本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及前列腺癌相關(guān)基因的表達水平來診斷癌癥并監(jiān)控治療效果的產(chǎn)品應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二，在美國前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤。亞洲前列腺癌的發(fā)病率遠遠低于歐美國家，但近年來呈現(xiàn)上升趨勢，且增長比歐美發(fā)達國家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲以后發(fā)病，95％發(fā)生于60歲以上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長而增加。前列腺癌早期多無任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視，當腫瘤增大壓迫尿道時，又往往與前列腺增生相混淆。在我國約80％的病人首先發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時，病變已達晚期，預后不良。前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測、直腸指檢、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。PSA(ProstateSpecificAntigen)為前列腺組織特異性抗原，由前列腺的解剖結(jié)構(gòu)可知PSA通過前列腺導管進入血液和尿液中，一些病例或生理情況下PSA會進入血液中去，如前列腺炎癥、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通過檢測血清PSA水平來預測前列腺癌具有一定的假陽性率。從1991年開始，檢測血清中PSA含量用于預測前列腺癌，含量高于4ng/mL認為是前列腺癌陽性，靈敏度79％，特異性20％-59％，平均靈敏度約33％，在濃度4-10ng/mL灰區(qū)部分，特異性是最低的，這時往往需要通過侵入性的穿刺活檢進行確定，給患者帶來極大痛苦及精神和經(jīng)濟負擔。所以PSA并不能較好的作為診斷前列腺癌的標志物。直腸指檢是最簡單、最經(jīng)濟實用的方法，主要通過醫(yī)生的食指觸摸前列腺，用以發(fā)現(xiàn)很多無癥狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根治的機會。但以上的方法都存在局限性。例如直腸指檢的局限性主要在4個方面：(1)患者前列腺腫塊不大時，易漏診；(2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期，不易根治；(3)患者直腸有疾患時不能使用此檢測；(4)醫(yī)生經(jīng)驗不足時可能有漏診或者誤診的可能。假基因與正?；蛴邢嗨频男蛄?，但是與正常的基因存在結(jié)構(gòu)上的差異。這些差異包括在不同部位上程度不等的核苷酸缺失或插入，在基因內(nèi)含子和外顯子連接區(qū)發(fā)生序列變化，在編碼序列當中含有終止密碼子，或在轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)出現(xiàn)缺陷等。這些變化使此類基因不能轉(zhuǎn)錄翻譯，或者產(chǎn)生有缺陷的蛋白質(zhì)從而失去原有的生物學功能。長期以來，人們認為假基因是貌似正常、卻沒有功能的“死亡基因”，是基因組進化的“化石記錄”。但是近年來，關(guān)于假基因的討論日益增多，越來越多的試驗證實假基因能夠轉(zhuǎn)錄并且表達。假基因在基因表達調(diào)控、基因組進化等方面發(fā)揮著重要作用。目前，對于中晚期前列腺癌患者，手術(shù)治療的效果差，大多數(shù)采用藥物治療。根據(jù)不同的病情可以采用化學藥物治療、外放射治療、放射性核素內(nèi)放射治療以及各種療法的綜合應(yīng)用等。然而，放化療藥物不僅作用于腫瘤，還可以作用于腫瘤周圍健康的組織，因而在殺傷腫瘤的同時，也給機體帶來了很大的副作用，最終影響對腫瘤的治療效果。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)早期判斷前列腺癌的特異性標志物，并開發(fā)前列腺癌的靶向藥物。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了實現(xiàn)前列腺癌的早期診斷，預后評估，個體化治療，本發(fā)明的目的之一在于提供用于檢測前列腺癌的標記物。本發(fā)明的目的之二在于提供所述的標記物在制備前列腺癌診斷和預后產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之三是在于提供一種前列腺癌診斷或預后評估試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供用于檢測前列腺癌標記物，所述的標記物選自以下PPIEL(NR_003929.2，pseudogene)、RAET1K(NR_024045.1，pseudogene)和/或MBL1P(NR_002724.2，pseudogene)中的一個或多個基因。優(yōu)選地，所述基因在前列腺癌組織中均表達下調(diào)。進一步地，本發(fā)明提供了所述的標記物在制備前列腺癌診斷和預后產(chǎn)品中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述診斷和預后為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復發(fā)監(jiān)控。優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括檢測試劑或試劑盒。優(yōu)選地，所述檢測試劑包括用熒光定量PCR方法、基因芯片或RNA測序檢測待測樣品中上述基因的相對含量來診斷前列腺癌。優(yōu)選地，所述基因芯片包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于上面所述的基因核苷酸的部分或全部序列。優(yōu)選地，所述的基因的相對含量為待測樣品中基因表達水平相比于對照的表達水平。