專利名稱：利用檸檬酸廢水生產(chǎn)有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物菌劑和廢水資源化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
檸檬酸作為一種重要的化工原料和食品添加劑被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)。目前，中國(guó)有檸檬酸生產(chǎn)廠近百家，總年產(chǎn)能力約80萬噸，是全球最大的檸檬酸生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，出口量在全球檸檬酸貿(mào)易總量中的比重超過60%。檸檬酸的生產(chǎn)是以薯干或玉米為原料，依次經(jīng)原料處理、發(fā)酵、提取、精制等工序制得產(chǎn)品。檸檬酸廢水主要來自發(fā)酵和提取工序產(chǎn)生的中和液、洗糖水、洗罐水和洗濾布水。廢水中主要含有淀粉、蛋白質(zhì)、碳水化合物、各種有機(jī)酸、氨氮和脂肪等，COD濃度為20000 30000mg/L，屬于高濃度有機(jī)廢水。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每生產(chǎn)I噸檸檬酸，產(chǎn)生高濃度廢水7. 5 15噸。直接排放會(huì)對(duì)環(huán)境將造成嚴(yán)重 污染，處理達(dá)標(biāo)排放費(fèi)用高昂。檸檬酸廢水的資源化利用技術(shù)開發(fā)非常緊迫。有機(jī)磷農(nóng)藥以其品種多、藥效高、防治范圍廣譜等特點(diǎn)，至今仍是農(nóng)藥中用量最多的類別，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起到了舉足輕重的作用，我國(guó)有機(jī)磷農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用量占農(nóng)藥總生產(chǎn)和使用量的一半以上。但是，有機(jī)磷農(nóng)藥具有較強(qiáng)的毒性，長(zhǎng)期、大量使用后，其在農(nóng)作物上的殘留會(huì)引起食品安全問題，也影響了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口，而且散落的農(nóng)藥也會(huì)使水和土壤受到污染。利用微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的生物修復(fù)方法具有低成本、無毒、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是最具應(yīng)用前景的削減農(nóng)藥污染的方法之一。中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?00610090054. 7)公開了一株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的施氏假單胞菌，是從農(nóng)藥廠排污口土壤樣品中分離的；中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?00410081019.X)公開了一株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的蒼白桿菌，是從長(zhǎng)期農(nóng)藥污染的土壤中分離獲得。本專利是從油菜葉際分離出的一株高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌，能夠在植物葉際環(huán)境下保持良好的降解性能。以檸檬酸廢水為培養(yǎng)基的主要原料生產(chǎn)農(nóng)藥降解菌劑的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。此方法不僅可以減少高濃度有機(jī)廢水的排放，而且降低菌劑的生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠資源化利用檸檬酸廢水生產(chǎn)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留降解菌劑的方法。本發(fā)明所使用的菌株是由發(fā)明人分離篩選出來的一株高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株，該菌株于2009年11月2日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為=CGMCC No. 3374，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑的生產(chǎn)方法如下I、檸檬酸廢水預(yù)處理用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)廢水的pH到6. 7 7. 8，于115 126°C滅菌10 35分鐘。
2、液體種子制備向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水的三角瓶中接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，于28 45°C，120 200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24 48小時(shí)，得到液體種子。3、液態(tài)發(fā)酵向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水發(fā)酵罐中接種體積比為2% 20%的液體種子，于25 40°C，通無菌空氣培養(yǎng)12-48小時(shí)；培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計(jì)數(shù)，活菌數(shù)達(dá)到5 X IO8CFU/毫升以上。4、固體菌劑制備以過30目篩的生物碳為載體，按照發(fā)酵液生物碳為
I 1.5 5的重量比，將發(fā)酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態(tài)菌劑，通風(fēng)干燥至菌劑含水量30 %以下，包裝，存放在陰涼干燥處。5、液體菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，超濾濃縮，調(diào)節(jié)至有效活菌數(shù)5X 109CFU/mL以上，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的甘氨酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 5%甘油，灌裝保藏；
使用時(shí)用水稀釋50-500倍。
具體實(shí)施例方式由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌微生物菌劑能夠快速降解植物葉面和土壤中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，并且促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，改善農(nóng)田環(huán)境質(zhì)量；而且生產(chǎn)成本低，有效地利用了廢水，減少污染物排放。
具體實(shí)施方式
如下實(shí)施例I :檸檬酸廢水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌微生物菌劑檸檬酸廢水預(yù)處理用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)廢水pH到7. 0，于121°C滅菌15分鐘。液體種子制備向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水的三角瓶中接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，于45°C, 150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)36小時(shí),得到液體種子。液態(tài)發(fā)酵向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水發(fā)酵罐中接種5% (體積比)的液體種子，于32°C，通無菌空氣培養(yǎng)16小時(shí)；培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計(jì)數(shù)，活菌數(shù)達(dá)到
