本發(fā)明屬于作物品種抗病性評價(jià)及時(shí)領(lǐng)域，具體涉及一種用于芝麻的枯萎病抗性鑒定評價(jià)方法。

背景技術(shù)：

芝麻是我國重要的特色油料作物。芝麻枯萎病主要是由尖孢鐮刀菌芝麻?；停?i>fusariumoxysporumf.sp.sesami，fos）引起的，也是世界性芝麻病害。與莖點(diǎn)枯病并稱為芝麻生產(chǎn)中的兩大真菌病害。芝麻枯萎病常年發(fā)病率在15%左右，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)30%以上，對產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大。

近年來，為檢測尖孢鐮刀菌芝麻?；偷闹虏×Γu價(jià)芝麻種質(zhì)對枯萎病菌的抗性水平，河南省農(nóng)科院芝麻研究中心采用種子接菌方法，首次建立了芝麻枯萎病菌致病力的室內(nèi)評價(jià)體系（仇存璞等，2014），為芝麻病害研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。該方法采用基質(zhì)拌菌，對芝麻萌發(fā)的種子進(jìn)行人工接菌處理，可以客觀評價(jià)種子萌發(fā)至2對真葉時(shí)期芝麻抗枯萎病特性以及fos病菌致病力水平。

研究也發(fā)現(xiàn)，采用種子接菌方法檢測芝麻種質(zhì)的抗病性仍存在一定缺陷。利用該方法處理芝麻種子后，芝麻抗病水平在接種4周后（即芝麻栽培品種兩對真葉時(shí)期）趨于穩(wěn)定，不利于芝麻病癥的進(jìn)一步觀察；對于一些強(qiáng)致病力fos菌株，大多數(shù)芝麻材料在子葉期就會全部死亡，致使枯萎病害癥狀表現(xiàn)不完全，并在一定程度上影響了病原菌致病過程觀察以及芝麻抗病、應(yīng)答過程監(jiān)測。因此，目前迫切需要建立一種新型的芝麻枯萎病抗性室內(nèi)鑒定評價(jià)方法，在一定程度上替代大田病圃檢測方法，探明芝麻在不同發(fā)育時(shí)期對枯萎病菌的抗性特征，同時(shí)通過評價(jià)尖孢鐮刀菌芝麻專化型病菌對不同發(fā)育時(shí)期芝麻植株的侵染特點(diǎn)，最終為有效防控芝麻枯萎病害提供理論和技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

利用浸根接菌法，本發(fā)明目的在于提供一種較為通用的快速準(zhǔn)確鑒定、評價(jià)芝麻枯萎病抗性的方法，從而為抗枯萎病芝麻種質(zhì)篩選、致病菌株致病力鑒定及芝麻枯萎病防治等研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種鑒定評價(jià)芝麻枯萎病抗性水平的方法，具體包括如下步驟：

（1）準(zhǔn)備芝麻植株

根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，挑選適量待測芝麻品種健康成熟種子，滅菌處理后，25℃~28℃、100~120rpm條件下振蕩培養(yǎng)至種子露白；

所述滅菌處理具體程序例如為：先用70%酒精處理30s，再3%的次氯酸鈉處理10~15min，最后無菌水沖洗3~5次；

將露白后芝麻種子播種于盛有無菌蛭石的容器中，所述容器例如容量為250ml的紙杯，每個(gè)紙杯中可播種10粒；

定期用改良hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行澆灌，人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25~28℃、相對濕度為60~80%、每天15h/9h光暗交替；培育1~2個(gè)月后可用于接菌處理（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及要求，芝麻植株為2對真葉期至現(xiàn)蕾期中某一生長階段）；

所述改良hoagland營養(yǎng)液配方為：四水硝酸鈣945mg/l、硝酸鉀506mg/l、硝酸銨80mg/l、磷酸二氫鉀136mg/l、硫酸鎂493mg/l、鐵鹽溶液2.5ml和微量元素液5ml，ph=6.0；

