本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種玉米煙嘧磺隆抗感分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米是我國重要的糧食作物之一。目前，我國人均耕地只有0.093公頃，隨著生產(chǎn)糧食的土地和淡水資源的減少，糧食供應(yīng)安全問題日益凸顯。除草劑煙嘧磺隆在玉米的生產(chǎn)中，具有使用最廣，安全最高，用量最少，價格低廉等優(yōu)點，廣受農(nóng)民和育種家的喜愛。近年來發(fā)現(xiàn)，越來越多的玉米自交系和雜交種對煙嘧磺隆敏感，嚴(yán)重影響了正常的玉米育種和生產(chǎn)。

玉米煙嘧磺隆的敏感性受隱性單基因nsfy控制，其抗性受顯性單基因nsfy控制。在傳統(tǒng)育種中篩選玉米煙嘧磺隆抗性材料需要大規(guī)模的田間選擇，工作量大，效率低，難以滿足現(xiàn)在的需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長期研究與探索，提供了一種玉米煙嘧磺隆敏感、抗性的兩個分子標(biāo)記，兩個標(biāo)記的長度分別為為277bp和261bp，都位于玉米5號染色體nsfy基因內(nèi)；通過分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測玉米品種或自交系中是否具有煙嘧磺隆抗性基因，以加快玉米煙嘧磺隆抗性品種的選育進程。由于采用了專用的玉米煙嘧磺隆敏感和抗性的分子標(biāo)記，不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了玉米煙嘧磺隆抗性品種或自交系的選擇效率和質(zhì)量，開發(fā)了實效性分子標(biāo)記，研制玉米煙嘧磺隆感性分子輔助育種體系，可以程序化應(yīng)用于育種實踐。

發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下:

本發(fā)明所獲得的玉米煙嘧磺隆敏感分子標(biāo)記位于玉米煙嘧磺隆敏感基因nsfy內(nèi)；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述；

玉米煙嘧磺隆抗性分子標(biāo)記位于玉米煙嘧磺隆抗性基因nsfy內(nèi)；其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所述；

上述兩個分子標(biāo)記根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中基因nsfy中的SNP位點由本發(fā)明的發(fā)明人首次開發(fā)獲得的；

獲得上述兩個分子標(biāo)記后，可利用該分子標(biāo)記檢測玉米煙嘧磺隆品種或自交系中是否含有煙嘧磺隆抗性的基因nsfy，其具體步驟為：

(1)檢測玉米煙嘧磺隆品種或自交系中是否含有煙嘧磺隆敏感基因nsfy：

利用特異性引物擴增目標(biāo)植株的葉片DNA，獲得295bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，之后利用AvaII專一酶酶切后檢測是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述的片段；

判定標(biāo)準(zhǔn)為：具有玉米煙嘧磺隆敏感的品種或自交系中出現(xiàn)如SEQ ID NO:1所述的277bp的電泳帶；不具有玉米煙嘧磺隆敏感的品種或自交系中該片段不會切除，所以不會出現(xiàn)；

為了配合該分子標(biāo)記，發(fā)明人設(shè)計了其特異性引物，其

正向引物序列：5′-GCGTGCTTCACGGAGCAGGAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)；

反向引物序列：5′-TGAGCACGCCGAGGGAGA-3′(如SEQ ID NO:4所示)。

(2)檢測玉米煙嘧磺隆品種或自交系中是否含有煙嘧磺隆抗性的基因nsfy：

利用特異性引物擴增目標(biāo)植株的葉片DNA，獲得294bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，之后利用BclI專一酶酶切后檢測是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO:5所述的片段；

判定標(biāo)準(zhǔn)為：具有玉米煙嘧磺隆抗性的品種或自交系中出現(xiàn)如SEQ ID NO:5所述的261bp的電泳帶；不具有玉米煙嘧磺隆抗性的品種或自交系中該片段不會切除，所以不會出現(xiàn)；

為了配合該分子標(biāo)記，發(fā)明人設(shè)計了其特異性引物，其

正向引物序列：5′-CGTCGCCTTCCTCTTCTTGG-3′(如SEQ ID NO:7所示)；

反向引物序列：5′-ATGGACTCGAAGCGCGGGCGGTTGGCGATGATC-3′(如SEQ ID NO:8所示)。

通過特異性引物的擴增，以及對產(chǎn)物的酶切結(jié)果進行判定，即可判定該位點是否含有玉米煙嘧磺隆敏感、抗性基因，故而即可獲知待測玉米品種或品系是否具有煙嘧磺隆敏感、抗性表型，從而可以更好的育種并應(yīng)用于品種改良。

