿菌Pseudochrobactrum saccharolyticum；該細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度為30oC左右，最適環(huán)境pH為9.0左右，在實(shí)驗(yàn)室條件下該菌降解金橙II的降解率可達(dá)90%以上，該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。

2. 實(shí)驗(yàn)室生物降解實(shí)驗(yàn)

2.1菌株AO7-1對(duì)金橙II的降解進(jìn)程：菌株AO7-1在LB培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基配方：蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化鈉0.5%，）中振蕩（30℃，180rpm）培養(yǎng)過(guò)夜，次日取菌株種子液加液體LB稀釋3倍后加入金橙II母液，使其終濃度為20mg/L；將該降解體系放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置，并按時(shí)間間隔取樣（時(shí)間間隔為2小時(shí)），所取樣品置于冰水混合物中保存，待所有樣品取完后統(tǒng)一處理；所有樣品取完后，經(jīng)12000rpm、3min離心去除菌體，得到含有尚未被降解脫色的金橙II的上清液；上清液采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于484nm處測(cè)量其光密度值；實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別檢測(cè)吸光度后計(jì)算平均值并以此來(lái)衡量體系中金橙II的殘留量；結(jié)果如圖1所示：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株AO7-1能夠快速使金橙II溶液脫色，18小時(shí)內(nèi)脫色率超過(guò)90%；據(jù)此判斷菌株AO7-1對(duì)金橙II具有很好的降解脫色性能。

2.2溫度對(duì)AO7-1降解效率的影響：溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)和代謝具有非常顯著的影響，為闡明溫度對(duì)菌株AO7-1降解金橙II的影響，將菌株過(guò)夜培養(yǎng)后建立降解體系（同2.1）；將該降解體系平均分成6份，每份設(shè)置三個(gè)重復(fù)；將均分后的混合液分別放置于0℃、10℃、20℃、30℃、37℃、50℃、60℃恒溫培養(yǎng)箱中，溫浴10小時(shí)后取出樣品，離心，分別測(cè)定并計(jì)算不同溫度下菌株AO7-1對(duì)偶氮染料金橙II的降解率（樣品處理和檢測(cè)方法同2.1）；結(jié)果如圖2所示：低溫和高溫對(duì)菌株降解金橙II均具有顯著的抑制作用，37℃左右是菌株降解金橙II的最適宜溫度。

2.3 pH對(duì)AO7-1降解效率的影響：pH對(duì)微生物生長(zhǎng)和代謝同樣具有非常顯著的影響，微生物都具有一個(gè)適宜生長(zhǎng)和代謝的pH范圍，超出這個(gè)范圍，微生物就不能很好地生長(zhǎng)和代謝。

為考察pH對(duì)菌株AO7-1生長(zhǎng)的影響，分別用鹽酸或氫氧化鈉溶液將液體LB培養(yǎng)基調(diào)至pH3~pH10；按1%接種量，接種在LB中過(guò)夜培養(yǎng)的AO7-1種子液至20mL系列pH值的LB培養(yǎng)基中，置于30℃，180rpm恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)約6小時(shí)后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600nm處測(cè)定菌液吸光值，并以O(shè)D600值來(lái)衡量對(duì)應(yīng)樣品的菌體濃度；結(jié)果如圖3-1所示：圖3-1的結(jié)果顯示菌株在中性偏堿環(huán)境下生長(zhǎng)良好，菌株生長(zhǎng)的適宜pH范圍是6~9，偏酸性環(huán)境及強(qiáng)堿性環(huán)境對(duì)菌株的生長(zhǎng)具有極強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)pH小于等于5或大于等于10時(shí)菌株無(wú)法正常生長(zhǎng)。

將菌株AO7-1在LB中的過(guò)夜培養(yǎng)物等分成8份，12000rpm，3min離心收集菌體，并分別用等體積系列pH值的LB培養(yǎng)液重懸體，加入終濃度為20mg/L的金橙II母液，構(gòu)建好的降解體系置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，溫浴10小時(shí)后取出樣品，計(jì)算和分析不同pH條件下菌株對(duì)金橙II的降解率（樣品處理和檢測(cè)方法同2.1），以研究pH對(duì)菌株AO7-1降解金橙II的影響；結(jié)果如圖3-2和3-3所示：圖3-2顯示pH3-5范圍內(nèi)混合液中金橙II的去除率逐步降低；pH6-9時(shí)去除率逐步升高，pH10時(shí)去除率略有降低；但在偏酸性環(huán)境中，菌株AO7-2對(duì)金橙II有明顯的吸附作用，從圖3-3可以看出pH越低，菌株吸附染料的濃度就越大，顏色也就越深；綜合混合液中染料殘留和菌體吸附情況，判斷菌株在偏堿性環(huán)境中對(duì)金橙II有較好的降解效果，最適pH為9。