鐵鹽溶液：七水硫酸亞鐵2.78g和乙二胺四乙酸二鈉（edta-na）3.73g，蒸餾水500ml，ph=5.5；

微量元素液：碘化鉀0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸錳22.3mg/l、硫酸鋅8.6mg/l、鉬酸鈉0.25mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l；

（2）制備浸染用分生孢子懸浮液

根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，挑選測試尖孢鐮刀菌芝麻?；途?，用接種針挑取少量固體保存的菌落（通常-20℃保存）接入300ml的pdb液體培養(yǎng)基中，28℃、160~180rpm振蕩培養(yǎng)2~3d；

然后用無菌醫(yī)用紗布過濾，在濾液中加入無菌水稀釋，調(diào)整懸浮液中孢子數(shù)為：1×10⁶cfu/ml~1×10⁷cfu/ml；

所述pdb液體培養(yǎng)基，每1000ml蒸餾水中含：馬鈴薯200g，葡萄糖20g；

（3）浸根接菌

選擇步驟（1）中生長健壯一致的芝麻植株，洗去根部粘帶的蛭石，并用吸水紙快速吸去根部水分；

將芝麻植株根系全部浸入步驟（2）所制備分生孢子懸浮液中10~30min；

將接菌后植株重新栽入蛭石中，放入人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，25-28℃、相對濕度為60-80%、每天15h/9h光暗交替條件下培養(yǎng)；期間定期澆灌改良hoagland營養(yǎng)液，保證植株生長需要的營養(yǎng)；

以清水浸泡同等時(shí)間的芝麻幼苗作為不接菌陰性對照，相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)；

（4）芝麻品種枯萎病抗性鑒定評價(jià)，

對步驟（3）中接菌后芝麻植株的枯萎病發(fā)病情況進(jìn)行定期調(diào)查，記錄發(fā)病株數(shù)及發(fā)病等級，計(jì)算枯萎病病情指數(shù)，并據(jù)此判定芝麻品種枯萎病抗性能力，或者對特定菌株（步驟（2）中所挑選菌株）的對芝麻的枯萎病致病能力進(jìn)行判定；

枯萎病病情指數(shù)計(jì)算公式為：病情指數(shù)＝σ（發(fā)病等級×相應(yīng)發(fā)病株數(shù)）/總株數(shù)；

所述芝麻枯萎病發(fā)生等級劃分標(biāo)準(zhǔn)為：

0級：長勢良好無病癥，地上部莖葉正常，根莖部維管束正常；

i級：病株莖葉萎蔫或半邊黃，根莖部維管束紅褐色；

ii級：病株葉片干枯至全株死亡；

芝麻品種的抗病性水平等級劃分為五級（參考仇存璞等2014年在《植物病理學(xué)報(bào)》的《芝麻枯萎病病原菌致病力室內(nèi)鑒定方法》論文進(jìn)行設(shè)定）：

第一等級：高抗病，平均病指0~15；

第二等級：抗病，平均病指15.1~30；

第三等級：中抗，平均病指30.1~55；

第四等級：感病，平均病指55.1~70；

第五等級：高感，平均病指70.1~100；

fos菌株致病力等級劃分為四級（參考仇存璞等2014年在《植物病理學(xué)報(bào)》的《芝麻枯萎病病原菌致病力室內(nèi)鑒定方法》論文進(jìn)行設(shè)定）:

0級：無致病力，平均病指為0；

1級：弱致病力，平均病指0.1~20；

2級：中等致病力，平均病指20.1~35；

3級：強(qiáng)致病力，平均病指35.1~100。

為避免接菌處理過程中芝麻植株根部受損，進(jìn)而影響到植株抗病水平的鑒定，本申請首先對芝麻植株培育體系進(jìn)行了優(yōu)化，采用質(zhì)地松散的純蛭石做為培養(yǎng)基質(zhì)，設(shè)計(jì)特定改良的hoagland營養(yǎng)液作為澆灌材料，保證了芝麻植株正常營養(yǎng)供給，同時(shí)較好兼顧了芝麻植株接菌處理的便捷性，為芝麻抗病能力或者菌株致病力判定奠定了良好基礎(chǔ)。