綜上所述，本發(fā)明人首次提供了一種玉米煙嘧磺隆抗感分子標(biāo)記，該標(biāo)記位于玉米5號染色體的nsfy基因上；通過該分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測玉米品種或自交系中是否含有玉米煙嘧磺隆敏感、抗性基因，以加快玉米煙嘧磺隆抗性品種的選育進程，由于采用了專用的煙嘧磺隆敏感、抗性分子標(biāo)記，不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了玉米煙嘧磺隆抗性品種或品系的選擇效率和質(zhì)量。

附圖說明

圖1為利用本發(fā)明所述的分子標(biāo)記和判定方法對玉米煙嘧磺隆敏感自交系和玉米煙嘧磺隆抗性自交系的酶切驗證結(jié)果電泳灰度圖，

圖中可知，玉米煙嘧磺隆敏感自交系經(jīng)過酶切后出現(xiàn)了277bp的電泳帶，而玉米煙嘧磺隆抗性自交系則沒有出現(xiàn)；

圖2為利用本發(fā)明所述的分子標(biāo)記和判定方法對玉米煙嘧磺隆敏感自交系和玉米煙嘧磺隆抗性自交系的酶切驗證結(jié)果電泳灰度圖，

圖中可知，玉米煙嘧磺隆抗性自交系經(jīng)過酶切后出現(xiàn)了261bp的電泳帶，而玉米煙嘧磺隆敏感自交系則沒有出現(xiàn)。

具體實施方式

以下實施例中進一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；

實施例1玉米煙嘧磺隆抗性相關(guān)分子標(biāo)記的應(yīng)用

1.玉米的葉片DNA提取

采用常規(guī)技術(shù)提取玉米葉片DNA；

2.目標(biāo)產(chǎn)物擴增

正向引物序列：5′-CGTCGCCTTCCTCTTCTTGG-3′(如SEQ ID NO:7所示)；反向引物序列：5′-ATGGACTCGAAGCGCGGGCGGTTGGCGATGATC-3′(如SEQ ID NO:8所示)。

PCR擴增：其PCR擴增體系為20μL

擴增條件：

通過上述擴增即可獲得294bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

PCR產(chǎn)物專一酶切：

酶切體系10μL:

專一酶BclI：0.3μL

PCR產(chǎn)物：3μL

10×NE buffer:0.7μL

DdH₂O:6μL

酶切反應(yīng)條件：PCR擴增產(chǎn)物中添加0.3μL BclI專一酶(市場購得)，50℃水浴2h。然后將酶切體系放置65℃5min；

將上述擴增產(chǎn)物分別在8％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，擴增產(chǎn)物分子量大小為294bp，擴增產(chǎn)物酶切后，具有煙嘧磺隆抗性基因nsfy的品種或自交系中出現(xiàn)如SEQ ID NO:5所述的261bp的電泳帶；不具有煙嘧磺隆抗性基因nsfy的品種或自交系中該片段未被切掉，無該片段；如圖2所示。

實施例2玉米煙嘧磺隆敏感相關(guān)分子標(biāo)記的應(yīng)用

1.玉米的葉片DNA提取，

采用常規(guī)技術(shù)提取玉米葉片DNA；葉片分別來源于玉米煙嘧磺隆抗性自交系和玉米煙嘧磺隆敏感自交系；

2.目標(biāo)產(chǎn)物擴增

正向引物序列：5′-GCGTGCTTCACGGAGCAGGAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)；反向引物序列：5′-TGAGCACGCCGAGGGAGA-3′(如SEQ ID NO:4所示)。

PCR擴增：其PCR擴增體系為20μL

擴增條件：

通過上述擴增即可獲得295bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

PCR產(chǎn)物專一酶切：

酶切體系10μL:

專一酶AvaII：0.3μL

PCR產(chǎn)物：3μL

10×NE buffer:0.7μL

DdH₂O:6μL

酶切反應(yīng)條件：PCR擴增產(chǎn)物中添加0.3μL AvaII專一酶(市場購得)，37℃水浴2h。然后將酶切體系放置65℃5min。

將上述擴增產(chǎn)物分別在8％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，擴增產(chǎn)物分子量大小為295bp，擴增產(chǎn)物酶切后，具有煙嘧磺隆敏感基因nsfy的品種或品系中出現(xiàn)如SEQ ID NO:1所述的277bp的電泳帶；不具有煙嘧磺隆敏感基因nsfy的品種或品系中該片段未被切掉，無該片段；如圖1所示。