本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多環(huán)芳烴降解菌及其在多環(huán)芳烴降解中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，簡稱PAHs)是一類典型的持久性有機(jī)物，具有高毒性、難降解等特點(diǎn)。PAHs廣泛分布在大氣、土壤、水體、沉積物以及植物等各種環(huán)境介質(zhì)中。PAHs的天然源主要來自于地質(zhì)的成巖作用、森林和草原火災(zāi)、火山爆發(fā)以及陸生和水生植物、微生物旳合成作用等，人為來源主要包括化石燃料和生物質(zhì)的不完全燃燒以及化石燃料自然揮發(fā)或泄漏等過程。國外對多環(huán)芳烴的污染已經(jīng)展開大量研究，我國局部地區(qū)也對此環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)進(jìn)行初步研究。

PAHs污染環(huán)境的主要修復(fù)方法包括物理修復(fù)法、化學(xué)修復(fù)法、焚燒法及生物修復(fù)法。物理修復(fù)法、化學(xué)修復(fù)法及焚燒法均具有處理速度快、治理成本高、對污染體系破壞性大等特點(diǎn)，僅適用于高濃度點(diǎn)源污染的快速處理。生物修復(fù)法成本低、可進(jìn)行原位修復(fù)、對環(huán)境破壞小、適用于低濃度、大面積污染點(diǎn)的治理，成為目前多環(huán)芳烴污染修復(fù)的主要方法。

高分子量的高環(huán)PAHs相比低分子量的低環(huán)PAHs具有更復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)、在水環(huán)境中的溶解度更低的特點(diǎn)。目前已報(bào)道的多環(huán)芳烴降解菌中大部分菌株能夠利用低環(huán)PAHs(萘、菲)作為唯一碳源生長，對4環(huán)以下的多環(huán)芳烴具有一定的轉(zhuǎn)化能力，只有少數(shù)的菌株能夠降解4環(huán)及4環(huán)以上的多環(huán)芳烴。因此，通過篩選4環(huán)及4環(huán)以上的多環(huán)芳烴降解菌對環(huán)境介質(zhì)中存在的高環(huán)多環(huán)芳烴進(jìn)行生物法修復(fù)PAHs污染的環(huán)境介質(zhì)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種多環(huán)芳烴降解菌及其在多環(huán)芳烴降解中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過以下的技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)：

一種多環(huán)芳烴降解菌，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，所述降解菌為紅球菌(Rhodococcus sp.)，屬于革蘭氏陽性菌，所述降解菌的保藏號為CCTCC【M 2016517】。

優(yōu)選地，所述降解菌的基因序列為SEQ ID No.1。

優(yōu)選地，所述多環(huán)芳烴為四環(huán)或四環(huán)以上的多環(huán)芳烴。

優(yōu)選地，所述多環(huán)芳烴為熒蒽。

本發(fā)明還提供了一種細(xì)菌制備物，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，所述細(xì)菌制備物為保藏號為CCTCC【M 2016517】的多環(huán)芳烴降解菌的的無機(jī)鹽培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述多環(huán)芳烴為熒蒽，所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成如下：0.9gKH₂PO₄、6.5g Na₂HPO₄·12H₂O、0.4g(NH₄)₂SO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O及1mL微量元素溶液，補(bǔ)蒸餾水至1000mL；所述微量元素溶液為：1g FeSO₄·7H₂O、1g MnSO₄·H₂O、0.25g Na₂MoO₄·2H₂O、0.1g H₃BO₄、0.25g CuCl₂·2H₂O、0.25g ZnCl₂、0.1g NH₄·VO₃、0.25g Co(NO₃)₂·6H₂O、和0.1g NiSO₄·6H₂O溶于900mL蒸餾水中，再加入5mL濃H₂SO₄，最后補(bǔ)蒸餾水至1000mL。