本申請以較為成熟的浸根感染法為基礎(chǔ)，可對不同生長階段的芝麻植株（2對真葉至現(xiàn)蕾期）進(jìn)行接種。同時(shí)，由于接種用的枯萎病菌株濃度易于調(diào)整，因而詳細(xì)分析病菌對芝麻幼苗的侵染過程及芝麻幼苗的應(yīng)答過程，能夠準(zhǔn)確鑒定和評價(jià)不同芝麻種質(zhì)的抗病性以及不同菌株的致病力，為有效防控芝麻枯萎病提供了技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他作物病害的防治提供了較好地參考借鑒。

總體而言，本申請具有較好的可重復(fù)性，鑒定結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠較為準(zhǔn)確的反映尖孢鐮刀菌株與芝麻測試品種的互作關(guān)系，可為枯萎病菌侵染芝麻過程分析、枯萎病菌防治藥劑篩選等研究奠定良好的理論基礎(chǔ)，具有較好的科研應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1尖孢鐮刀菌株hsfo08027不同濃度菌液浸根處理后芝麻發(fā)病情況；其中：a：豫芝11號在接種1×10⁶cfu/ml（中）和5×10⁶cfu/ml濃度菌液（右）后第10天發(fā)病情況和清水對照（左）；b：y11-m9956在接種1×10⁶cfu/ml（中）和5×10⁶cfu/ml濃度菌液（右）后第10天發(fā)病情況和清水對照（左）；c：豫芝11號在接種1×10⁶cfu/ml（中）和5×10⁶cfu/ml濃度菌液（右）后第14天發(fā)病情況和清水對照（左）；d：y11-m9956在接種1×10⁶cfu/ml（中）和5×10⁶cfu/ml濃度菌液（右）后第14天發(fā)病情況和清水對照（左）；

圖2尖孢鐮刀菌hsfo15110菌液浸根處理后的芝麻發(fā)病情況（第14天）；其中：a：y11-m9956接菌處理（右）及陰性對照（左）；b：豫芝11號接菌處理（右）及陰性對照（左）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本申請做進(jìn)一步解釋說明，在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中部分實(shí)驗(yàn)背景情況簡要介紹如下。

生物材料：

芝麻品種：豫芝11號、y11-m9956（豫芝11號為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心選育的芝麻栽培品種，y11-m9956為芝麻種質(zhì)資源），均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心種質(zhì)資源庫保存并提供；

病原菌株：hsfo08027、hsfo15050、hsfo15098、hsfo15099、hsfo15100和hsfo15110共6個(gè)尖孢鐮刀菌芝麻?；停╢os）菌株，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心病理室分離鑒定，保存于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心芝麻枯萎病菌庫。

實(shí)施例1

本實(shí)施例以豫芝11號、y11-m9956為例，對這兩個(gè)品種（系）的枯萎病抗性進(jìn)行了初步鑒定，具體過程簡要介紹如下。

（1）準(zhǔn)備芝麻植株

分別挑取豫芝11號和y11-m9956兩個(gè)芝麻品種（系）的飽滿種子各100粒，滅菌處理，然后28℃、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)至種子露白；

所述滅菌處理具體程序?yàn)椋合扔?0%酒精處理30s，再3%的次氯酸鈉處理10min，最后無菌水沖洗3~5次；

將露白種子播于裝有無菌蛭石的紙杯中，每個(gè)紙杯中可播種10粒；

每3天澆灌1次改良hoagland營養(yǎng)液，人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25-28℃、相對濕度為60-80%、每天15h/9h光暗交替，20d后用于抗枯萎病水平鑒定。