優(yōu)選地，所述待測樣品包括受試者的細胞組織樣品和血液樣品；所述細胞組織樣品為前列腺癌組織樣品；所述前列腺癌組織樣本包括治療前的或治療后的組織樣本；所述對照為癌旁組織樣品；所述癌旁組織為正常組織。優(yōu)選地，所述治療包括施用手術(shù)干涉，化療，放療，藥物治療或其組合。優(yōu)選地，所述的檢測基因的表達水平包括檢測轉(zhuǎn)錄物水平。進一步地，本發(fā)明提供一種前列腺癌診斷或預后評估試劑盒，所述試劑盒包括特異性擴增PPIEL、RAET1K和/或MBL1P中的一組或多組的引物序列。優(yōu)選地，所述引物序列包括：PPIEL：SEQIDNO.1和2；RAET1K：SEQIDNO.3和4；和/或MBL1P：SEQIDNO.5和6。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBRGreen熒光染料。所述試劑盒含有人正常的前列腺組織或細胞的總RNA或DNA。進一步地，本發(fā)明提供一種檢測受試者中存在前列腺癌的體外方法。所述方法包括確定來自受試者第一樣品中一個或多個基因的表達水平以獲得測定值，所述基因選自：PPIEL、RAET1K和/或MBL1P。以及將所述的測定值與參考值相比較，測定值明顯低于參考值表明所述受試者患有前列腺癌。所述的參照水平是正常細胞中上述基因的水平。進一步地，本發(fā)明提供一種評估對受試者的前列腺癌治療效果的體外方法。所述方法包括確定來自受試者的一個或多個基因的相對含量以獲得第一值，所述基因選自：PPIEL、RAET1K和/或MBL1P。對受試者實施癌癥治療，確定在其后由受試者獲得的后續(xù)樣品中，所述的一個或多個相同的基因的相對含量以獲得治療值；和將所述的第一值與所述治療值相比較。評估療效定為治療值高于所述第一值的10％，表明所述治療是有效的，低于或等于10％，說明所述治療是無效的。優(yōu)選地，所述第一和后續(xù)樣品是已知的或被懷疑包含前列腺癌組織或細胞，例如已知的或被懷疑包含循環(huán)前列腺癌細胞(CTC)的血液樣品，或已知的或被懷疑含有前列腺癌細胞的活檢樣品。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一組與前列腺癌相關(guān)的基因，并進一步證實這些基因的表達水平在前列腺癌組織中表達下調(diào)。利用一個或多個基因聯(lián)合檢測前列腺癌不僅能夠快速有效的做到早期檢測、預后評估，其精確度大大提高，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點和重要依據(jù)。附圖說明圖1分別為PPIEL、RAET1K和/或MBL1P在前列腺癌組織和癌旁組織的表達情況。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人對前列腺癌組織樣本及癌旁組織樣本進行高通量測序，通過生物信息學方法進行基因篩選，挑選3個候選基因：PPIEL、RAET1K和MBL1P，現(xiàn)有研究中并沒有關(guān)于上述基因和前列腺癌相關(guān)的報道，進一步，發(fā)明人進行了分子生物學方法驗證，證實了上述基因在前列腺癌細胞中表達下調(diào)。PPIEL(peptidylprolylisomeraseElikepseudogene,肽基脯氨酰異構(gòu)酶E類假基因)位于1號染色體上，是與PPIE基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的假基因。PPIEL在非小細胞肺癌(NSCLC)中表達下調(diào)。RAET1K(retinoicacidearlytranscript1Kpseudogene，維甲酸早期轉(zhuǎn)錄1k假基因)位于6號染色體上。MBL1P(mannosebindinglectin1,pseudogene，甘露糖結(jié)合凝集素1，假基因)，位于第10號染色體上。人類MBL(mannosebindinglectin，甘露糖結(jié)合凝集素)有兩個基因，其中MBL1是偽基因，只有MBL2能夠編碼蛋白質(zhì)。本發(fā)明的所述的基因是在本發(fā)明之前的已知，基本信息可以在Genbank中查到，來源于人類基因組。本發(fā)明還采用RT-PCR方法檢測上述基因在前列腺癌組織和癌旁正常組織的表達，并驗證了上述基因在前列腺癌中表達下調(diào)。本發(fā)明使用的術(shù)語“表達下調(diào)”指對應(yīng)于所表達基因的序列，其中序列量的測量證明，與從正常個體或從通過前列腺癌分期確定與前列腺癌不同的已鑒定疾病狀態(tài)的個體中分離的生物學樣品中的同一基因相比，所述基因在從患前列腺癌或通過前列腺癌分期確定的前列腺癌已鑒定疾病狀態(tài)的個體中分離的生物學樣品中的表達水平降低。根據(jù)本發(fā)明，“表達下調(diào)”是指通過本發(fā)明方法雜交強度測量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表達降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。在本發(fā)明中，“預后”是指癌癥患者在通過手術(shù)、化療、藥物治療或其組合處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過程或結(jié)果。預后可以是通過手術(shù)、化療、藥物治療或其組合處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態(tài)。預后可以通過檢查標志物來評估，所述的標記物選自以下PPIEL、RAET1K和/或MBL1P中的一個或多個基因。預后評估可以這樣進行：根據(jù)標志物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預后是良好還是不良，或者確定良好預后或不良預后的概率。實施例1高通量測序篩選差異表達基因1、取樣取2011年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科手術(shù)中獲得組織標本27例，所有標本均經(jīng)病理學檢查證實，其中癌旁組織樣本8例、前列腺癌標本19例，編號后置-80℃低溫冰箱保存。