專利名稱：一株菊酯類農(nóng)藥降解菌及其菌劑制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株分離自大葉黃楊葉際的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌，及其菌劑制備
方法。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
菊酯類農(nóng)藥是廣譜性殺蟲劑，具有速效、高效、低毒、低殘留，對(duì)作物安全等特點(diǎn)，除對(duì)140多種害蟲防治有特效外，有些菊酯類農(nóng)藥還對(duì)地下害蟲和螨類害蟲有較好的防治效果。中國專利(授權(quán)公告號(hào)CN 1063017C)公布了一種愛福丁、擬除蟲菊酯(氰戊菊酯，氯氰菊酯)為有效成分的復(fù)配殺蟲劑，主要用于防治小菜蛾，斜紋夜蛾等農(nóng)業(yè)害蟲。中國專利(授權(quán)公告號(hào)CN 1242675C)公布了一種用阿維菌素和高效氯氰菊酯作為主要成份，加乳化劑，混合有機(jī)溶劑和水配成的殺蟲劑組合物，可防治梨木虱，斑潛蠅等害蟲。
作為高效、低毒殺蟲劑，擬除蟲菊酯主要用于防治棉田、菜地、果樹和茶葉上的農(nóng)業(yè)害蟲以及衛(wèi)生害蟲。近幾年來其使用量越來越大，擬除蟲菊酯已經(jīng)成為傳統(tǒng)有機(jī)磷農(nóng)藥的替代品之一，但是近些年發(fā)現(xiàn)其對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)危害較大。如王彥美等(高效氯氟氰菊酯對(duì)黃鱔的急性毒性作用，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008， 36 (12) :4999-5000)報(bào)道48h時(shí)0. 0552 y g/L的高效氯氟氰菊酯即使黃鱔全部死亡。 國內(nèi)外對(duì)菊酯類農(nóng)藥殘留進(jìn)行了一些研究，主要有農(nóng)藥的使用和殘留、降低農(nóng)殘的對(duì)策、農(nóng)藥在植物體內(nèi)和環(huán)境中的降解規(guī)律、農(nóng)藥降解微生物的研究等。但是，對(duì)于如何降低農(nóng)殘的研究僅限于合理使用農(nóng)藥、改進(jìn)農(nóng)藝措施、加強(qiáng)管理等，具體措施不夠完善，缺乏直接降低靶標(biāo)農(nóng)藥殘留的有效方法；另外，對(duì)農(nóng)藥降解菌的研究多局限于菌株的分離及其生理特性的測定。 劉君寒等( 一株氯氰菊酯降解菌的分離和鑒定，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2007,30(3):68-72)從氯氰菊酯污染土壤中，分離到一株可降解氯氰菊酯和聯(lián)苯菊酯銅綠假單胞菌。洪永聰?shù)劝l(fā)表文章(蠟狀芽孢桿菌菌株TR2對(duì)氯氰菊酯降解作用的小區(qū)試驗(yàn)，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2008，24(4) :291-293)指出通過室內(nèi)盆栽和茶園小區(qū)的試驗(yàn)，蠟狀芽孢桿菌菌株TR2可有效減少茶園小區(qū)氯氰菊酯的殘留。 目前，尚未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道從植物葉際分離出菊酯類農(nóng)藥的降解菌及其菌劑制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株分離自大葉黃楊葉際的菊酯類農(nóng)藥降解菌，及其菌劑制備方法。 本發(fā)明所提供的生防菌株是由我們實(shí)驗(yàn)室從大葉黃楊的葉面上分離篩選出來的。將其編號(hào)為EBL-07，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為二零零八年十月十三日，分類命名為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。保藏編號(hào)為CGMCC No. 2699。該菌株具有下列性質(zhì)
菌落形態(tài)特征及菌體形態(tài)特征 在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈深褐色、扁平、不規(guī)則、邊緣鋸齒狀。在LB液體培養(yǎng)基中為墨綠色，無芽孢，革蘭氏染色呈陰性，氧化酶和接觸酶皆為陽性，V.P反應(yīng)為陰性，可水解明膠，能運(yùn)動(dòng)。
抗藥性測定 菌株對(duì)6種抗生素的敏感性測定結(jié)果表明菌株對(duì)卡那霉素、氨節(jié)青霉素有抗性，
對(duì)多粘霉素、氯霉素、四環(huán)素、慶大霉素敏感。
16S rDNA基因序列 用27f與1492r為引物進(jìn)行擴(kuò)增出的該菌株的16S rDNA基因的部分序列，測序結(jié)果遞交到GenBank，登錄號(hào)為EF545556。在http:〃麗w. ncbi. nlm. nih. gov/網(wǎng)站上用blast程序與已登陸細(xì)菌菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明與多粘類芽孢桿菌的相似性最高，達(dá)到99%以上。 本發(fā)明所述的菌劑的生產(chǎn)方法如下 1、培養(yǎng)基配制a)LB培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加水至1L，pH 7.0;b)LB培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，加水至1L，pH 7. 0 ;c)種子培養(yǎng)基(液體，1L) :MgS040. 10g，KH2P040. 50g，NaCl 0. 50g，K2HP04l. 50g，蔗糖10g，蛋白胨5g，加水至1L， pH 7. 0 ;d)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，1L) :MgS040. 10g，KH2P040. 50g， NaCl 0. 50g， K2HP041. 50g，蔗糖10g，玉米槳5g，加水至1L， pH 7. 0 ;以上培養(yǎng)基均在121。C滅菌20min。 2、菌種活化挑取擬除蟲菊酯降解菌至LB固態(tài)培養(yǎng)基，28t:連續(xù)劃線挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在LB液態(tài)培養(yǎng)基，于28°C ， 150r/min搖床振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)過夜；
3、液體種子制備向高溫滅菌的種子培養(yǎng)基中，按照5% _10%的接種量接種擬除蟲菊酯降解菌，于25-35°C ， 200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12_24h，得到液體種子。