3.5 X IO9CFU/ 毫升。固體菌劑制備以過30目篩的生物碳為載體，按照發(fā)酵液生物碳為I : 3的重量比，將發(fā)酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態(tài)菌劑，通風(fēng)干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處，12個(gè)月內(nèi)使用。液體菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，超濾濃縮，調(diào)節(jié)至有效活菌數(shù)5 X 109CFU/mL以上，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的甘氨酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 5%甘油，灌裝，室溫保藏，6個(gè)月內(nèi)使用。實(shí)施例2 :有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑對(duì)油菜葉面敵敵畏農(nóng)藥殘留的降解效果選取兩個(gè)完全相同的油菜地塊，各30m2，均勻噴灑1000倍稀釋的80%敵敵畏乳油農(nóng)藥。6h后，均勻噴施用清水稀釋600倍的農(nóng)藥降解液體菌劑，以噴施清水作對(duì)照。24h后，五點(diǎn)取樣法檢測(cè)油菜葉面敵敵畏殘留，發(fā)現(xiàn)處理組較對(duì)照組敵敵畏殘留量減少80%左右。實(shí)施例3 :有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑對(duì)土壤中樂果殘留的降解效果選取兩個(gè)完全相同的未種植作物的農(nóng)田地塊，各30m2，均勻噴灑1000倍稀釋的50%樂果乳油農(nóng)藥；6h后，均勻撒入固體農(nóng)藥降解菌劑I公斤，翻耕均勻；36d后，五點(diǎn)取樣法檢測(cè)油菜葉面樂果的殘留，發(fā)現(xiàn)處理組較對(duì)照組樂果殘留量減少50%左右。實(shí)施例4 :枯草芽孢桿菌微生物菌劑促進(jìn)油菜生長(zhǎng)采用蔬菜大棚小區(qū)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置8個(gè)條件完全相同的實(shí)驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)30m2，2個(gè)小區(qū)為I組平行試驗(yàn)，共分成4組，種植油菜，在油菜幼苗期，第I組2個(gè)小區(qū)不施肥作對(duì)照；第2組2個(gè)小區(qū)按照50公斤/畝的用量在 油菜完全發(fā)芽后和3周后各追施枯草芽孢桿菌微生物菌劑一次；第3組2個(gè)小區(qū)按照15公斤/畝的施肥量在油菜完全發(fā)芽后和3周后各施用尿素一次；第4組2個(gè)按照15公斤/畝的施肥量在油菜完全發(fā)芽后和3周后各施用尿素一次，并在每次施用尿素后I天按照50公斤/畝的施肥量追施微生物菌劑一次，各小區(qū)相同的灌溉和管理方式。油菜生長(zhǎng)5周后調(diào)查產(chǎn)量和品質(zhì)。單獨(dú)施用微生物菌劑和單獨(dú)施用尿素的油菜產(chǎn)量基本一致，都比不施肥的對(duì)照小區(qū)增產(chǎn)60%左右；兩種菌劑和尿素都施用的小區(qū)比對(duì)照小區(qū)增產(chǎn)90%左右；油菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量以不施肥和單獨(dú)施用微生物菌劑的最低，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量值的1/3以下，施用尿素后又施用微生物菌劑的也在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量的1/2以下，而單獨(dú)施用尿素的油菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量都超標(biāo)嚴(yán)重。表明該微生物菌劑具有良好的增產(chǎn)效果，而且可以明顯提高油菜的品質(zhì)。本發(fā)明所提供的降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2009年11月2日，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。保藏編號(hào)為CGMCC No. 3374。
權(quán)利要求
1.一種利用檸檬酸廢水生產(chǎn)有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑的方法，其特征在于有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)=CGMCC No. 3374。
2.利用權(quán)利要求I所述有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基以檸檬酸廢水為主要原料，菌劑生產(chǎn)方法及步驟包括 (1)檸檬酸廢水預(yù)處理用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)廢水的PH到6.7 7. 8，于115 126°C滅菌10 35分鐘。
(2)液體種子制備向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水的三角瓶中接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，于28 45°C，120 200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24 48小時(shí)，得到液體種子。
(3)液態(tài)發(fā)酵向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水發(fā)酵罐中接種體積比為2% 20%的液體種子，于25 40°C，通無菌空氣培養(yǎng)12-48小時(shí)；培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計(jì)數(shù)，活菌數(shù)達(dá)到5 X IO8CFU/毫升以上。
(4)固體菌劑制備以過30目篩的生物碳為載體，按照發(fā)酵液生物碳為I: 1.5 5的重量比，將發(fā)酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態(tài)菌劑，通風(fēng)干燥至菌劑含水量30 %以下，包裝，存放在陰涼干燥處。
(5)液體菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，超濾濃縮，調(diào)節(jié)至有效活菌數(shù)5X 109CFU/mL以上，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的甘氨酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 5%甘油，灌裝保藏；使用時(shí)用水稀釋50-500倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用檸檬酸廢水生產(chǎn)有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑的方法，屬于微生物菌劑和廢水資源化技術(shù)領(lǐng)域。該方法主要是以檸檬酸生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的高濃度有機(jī)廢水為主要培養(yǎng)基原料，采用液態(tài)發(fā)酵的方法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.3374菌劑。生產(chǎn)工藝包括(1)檸檬酸廢水pH調(diào)節(jié)和滅菌；(2)接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，振蕩培養(yǎng)獲得液體種子；(3)向裝有檸檬酸廢水培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種液體種子，通無菌空氣培養(yǎng)得到液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物；(4)發(fā)酵產(chǎn)物用生物碳作載體可制備固體菌劑；(5)發(fā)酵液經(jīng)濃縮后添加保護(hù)劑獲得液體菌劑。該工藝生產(chǎn)的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑，具有生產(chǎn)成本低、環(huán)境友好的特點(diǎn)，產(chǎn)品能高效降解植物表面和土壤中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，而且還可以改善土壤環(huán)境質(zhì)量、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)。同時(shí)為檸檬酸生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量高濃度廢水找到有效的資源化利用方法，減少污染物排放。
文檔編號(hào)A62D101/26GK102965293SQ20111025660
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者白志輝, 李濱, 趙志瑞, 唐景春, 馬安周, 王曉輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心