本發(fā)明另外提供了一種降解多環(huán)芳烴的方法，包括使多環(huán)芳烴與上述的多環(huán)芳烴降解菌、或上述的細(xì)菌制備物接觸的步驟。

優(yōu)選地，所述多環(huán)芳烴為熒蒽，所述熒蒽的濃度為50-300mg/L，降解的溫度為30℃，降解的pH值為7。

本發(fā)明還提供了上述的多環(huán)芳烴降解菌、或上述的細(xì)菌制備物在去除或降解多環(huán)芳烴中的用途。

本發(fā)明還提供了上述的多環(huán)芳烴降解菌、或上述的細(xì)菌制備物在處理含有多環(huán)芳烴的工業(yè)廢水或在多環(huán)芳烴污染的土壤/水體的生物修復(fù)中的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于，本申請的申請人意外篩選出一株能夠降解多環(huán)芳烴的降解菌紅球菌YE-WL-2菌株，且發(fā)現(xiàn)該菌株屬于革蘭氏陽性菌，相對于現(xiàn)有技術(shù)中的革蘭氏陰性菌更加有利于開發(fā)和應(yīng)用。

本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的多環(huán)芳烴降解菌能夠高效降解多環(huán)芳烴，如蒽、菲、芘、蒽酮等多種多環(huán)芳烴，對于多環(huán)芳烴有機(jī)物的去除具有一定的廣譜性。尤其是對于四環(huán)及四環(huán)以上的多環(huán)芳烴，如熒蒽等具有良好的降解效果。而且，本發(fā)明的多環(huán)芳烴降解菌對濃度較高的熒蒽溶液耐受力較強(qiáng)，可耐受高達(dá)300mg/L的熒蒽濃度，并適用于含熒蒽廢水的生物處理。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中不同熒蒽濃度條件下YE-WL-2菌株對熒蒽的降解率變化圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例中不同培養(yǎng)時(shí)間下YE-WL-2菌株對熒蒽的降解率變化圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本實(shí)施例提供了一種多環(huán)芳烴降解菌，所述降解菌為紅球菌(Rhodococcus sp.)YE-WL-2菌株，所述降解菌的保藏號為CCTCC【M 2016517】，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期：2016年9月23日。

該菌株屬于革蘭氏陽性菌，命名為YE-WL-2，菌株的形態(tài)特征為：生長緩慢，菌落較小，LB平板上菌落呈橙紅色，圓形，邊緣齊整。菌株在生長過程中能耐受濃度高達(dá)300mg/L的熒蒽，最適生長條件為：pH7.0，溫度30℃。革蘭氏陽性菌在菌劑制備中，相對于革蘭氏陰性菌能夠更好的成型，更有利于其開發(fā)和應(yīng)用。

進(jìn)一步地，將菌株送至北京金唯智生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，測定基因序列為SEQ ID No.1，將基因序列登錄美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，進(jìn)行核苷酸序列Blast比對，得到與相關(guān)菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，結(jié)果表明YE-WL-2菌株與紅球菌(Rhodococcus sp.)的基因序列的同源性在99％以上，分離菌株被鑒定為紅球菌(Rhodococcus sp.)

本發(fā)明提供的細(xì)菌制備物為上述YE-WL-2菌株的無機(jī)鹽培養(yǎng)基。

以下主要以多環(huán)芳烴為熒蒽為例，說明YE-WL-2菌株對其的降解性能。

本發(fā)明所提供的保藏號為CCTCC【M 2016517】的多環(huán)芳烴降解菌YE-WL-2菌株的培養(yǎng)方法中：無機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成如下：0.9gKH₂PO₄、6.5g Na₂HPO₄·12H₂O、0.4g(NH₄)₂SO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O及1mL微量元素溶液，補(bǔ)蒸餾水至1000mL；所述微量元素溶液為：1g FeSO₄·7H₂O、1g MnSO₄·H₂O、0.25g Na₂MoO₄·2H₂O、0.1g H₃BO₄、0.25g CuCl₂·2H₂O、0.25g ZnCl₂、0.1g NH₄·VO₃、0.25g Co(NO₃)₂·6H₂O、和0.1g NiSO₄·6H₂O溶于900mL蒸餾水中，再加入5mL濃H₂SO₄，最后補(bǔ)蒸餾水至1000mL。

