本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種氯氰菊酯降解菌菌粉的制備方法及其在土壤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物是人類賴以生存和發(fā)展的重要食品，在自然環(huán)境中易發(fā)生病蟲害，常用農(nóng)藥防治，以提高農(nóng)作物品質(zhì)和產(chǎn)量。但農(nóng)藥的大量使用使作物、土壤及水源受到不同程度污染，嚴(yán)重威脅環(huán)境和食品安全。目前氯氰菊酯以其殺蟲譜廣、高效、低殘留、性質(zhì)穩(wěn)定、安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，在防治農(nóng)業(yè)害蟲方面具有廣泛應(yīng)用；又因其應(yīng)用范圍廣、接觸人群多、有蓄積性等，從而引起農(nóng)殘超標(biāo)、水土污染、人體中毒等現(xiàn)象頻發(fā)。由于氯氰菊酯理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，具有耐光、熱分解，且殘留范圍廣，傳統(tǒng)物理化學(xué)方法處理難度大、成本高。與其他方法相比，微生物降解具有降解速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。
我國(guó)耕地自然環(huán)境復(fù)雜，污染程度差異較大。利用土著微生物，降解速度慢，降解能力不穩(wěn)定，不能滿足實(shí)際要求。因此，篩選適應(yīng)性強(qiáng)，環(huán)境友好的降解菌株是解決上述問題的根本方法。研究可進(jìn)一步豐富廣譜性擬除蟲菊酯降解菌資源庫，為受氯氰菊酯污染農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境的生物修復(fù)及進(jìn)一步保障其食用安全提供菌株資源和理論基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)存在的問題，提供一種氯氰菊酯降解菌菌粉的制備方法及其在土壤中的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種氯氰菊酯降解菌菌粉的制備方法，將氯氰菊酯降解菌接種至種子培養(yǎng)基，于34～40℃振蕩培養(yǎng)12～36h，再轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基在，于34～40℃振蕩發(fā)酵培養(yǎng)48～72h，置于-20～-80℃冷凍處理1～8h，再于78～85℃水浴處理1～4h，3000～8000rpm離心10～30min，在無菌條件下收集菌泥復(fù)溶于0.8～1.5％NaCl溶液中，進(jìn)行二次離心，3000～5000rpm離心10～30min，隨后將得到的二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑按照1:1～5的重量比混合均勻，-38～-42℃真空冷凍干燥后制成含菌量為0.5～2.5×1011CFU/g的菌粉；所述氯氰菊酯降解菌為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)BBCP-017，于2016年8月22日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.12886。
進(jìn)一步的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨0.3～1.5％、酵母浸出粉0.3～1.5％、NaCl 0.3～1.5％、MnSO4 0.01～0.25％，蒸餾水1000mL。
進(jìn)一步的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.5～7.5。
進(jìn)一步的，所述凍干保護(hù)劑配方為：脫脂奶粉5～20％、葡萄糖0.5％～5％、蒸餾水1000mL。
進(jìn)一步的，所述凍干保護(hù)劑pH為6.3～6.8。
本發(fā)明的另一目的是提供一種氯氰菊酯降解菌的菌粉制備方法制備的菌粉。
本發(fā)明的另一目的還提供一種氯氰菊酯降解菌的菌粉在降解土壤中氯氰菊酯的應(yīng)用。
進(jìn)一步的，將菌粉按質(zhì)量體積百分比為0.001％～0.005％的比例復(fù)溶于無菌水或1～15％脫脂奶粉溶液中，再將菌粉懸液按照體積比1～5:100的比例添加至含氯氰菊酯的土壤中。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：
1、本發(fā)明篩選氯氰菊酯降解菌的菌粉溶于無菌水后加入含60mg/L氯氰菊酯的土壤中培養(yǎng)7d后，降解率達(dá)89.03％；說明本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉具有環(huán)境生物修復(fù)的應(yīng)用價(jià)值以及廣闊的應(yīng)用前景，本發(fā)明菌粉制備工藝簡(jiǎn)單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有含活菌數(shù)量高、保質(zhì)期長(zhǎng)、使用簡(jiǎn)單、使用量少等優(yōu)點(diǎn)。