2.4鹽度對(duì)AO7-1降解效率的影響：鹽濃度是環(huán)境質(zhì)量評(píng)估和污水處理過(guò)程中經(jīng)?？疾榈闹匾獏?shù)之一，對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝有較大影響；為研究鹽濃度對(duì)菌株AO7-1的生長(zhǎng)的影響，按1%接種量，分別接種在LB中過(guò)夜培養(yǎng)的AO7-1種子液至20mL含系列鹽濃度（0%，0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%）的LB培養(yǎng)基中，置于30℃，180rpm恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)約6小時(shí)后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600nm處測(cè)定菌液吸光值，并以O(shè)D₆₀₀值來(lái)衡量對(duì)應(yīng)樣品的菌體濃度；將菌株AO7-1在LB中的過(guò)夜培養(yǎng)物等分成10份，12000rpm，3min離心收集菌體，并分別用等體積含系列鹽濃度的LB培養(yǎng)液重懸體，加入終濃度為20mg/L的金橙II母液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，溫浴10小時(shí)后取出樣品，計(jì)算和分析不同鹽濃度條件下菌株對(duì)金橙II的降解率（樣品處理和檢測(cè)方法同2.1），以研究鹽濃度對(duì)菌株AO7-1降解金橙II的影響；結(jié)果如圖4所示：隨著鹽濃度的提高，菌株AO7-1的生長(zhǎng)受到顯著地抑制，對(duì)金橙II的降解率也略有下降，但影響不顯著。

生產(chǎn)實(shí)施例1：依以下步驟生產(chǎn)金橙II降解菌AO7-1菌劑

步驟(1)：用接種環(huán)刮取一環(huán)金橙II降解菌AO7-1的試管種接種于中，30℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；其中，1L發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的重量含量為：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉0.5%，其余去離子水，pH為9.0；

步驟(2)：將步驟（1）培養(yǎng)好的菌種按培養(yǎng)基體積的1%接種入500L種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；1L種子罐培養(yǎng)基中各組分的重量含量為：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉0.5%，其余去離子水，pH為9.0；培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)過(guò)程中通無(wú)菌空氣，每分鐘通入的無(wú)菌空氣與培養(yǎng)基體積之比為1:0.6，攪拌速度為180r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h；

步驟(3)：將步驟（2）的種子液按培養(yǎng)基體積的10%接入生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)；生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)過(guò)程中通無(wú)菌空氣，每分鐘通入的無(wú)菌空氣與培養(yǎng)基體積之比為1:0.6，攪拌速度為180r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h；

步驟(4)：在生產(chǎn)罐中，當(dāng)菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上時(shí)發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐，直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，該液體劑即為菌劑。

生產(chǎn)實(shí)施例2：依以下步驟生產(chǎn)金橙II降解菌AO7-1菌劑

步驟(1)：用接種環(huán)刮取一環(huán)金橙II降解菌AO7-1的試管種接種于中，30℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；其中，1L發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的重量含量為：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉0.5%，其余去離子水，pH為9.0；

步驟(2)：將步驟（1）培養(yǎng)好的菌種按培養(yǎng)基體積的1%接種入500L種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；1L種子罐培養(yǎng)基中各組分的重量含量為：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉0.5%，其余去離子水，pH為9.0；培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)過(guò)程中通無(wú)菌空氣，每分鐘通入的無(wú)菌空氣與培養(yǎng)基體積之比為1:0.9，攪拌速度為210r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為54h；

步驟(3)：將步驟（2）的種子液按培養(yǎng)基體積的10%接入生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)；生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)過(guò)程中通無(wú)菌空氣，每分鐘通入的無(wú)菌空氣與培養(yǎng)基體積之比為1:0.9，攪拌速度為210r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為54h；

步驟(4)：在生產(chǎn)罐中，當(dāng)菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上時(shí)發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐，直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，該液體劑即為菌劑。

生產(chǎn)實(shí)施例3：依以下步驟生產(chǎn)金橙II降解菌AO7-1菌劑

步驟(1)：用接種環(huán)刮取一環(huán)金橙II降解菌AO7-1的試管種接種于中，30℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；其中，1L發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的重量含量為：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉0.5%，其余去離子水，pH為9.0；

步驟(2)：將步驟（1）培養(yǎng)好的菌種按培養(yǎng)基體積的1%接種入500L種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；1L種子罐培養(yǎng)基中各組分的重量含量為：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉0.5%，其余去離子水，pH為9.0；培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)過(guò)程中通無(wú)菌空氣，每分鐘通入的無(wú)菌空氣與培養(yǎng)基體積之比為1:1.2，攪拌速度為240r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為60h；

步驟(3)：將步驟（2）的種子液按培養(yǎng)基體積的10%接入生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)；生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)過(guò)程中通無(wú)菌空氣，每分鐘通入的無(wú)菌空氣與培養(yǎng)基體積之比為1:1.2，攪拌速度為240r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為60h；

步驟(4)：在生產(chǎn)罐中，當(dāng)菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上時(shí)發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐，直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，該液體劑即為菌劑。

實(shí)施例1-3所得菌劑降解金橙II的效果如下表：

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