具體地，熒蒽限制性無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基為：將熒蒽溶解于丙酮中，配成母液濃度為50g/L的熒蒽-丙酮溶液，在無菌操作條件下，取適量熒蒽母液于滅菌的三角燒瓶中，待丙酮揮發(fā)后，加入滅菌的上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基，使得熒蒽濃度為50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L。熒蒽限制性無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：將無機(jī)鹽分離培養(yǎng)基中加入瓊脂后滅菌，在無菌操作條件下加入熒蒽母液，使熒蒽濃度為200mg/L，搖勻后倒平板。

在以熒蒽為唯一碳源能源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種紅球菌YE-WL-2，30℃、150rpm培養(yǎng)條件下，7d對50mg/L熒蒽的降解率達(dá)到40.6％，充分說明紅球菌YE-WL-2這種革蘭氏陽性菌對于多環(huán)芳烴的降解效率也能達(dá)到不錯(cuò)的水平，具有非常不錯(cuò)的應(yīng)用前景。

實(shí)施例1：

紅球菌YE-WL-2菌株的分離和鑒定

(一)由于多環(huán)芳烴主要存在于石油、煤中，因此焦化廢水中含有較多的多環(huán)芳烴，本發(fā)明中的紅球菌YE-WL-2菌株采用富集培養(yǎng)法從山西五麟焦化廠好氧池活性污泥中分離得到Y(jié)E-WL-2菌株，具體步驟如下：

(1)配制培養(yǎng)基：將固體熒蒽預(yù)先溶于丙酮中，在無菌操作的條件下，在250mL三角瓶中加入適量熒蒽母液，待丙酮揮發(fā)完全，加入滅菌后的無機(jī)鹽培養(yǎng)基。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方如下：0.9g/L KH₂PO₄，6.5g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.4g/L(NH₄)₂SO₄，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，每1L培養(yǎng)基加入1mL微量元素溶液，(微量元素溶液配制：1g FeSO₄·7H₂O，1g MnSO₄·H₂O，0.25g Na₂MoO₄·2H₂O，0.1g H₃BO₄，0.25g CuCl₂·2H₂O，0.25g ZnCl₂，0.1g NH₄·VO₃，0.25g Co(NO₃)₂·6H₂O，0.1g NiSO₄·6H₂O，溶解于900mL蒸餾水中，加5mL濃H₂SO₄，補(bǔ)蒸餾水至1000mL)。

(2)馴化培養(yǎng)：向100mL滅菌的熒蒽限制性無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中接入5mL山西五麟焦化廠好氧池活性污泥，于30℃、150r/min條件下的搖床中振蕩培養(yǎng)7天，取5mL菌液接種到100mL新培養(yǎng)基中，重復(fù)轉(zhuǎn)接5次。熒蒽起始濃度為50mg/L，以后每次轉(zhuǎn)接熒蒽的濃度增加50mg/L，直到300mg/L為止。

(3)分離純化：馴化培養(yǎng)好的菌液按10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7稀釋，取0.1mL 10^-5稀釋液涂在含有200mg/L熒蒽的無機(jī)鹽培養(yǎng)基瓊脂平板上，30℃倒置培養(yǎng)4-7天，挑取單菌落，進(jìn)行3次劃線分離純化，得到純化的菌株YE-WL-2。

(二)采用基因測序法對紅球菌YE-WL-2菌株進(jìn)行分類鑒定，具體步驟如下：

(1)細(xì)菌總DNA的制備：用天根公司基因組提取試劑盒提取YE-WL-2菌株的基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板。

(2)基因的PCR擴(kuò)增：

使用如下擴(kuò)增引物：

第一引物27F：5’-AgAgTTTgATCMTggCTCAg-3’[M＝C,A]；

第二引物1492R：5’-CggYTACCTTgTTACgACTT-3’[Y＝T,C]。

PCR反應(yīng)體系如表1所示。

表1 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件為：(95℃預(yù)變性5分鐘)-(94℃變性1分鐘-55℃退火30秒-72℃延伸2分鐘)×35個(gè)循環(huán)-(72℃延伸10分鐘)。