2、菌粉使用方便，操作簡(jiǎn)單，只需要簡(jiǎn)單復(fù)水或者溶解于1～15％的脫脂奶粉溶液中，就可直接使用，不需要連續(xù)擴(kuò)培繁殖傳代，減少不必要的浪費(fèi)；菌粉應(yīng)用于田間土壤中能有效降解體系中的氯氰菊酯，是可應(yīng)用于受氯氰菊酯污染環(huán)境的生物修復(fù)劑；產(chǎn)品性能穩(wěn)定，可在4℃以下冷凍保存，保質(zhì)期長(zhǎng)達(dá)36月；在室溫條件下也可維持18月的發(fā)酵活力；同時(shí)方便運(yùn)輸，適合長(zhǎng)距離配送。
附圖說明
為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖1本發(fā)明是氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1蠟樣芽孢桿菌BBCP-017的分離、純化
②土樣處理：采自長(zhǎng)期施用氯氰菊酯的耕地土壤，經(jīng)自然風(fēng)干
過80目篩備用。
②降解菌的富集馴化：取1.0g土樣加入氯氰菊酯濃度為20mg/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，于37℃振蕩(180rpm)培養(yǎng)24h后，取5％(v/v)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至氯氰菊酯濃度為40mg/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，按照上述操作連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，培養(yǎng)基中氯氰菊酯濃度逐次提高至160mg/L。
③降解菌的篩選純化：馴化后，將菌液(OD600nm＝1.0)進(jìn)行梯度稀釋涂布轉(zhuǎn)接到氯氰菊酯濃度為40mg/L的固體平板上，37℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落于相同的固體平板連續(xù)劃線純化三代，挑選出菌落形態(tài)規(guī)則、生長(zhǎng)速度最快的氯氰菊酯降解菌株BBCP-017；并將其保存于種子斜面，備用。
④氯氰菊酯降解菌株BBCP-017經(jīng)形態(tài)、生理、分子鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)；該菌株已于2016年8月22日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.12886。
⑤上述培養(yǎng)基的配方由以下重量體積比計(jì)的組分組成。基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.05～0.25％，KH2PO4 0.05～0.25％，K2HPO4 0.05～0.25％，MgSO4 0.05～0.25％，NaCl 0.05～0.25％，蒸餾水1000mL，pH6.8～7.5；種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸出粉0.25～1％，NaCl 0.25～1.5％，蒸餾水1000mL，pH 6.5～7.5；固體培養(yǎng)基同液體培養(yǎng)基加入2.0％的瓊脂；121℃滅菌20min。滅菌后在無菌條件下加入一定體積的氯氰菊酯溶液使其為試驗(yàn)所需濃度，混勻備用。
實(shí)施例2蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉的制備
①種子液制備：從實(shí)施例1中保存的種子斜面中挑取蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌落，接種于50mL種子培養(yǎng)基中，初始pH7.0，37℃振蕩(180rpm)培養(yǎng)24h，即為種子液。
②發(fā)酵培養(yǎng)：以5％(v/v)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，錐形瓶裝液量為250mL/500mL，初始pH 7.0，37℃振蕩(180rpm)培養(yǎng)48h，結(jié)束培養(yǎng)。
③集菌體：將發(fā)酵培養(yǎng)液于-40℃冷凍處理4h，取出，再于80℃水浴處理2h，制片經(jīng)孔雀綠染色，鏡檢觀察，芽孢率達(dá)95％以上；以4000rpm離心20min，在無菌條件下，去除發(fā)酵上清液，收集菌泥復(fù)溶于1％NaCl溶液中，4000rpm離心20min，除出上清液，將凍干保護(hù)劑與二次離心菌泥按1:1～5的質(zhì)量比混和均勻，備用。
④真空冷凍干燥：將菌泥混合物于-40℃真空冷凍干燥12h，得到均勻的淡黃色晶體形固體。在無菌密封條件搗碎下制成蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉，置于鋁膜袋中，抽真空得成品。