所述改良hoagland營養(yǎng)液配方為：四水硝酸鈣945mg/l、硝酸鉀506mg/l、硝酸銨80mg/l、磷酸二氫鉀136mg/l、硫酸鎂493mg/l、鐵鹽溶液2.5ml和微量元素液5ml，ph=6.0；

鐵鹽溶液：七水硫酸亞鐵2.78g和乙二胺四乙酸二鈉（edta-na）3.73g，蒸餾水500ml，ph=5.5；

微量元素液：碘化鉀0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸錳22.3mg/l、硫酸鋅8.6mg/l、鉬酸鈉0.25mg/l、硫酸銅0.025mg/l、氯化鈷0.025mg/l。

（2）制備浸染用分生孢子懸浮液

挑選強(qiáng)制病力的尖孢鐮刀菌芝麻?；停╢os）標(biāo)準(zhǔn)菌株hsfo08027，挑取少量菌塊（-20℃保存）接入300ml的pdb液體培養(yǎng)基中，28℃、160rpm振蕩培養(yǎng)3d；

然后用無菌醫(yī)用紗布過濾，在濾液中加入無菌水稀釋，調(diào)整懸浮液中孢子數(shù)分別為：1×10⁶cfu/ml和5×10⁶cfu/ml；以便對不同濃度菌株的致病力加以區(qū)分；

所述pdb液體培養(yǎng)基，每1000ml蒸餾水中含：馬鈴薯200g，葡萄糖20g。

（3）浸根接菌

選擇步驟（1）中生長健壯一致的芝麻植株，洗去根部粘帶的蛭石，并用吸水紙快速吸去根部水分；

將芝麻植株分為兩組，將其根系分別完全浸入步驟（2）配制的1×10⁶cfu/ml和5×10⁶cfu/ml分生孢子懸浮液中，浸泡15min；

浸泡結(jié)束后，再分別栽入無菌蛭石中，每個(gè)營養(yǎng)缽中可栽種植株5株，25℃、相對濕度為80%、每天15h/9h光暗交替繼續(xù)培養(yǎng)；

每3天澆灌改良hoagland營養(yǎng)液1次，保證植株生長需要的營養(yǎng)和水分；

相同操作，以清水浸泡同等時(shí)間的芝麻幼苗作為不接菌陰性對照，相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

（4）芝麻品種枯萎病抗性鑒定評價(jià)，

對步驟（3）中接菌后芝麻幼苗枯萎病發(fā)病情況進(jìn)行定期調(diào)查，記錄發(fā)病株數(shù)及發(fā)病等級，計(jì)算枯萎病病情指數(shù)，并據(jù)此判定芝麻品種枯萎病抗性能力，或者對特定菌株的對芝麻的枯萎病致病能力進(jìn)行判定；

枯萎病病情指數(shù)計(jì)算公式為：病情指數(shù)＝σ（發(fā)病等級×相應(yīng)發(fā)病株數(shù)）/總株數(shù)；

所述芝麻枯萎病等級劃分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：

0級：長勢良好無病癥，地上部莖葉正常，根莖部維管束正常；

i級：病株莖葉萎蔫或半邊黃，根莖部維管束紅褐色；

ii級：病株葉片干枯至全株死亡。

芝麻品種的抗病性水平等級劃分為五級（參照仇存璞等2014論文）：

第一等級：高抗病，平均病指0~15；

第二等級：抗病，平均病指15.1~30；

第三等級：中抗，平均病指30.1~55；

第四等級：感病，平均病指55.1~70；

第五等級：高感，平均病指70.1~100；

fos菌株致病力等級劃分為四級（參照仇存璞等2014論文）：

0級：無致病力，平均病指為0；

1級：弱致病力，平均病指0.1~20；

2級：中等致病力，平均病指20.1~35；

3級：強(qiáng)致病力，平均病指35.1~100。

分別在接菌后第7、14、21d調(diào)查每個(gè)處理中芝麻植株的生長和發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)，具體結(jié)果如下表1所示。