(3)PCR產(chǎn)物的純化、克隆、測序和分析：

將PCR產(chǎn)物送至北京金唯智生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，測定16S rRNA基因序列，將基因序列登錄美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，進(jìn)行核苷酸序列Blast比對，得到與相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列同源的若干核苷酸序列，結(jié)果表明YE-WL-2菌株與紅球菌(Rhodococcus sp.)的16S rRNA基因序列的同源性在99％以上，分離菌株被鑒定為紅球菌(Rhodococcus sp.)。

(三)紅球菌YE-WL-2菌株的形態(tài)鑒定特征如下：

YE-WL-2菌株屬于革蘭氏陽性菌類，生長緩慢，菌落較小，LB平板上菌落呈橙紅色，圓形，邊緣齊整。菌株在生長過程中能耐受濃度高達(dá)300mg/L的熒蒽，最適生長條件為：pH7.0，溫度30℃。

實(shí)施例2：

紅球菌YE-WL-2菌株的生理生化特征

(1)、淀粉水解試驗(yàn)

培養(yǎng)基配制：在牛肉膏3g/L、蛋白胨10g//L、NaCl 5g/L組成的肉湯培養(yǎng)基中添加可溶性淀粉，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為0.2％，加入2％的瓊脂，121℃滅菌20min，在無菌操作情況下倒平板待用。魯哥氏碘液：1g碘、2g碘化鉀，先用少量的水將碘化鉀溶解，再加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀釋至300ml。取菌株點(diǎn)接于平板上，30℃培養(yǎng)2～4d，形成菌落后，在平板上滴加魯哥氏碘液，以鋪滿菌落周圍。陽性反應(yīng)(淀粉被水解)為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明圈；陰性反應(yīng)則菌落周圍沒有透明圈。

(2)、V-P實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)基配制：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH7.0～7.2，分裝試管，每管裝4～5ml，121℃滅菌20min。試劑：40％KOH，6％α-萘酚純酒精溶液。

在無菌操作情況下，將試驗(yàn)菌種接種于上述培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)4d，取培養(yǎng)液2.5ml，先加入α-萘酚純酒精溶液0.6ml，再加入40％KOH水溶液0.2ml，搖動2～5min，陽性菌立即變紅，如無紅色出現(xiàn)，靜置于30℃恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。

(3)、甲基紅試驗(yàn)

培養(yǎng)基配制：與V-P試驗(yàn)一致。試劑：甲基紅0.02g，95％酒精60ml，蒸餾水40ml。

在無菌操作情況下，將試驗(yàn)菌接種于上述培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)4d，在培養(yǎng)液中滴加幾滴甲基紅，若培養(yǎng)基變紅色，則為陽性，若培養(yǎng)基為黃色，為陰性。

(4)、明膠水解試驗(yàn)

培養(yǎng)基配制：蛋白胨0.5g，明膠12g，蒸餾水100ml，pH：7.2～7.4。分裝于試管中，每管裝4～5ml，121℃滅菌20min。

在無菌操作情況下，挑取試驗(yàn)菌穿刺接種于明膠高層約2/3深度，于20℃培養(yǎng)7～14d，每天觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高使明膠本身液化應(yīng)不加搖動，靜置冰箱中待凝固后觀察細(xì)菌是否被細(xì)菌液化，如被液化，則明膠水解陽性，否則為陰性。

(5)、Tween 80水解試驗(yàn)

培養(yǎng)基配制：蛋白胨1g，NaCl 0.5g，CaCl2 0.01g，瓊脂1.5g，蒸餾水100ml。121℃滅菌20min，冷卻至50℃，加入Tween 80使其終濃度為1％，倒平板備用。在無菌操作情況下，挑取試驗(yàn)菌點(diǎn)接于上述平板上，35℃培養(yǎng)2～4d，菌落周圍有白色暈圈為陽性，否則為陰性。