⑤活化計(jì)數(shù)：取0.100g蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉復(fù)溶于100mL無菌水中，共三組平行，在無菌條件下將復(fù)溶菌粉懸液連續(xù)稀釋5次，每次三個(gè)重復(fù)，使其稀釋倍數(shù)依次為10、1×102、1×103、1×104、1×105，再分別取0.1mL稀釋液于平板中，傾注發(fā)酵培養(yǎng)基混勻于37℃倒置培養(yǎng)16h觀察菌落生長(zhǎng)情況；最終在三組稀釋倍數(shù)為1×105的平板中平均菌落數(shù)依次為52、94、247，即本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉含菌量為0.5～2.5×1011CFU/g。
⑥凍干保護(hù)劑的配方由以下重量體積比計(jì)的組分組成：脫脂奶粉5～20％，葡萄糖0.5％～5％，蒸餾水1000mL，pH 6.3～6.8，115℃滅菌20min。
⑦發(fā)酵培養(yǎng)基的配方由以下重量體積比計(jì)的組分組成：胰蛋白胨0.3～1.5％，酵母浸出粉0.3～1.5％，NaCl 0.3～1.5％，MnSO4 0.01～0.25％，蒸餾水1000mL，pH 6.5～7.5，121℃滅菌20min。
實(shí)施例3蠟樣芽孢桿菌BBCP-017菌粉在耕地土壤中的應(yīng)用
①氯氰菊酯的檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程建立
高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)：試驗(yàn)為每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)準(zhǔn)確稱取5.0g風(fēng)干土壤，加入5mL乙腈，渦輪振蕩器振蕩至均勻后，超聲波(40kHz、100W)輔助提取60min后加入5mL的乙酸乙酯振蕩30s，靜止后取5mL上清液，過凈化柱(無水硫酸鈉∶中性氧化鋁∶活性炭＝2∶1∶1)，用10mL乙酸乙酯淋洗凈化柱，收集有機(jī)相于50℃旋轉(zhuǎn)揮干，1mL乙腈復(fù)溶；0.45μm有機(jī)濾頭過濾，HPLC待測(cè)。
檢測(cè)條件：色譜柱為Inertsil ODS-3(5.0μm，150mm×4.60mm(i.d.))，流動(dòng)相為乙腈-超純水(90∶10，v/v)，流速為1.0mL/min，柱溫為25±2℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，進(jìn)樣量為10μL。
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程：配制濃度為10mg/L的氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)液，上機(jī)進(jìn)樣量依次為1、2、5、10、20、50μL，即質(zhì)量分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5μg；擬合氯氰菊酯質(zhì)量-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程。
實(shí)驗(yàn)中氯氰菊酯降解率計(jì)算公式按下式進(jìn)行：
式中，C為實(shí)驗(yàn)組氯氰菊酯殘留濃度；C0為對(duì)照組中氯氰菊酯殘留濃度。
氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其線性方程為y＝7447784.2852x+12231.1382，其相關(guān)系數(shù)R2為0.9998，表明線性關(guān)系良好。
②田間試驗(yàn)
試驗(yàn)于2016年3月在成都郫縣某農(nóng)作物耕地進(jìn)行，土壤作物為油白菜。土壤理化性質(zhì)經(jīng)測(cè)定為：砂質(zhì)粘土，土壤pH6.78，有機(jī)質(zhì)27.90g/kg，總氮含量122.30mg/kg，總磷含量138.44mg/kg，總鉀含量85.23mg/kg。
在菜園中劃分4塊面積約為10m2的土壤，均用手動(dòng)背式噴霧器噴灑氯氰菊酯濃度為10g/L的原藥液，均勻噴灑，噴灑量為100mL/m2；同時(shí)配制含菌量為1×108CFU/mL的菌粉懸液，選擇兩塊土地作為實(shí)驗(yàn)組均勻噴灑菌粉懸液，噴灑量為100mL/m2。每天定時(shí)采土樣，按5點(diǎn)采樣法，用專用取土工具，所采土樣為耕層0～20cm，土樣混合，混合后的鮮土用四分法留取1kg，裝入聚乙烯塑料袋，標(biāo)記密封；土壤經(jīng)自然風(fēng)干后研磨過篩保存，連續(xù)7d采用HPLC法測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的氯氰菊酯殘留量。
土壤中氯氰菊酯殘留測(cè)定結(jié)果見表1，實(shí)驗(yàn)組土壤中氯氰菊酯殘留濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，且氯氰菊酯的降解率達(dá)89.03％，說明蠟樣芽孢桿菌BBCP-017能有效降解耕地土壤中的氯氰菊酯，對(duì)耕地土壤能起到生物修復(fù)的作用。
表1耕地土壤中氯氰菊酯的殘留量變化
本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會(huì)用理想化或過于正式的含義來解釋。
最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。