2、對組織樣本進行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預冷的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標準：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、高通量測序測序平臺為Illumina公司的HiSeq2500高通量測序平臺，進行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測序，測序后我們運用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達分析時，根據(jù)得到的FPKM值，采用國際公認算法EBSeq進行差異篩選。其中，篩選時，LOG2FC>1或<-1，F(xiàn)DR<0.05。為了更好的理解差異表達基因的功能，我們對差異表達基因進行了GeneOntology和信號通路分析，并對差異表達基因進行功能注釋，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻我們篩選了差異表達PPIEL、RAET1K和/或MBL1P基因，上述基因在前列腺癌組織樣本中表達下調(diào)。實施例2RT-PCR驗證前列腺癌組織及癌旁組織中基因表達情況1、材料前列腺癌組織樣本34例及癌旁組織樣本8例取自北京協(xié)和醫(yī)院2011至2015年期間泌尿外科手術(shù)中前列腺癌樣本，對其進行分組及編號。所有樣本均經(jīng)過病理學檢查證實。2、方法2.1對組織樣本進行總RNA提取，同實施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.3Real-TimePCR2.3.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)相對定量分析。2.3.2引物設(shè)計采用在線引物設(shè)計軟件，基因序列參照NCBI：PPIEL(NR_003929.2，pseudogene)、RAET1K(NR_024045.1，pseudogene)和/或MBL1P(NR_002724.2，pseudogene)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如下：表1引物序列操作過程如下：表2RealTime反應(yīng)體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10uM)0.5μL下游引物(10uM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(一)反應(yīng)體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。擴增程序為：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40個循環(huán)。(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增，同時在60-95℃進行融解曲線分析，根據(jù)擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。3、實驗結(jié)果實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較基因在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定，基因在前列腺癌患組織中的表達水平低于癌旁組織中，以上結(jié)果驗證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)的整合分析基因在前列腺癌患者中表達下調(diào)的結(jié)果。具體情況見圖1。實施例3前列腺癌預后評估試劑盒制備基于實施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的用于檢測前列腺癌的試劑盒，所述試劑盒包括特異擴增PPIEL、RAET1K和/或MBL1P中一個或多個基因的引物組如表1所示，具體為：1、試劑盒包括特異性擴增PPIEL和RAET1K；2、試劑盒包括特異性擴增PPIEL、RAET1K和MBL1P。和特異擴增管家基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4；還包括前列腺正常組織cDNA：作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應(yīng)體系使用與檢測樣本cDNA相同量。通過對引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系如表3所示：表3PCR反應(yīng)體系組分加入量SYBRGreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系12.5μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板cDNA2.0μL加入滅菌蒸餾水至25μL最佳反應(yīng)條件為：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40個循環(huán)，72℃10min。實施例4前列腺癌預后評估試劑盒的臨床驗證對北京協(xié)和醫(yī)院自2011年10月至2015年12月間收治的10例泌尿外科手術(shù)中前列腺癌患者組織樣本進行了研究，獲取的手術(shù)組織為前列腺癌組織。利用實施例3所述的兩種試劑盒檢測10例前列腺癌患者組織中的相應(yīng)基因表達的相對含量。治療結(jié)束后再檢測患者前列癌組織中上述基因表達相對含量。判斷標準定為：治療后基因表達相對含量與治療前相比相升高小于10％，判斷為治療無效；治療后基因表達相對含量與治療前相比升高大于或等于10％，判斷為治療有效，相比越高治療效果越好，其評估結(jié)果如表4所示。同時，醫(yī)生根據(jù)臨床癥狀判斷前列腺癌的治療效果，結(jié)果如表4所示。表4實施例3所述的試劑盒評估前列腺癌療效結(jié)果由表4可知，在10例臨床患者中，試劑盒1檢測結(jié)果顯示其中5例有療效，其余5例無治療效果，其中編號為8的患者判斷結(jié)果與臨床結(jié)果有誤；試劑盒2檢測結(jié)果為4例有治療效，其余6例無治療效果，該試劑盒檢測結(jié)果與臨床判斷結(jié)果一致。據(jù)此推斷，試劑盒2比試劑盒1檢測更加精確，本前列腺癌的預后評估試劑盒可以對前列腺癌患者治愈效果進行評估，并以此為臨床提供有用的參考價值。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3