4、液態(tài)發(fā)酵向高壓滅菌的種子培養(yǎng)基中，接種擬除蟲菊酯降解菌，于25-35t:，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)18_72h。 5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，調(diào)節(jié)至108-l(Tcell/mL，加入甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)，包裝使用。 由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的擬除蟲菊酯降解菌劑能夠有效降解葉片擬除蟲菊酯殘留。以下通過具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)，但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1 :擬除蟲菊酯降解菌劑制備 1)培養(yǎng)基配制a)LB培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加水至lL，pH 7.0;b)LB培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，加水至1L，pH 7. 0 ;c)種子培養(yǎng)基(液體，1L) :MgS040. 10g，KH2P040. 50g，NaCl 0. 50g，K2HP04l. 50g，蔗糖10g，蛋白胨5g，加水至1L，pH 7.0 ; d)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，1L) :MgS040. 10g，KH2P040. 50g，NaCl 0. 50g，K2HP04l. 50g，蔗糖10g，玉米漿5g，加水至1L，pH 7. 0 ;以上培養(yǎng)基均在12rC滅菌20min。
2)菌株活化挑取擬除蟲菊酯降解菌至LB固態(tài)培養(yǎng)基，2『C連續(xù)劃線挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在LB液態(tài)培養(yǎng)基，于28°C ， 150r/min搖床振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)過夜；
3)液體種子制備向高溫滅菌的種子培養(yǎng)基中，接種擬除蟲菊酯降解菌，于3(TC，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)20h，得到液體種子。 4)液態(tài)發(fā)酵向高壓滅菌的種子培養(yǎng)基中，接種擬除蟲菊酯降解菌，于30°C，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h。 5)培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，調(diào)節(jié)至1(Tcell/mL，加入甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5% )，包裝使用。 實(shí)施例2 :擬除蟲菊酯降解菌劑對(duì)大葉黃楊葉面高效氯氰菊酯降解效果 1)選取未經(jīng)施用高效氯氰菊酯的大葉黃楊，選取兩個(gè)地塊，各15m、噴灑施用量為
3g/畝； 2)6h后，均勻噴施農(nóng)藥降解菌菌劑100mL(109cfu/mL)，以噴施清水作對(duì)照；
3)2d后，五點(diǎn)取樣法檢測大葉黃楊葉面高效氯氰菊酯殘留，發(fā)現(xiàn)處理組較對(duì)照組高效氯氰菊酯殘留量減少76%。 實(shí)施例3 :擬除蟲菊酯降解菌劑對(duì)油菜葉面氟氯氰菊酯降解效果 4)選取未經(jīng)施用氟氯氰菊酯的油菜，選取兩個(gè)地塊，各15!112，噴灑施用量為lg/
畝； 5) 6h后，均勻噴施農(nóng)藥降解菌菌劑lOOmL(109cfu/mL)，以噴施清水作對(duì)照；
6)2d后，五點(diǎn)取樣法檢測油菜葉面氟氯氰菊酯的殘留，發(fā)現(xiàn)處理組較對(duì)照組氟氯
權(quán)利要求
一株能夠高效降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的細(xì)菌，其特征在于該細(xì)菌是一株銅綠假單胞菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No.2699。
2. 權(quán)利要求1所述的多粘類芽孢桿菌，其特征在于在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈深褐色、扁平、不規(guī)則、邊緣鋸齒狀。在LB液體培養(yǎng)基中為墨綠色，無芽孢，革蘭氏染色呈陰性，氧化酶和接觸酶皆為陽性，V. P反應(yīng)為陰性，可水解明膠，能運(yùn)動(dòng)。
3. 用權(quán)利要求1所述細(xì)菌制備擬除蟲菊酯降解菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖和玉米漿為主要營養(yǎng)物質(zhì)，步驟包括培養(yǎng)基配制、菌種活化、液體種子制備、液態(tài)發(fā)酵、菌劑制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株分離自大葉黃楊葉際的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌，及其菌劑制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。經(jīng)鑒定這株菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，并將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.2699。其菌劑的制備方法包括5個(gè)步驟培養(yǎng)基配制、菌種活化、液體種子制備、液態(tài)發(fā)酵、菌劑制備。由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的擬除蟲菊酯降解菌劑能夠有效降解植物葉片表面擬除蟲菊酯，減少農(nóng)藥殘留，保障食品安全，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101724576SQ20081011998
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者唐玲, 莊國強(qiáng), 張洪勛, 白志輝, 荊夢, 谷立坤 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心