(6)、過氧化氫酶活性

在干凈載玻片上滴加1滴3％H₂O₂，用接種環(huán)挑取試驗(yàn)菌1環(huán)，在H₂O₂中涂抹，若有氣泡產(chǎn)生為陽性，否則為陰性。

表2 YE-WL-2菌株生理生化特征

+：陽性反應(yīng)；-陰性反應(yīng)

實(shí)施例3：

紅球菌YE-WL-2菌株對不同濃度的熒蒽的降解率測定

在pH7.0，溫度30℃，熒蒽初始濃度分別為50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L的條件下，將YE-WL-2菌株的培養(yǎng)物接種于100mL上述以熒蒽為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，150r/min振蕩培養(yǎng)7d后用以等體積乙酸乙酯萃取，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，用甲醇定容后利用高效液相色譜法測定樣品中殘留熒蒽的含量，計(jì)算降解率。以熒蒽初始濃度為橫坐標(biāo)，以熒蒽降解率為縱坐標(biāo)繪制柱形圖，結(jié)果示于圖1。

由圖可見，隨著熒蒽濃度的增加，YE-WL-2菌株對熒蒽的降解率在降低，培養(yǎng)7天，對50mg/L的熒蒽的降解率達(dá)40.6％，明顯優(yōu)于現(xiàn)有其他革蘭氏陽性菌類的降解率，說明了YE-WL-2菌株對pHAs的降解能力，尤其是針對四環(huán)以及四環(huán)以上多環(huán)芳烴具有良好的降解能力。而且，從圖中可以看出，YE-WL-2菌株還能夠耐受濃度高達(dá)300mg/L的熒蒽。另外，革蘭氏陽性菌相對于革蘭氏陰性菌能夠更好成型，更有利于其開發(fā)和應(yīng)用。

實(shí)施例4：

紅球菌YE-WL-2菌株對熒蒽的降解曲線測定

將紅球菌YE-WL-2菌株的培養(yǎng)物接種于100mL的上述以熒蒽為碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH為7.0，熒蒽初始濃度為50mg/L，于30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)，每隔7d取樣，用高效液相色譜測定樣品中殘留熒蒽含量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，熒蒽殘留濃度為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖，結(jié)果見圖2。

由圖可見，熒蒽初始濃度為50mg/L時(shí)，YE-WL-2菌株可在7d內(nèi)將培養(yǎng)基中熒蒽降解40％以上，培養(yǎng)14d對熒蒽的降解率達(dá)50％以上，培養(yǎng)21d對熒蒽的降解率達(dá)60％以上，同樣說明菌株對于熒蒽有很好的降解效果。

實(shí)施例5：

紅球菌YE-WL-2菌株對不同pHAs有機(jī)物為唯一碳源的生長情況

紅球菌YE-WL-2在不同底物中培養(yǎng)后測定的生長情況如表3所示，該菌除了能夠在熒蒽培養(yǎng)基中生長外，還可以在萘、菲、芘、蒽的瓊脂培養(yǎng)基中生長，說明該菌對PAHs有機(jī)物的去除具有一定的廣譜性，對各種pHAs都能起到良好的降解作用。

表3 YE-WL-2菌株在不同PAHs有機(jī)物培養(yǎng)基中的生長情況

“+”為有菌落生長，“++”為菌落生長較旺盛，“-”為無菌落生長

實(shí)施例6：

紅球菌YE-WL-2菌株對不同pHAs廢水的降解效果

將紅球菌YE-WL-2菌株的培養(yǎng)物接種于100mL的上述以不同PAHs(萘、菲、蒽、芘)為碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH為7.0，各PAHs初始濃度為50mg/L，于30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)，7d后取樣，用高效液相色譜測定樣品中殘留PAHs含量。結(jié)果表明，紅球菌YE-WL-2除了能夠降解模擬熒蒽外，還能夠利用萘、菲、蒽、芘進(jìn)行生長。結(jié)果表明該菌株對萘，菲，蒽，芘的降解率分別為75.56％、69.54％、58.75％、37.23％。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。