表1：不同濃度hsfo08027菌株處理后的芝麻枯萎病情指數(shù)變化

。

從上表結(jié)果可以看出，在1×10⁶cfu/ml和5×10⁶cfu/ml接菌濃度條件下，hsfo08027菌株均可侵染豫芝11號及y11-m9956，并導(dǎo)致植株發(fā)?。ㄈ鐖D2）。結(jié)果證實(shí)了hsfo08027確實(shí)為強(qiáng)致病力芝麻枯萎病菌株，與以往研究結(jié)果一致。

根據(jù)上述芝麻種質(zhì)的枯萎病抗性水平等級劃分標(biāo)準(zhǔn)和病情指數(shù)結(jié)果，我們也可以看出，相對hsfo08027菌株，在1×10⁶cfu/ml接菌濃度下，豫芝11號和y11-m9956均為高感枯萎病品種（系）。從接菌后第7天到14天，兩個(gè)測試材料的病情指數(shù)均呈逐步上升趨勢，且2品種（系）間的病情指數(shù)差異不大。植株發(fā)病表現(xiàn)如圖1。該結(jié)果也為以后接菌濃度提供了依據(jù)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例以5株尖孢鐮刀菌芝麻?；停╢os）菌株（hsfo15050、hsfo15098、hsfo15099、hsfo15100和hsfo15110）為例，分別對其芝麻的致病力進(jìn)行了評價(jià)，具體實(shí)驗(yàn)過程簡要介紹如下。

（1）準(zhǔn)備芝麻植株

分別選取豫芝11號和y11-m9956兩個(gè)芝麻品種（系）的種子進(jìn)行致病力評價(jià)，具體芝麻材料培養(yǎng)種植過程同實(shí)施例1。

（2）制備浸染用分生孢子懸浮液

針對不同的尖孢鐮刀菌芝麻?；停╢os）菌株（hsfo15050、hsfo15098、hsfo15099、hsfo15100和hsfo15110），分生孢子懸浮液的制備過程同實(shí)施例1，發(fā)酵完成后，將不同菌株的分生孢子懸浮液中菌體數(shù)分別調(diào)整為1×10⁶cfu/ml。

（3）浸根接菌

將待測的豫芝11號和y11-m9956的芝麻植株分別浸入步驟（2）中所制備分生孢子懸浮液中，浸泡15min；具體操作同實(shí)施例1。

（4）芝麻品種枯萎病抗性鑒定評價(jià)，即對不同菌株的致病力進(jìn)行評價(jià)。

接菌后分別在接菌后第7、14、21和28d調(diào)查每缽芝麻植株的生長和發(fā)病情況，調(diào)查結(jié)果見表2。

表2不同fos病菌處理后的芝麻病情指數(shù)變化：

。

對上表分析可以看出，在1×10⁶cfu/ml接菌濃度條件下，上述5個(gè)菌株對豫芝11號和y11-m9956的致病力表現(xiàn)不盡相同。例如，在接菌后第28d時(shí)，hsfo15050處理下，豫芝11號和y11-m9956的病情指數(shù)均為100，表現(xiàn)為強(qiáng)致病力水平。在hsfo15099菌株處理下，豫芝11號和y11-m9956的病情指數(shù)分別為17.78和23.33，屬于弱-中等致病力水平。同一品種對不同菌株的抗性水平也有差異。豫芝11號對于上述5個(gè)菌株的抗性水平為高感-抗病，y11-m9956的抗性水平為高感-高抗。此外，數(shù)據(jù)還顯示了接菌處理7-28天芝麻抗病水平的變化情況，對芝麻抗病特征特性研究有積極的作用。部分處理植株表現(xiàn)如圖2。