專利名稱：Ints6基因小激活rna在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及靶向上調(diào)INTS6基因的小激活RNA在制備抗前列腺癌，提別是激素非依賴性前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
前列腺癌正嚴(yán)重威脅著我國(guó)50歲以上男性的健康。內(nèi)分泌治療是臨床上治療前列腺癌的常用方法。但是絕大多數(shù)前列腺癌患者在內(nèi)分泌治療f 2年內(nèi)病情出現(xiàn)進(jìn)展，繼續(xù)應(yīng)用內(nèi)分泌治療藥物，并不能控制病情發(fā)展。前列腺癌細(xì)胞由激素依賴轉(zhuǎn)變?yōu)榧に胤且馈①?，是前列腺癌?nèi)分泌治療失敗、患者死亡最主要的原因。2006年Li等報(bào)道靶向基因啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA (雙鏈RNA, double-strandedRNA)能引起序列特異性的基因轉(zhuǎn)錄激活。并把此現(xiàn)象命名為RNA引起的基因激活(RNA activation, RNAa),而把這樣的 dsRNA 稱為小激活 RNAs (small activatingRNAS, saRNAs)。該項(xiàng)技木通過(guò)改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致內(nèi)源性靶基因表達(dá)增強(qiáng)。它能激活許多失活的抑癌基因或増加活性較低的基因的表達(dá)量，從而起到治療腫瘤的作用。INTS6 是一種抑癌基因，全稱 Integrator complex subunit 6 gene, 1999 年由 IWieland和Zhengnan Yin兩個(gè)團(tuán)隊(duì)同時(shí)報(bào)道,在《Oncogene》雜志的同一期刊登。INTS6定位于人類染色體13ql4. 2附近，由于這一區(qū)段在許多腫瘤細(xì)胞中存在缺失，因此INTS6又被命名Delete In Cancer I (DICEl)。INTS6調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)仍未完全闡明，有研究指出INTS6可能參與WNT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，在腫瘤中扮演抑癌基因的角色。INTS6在前列腺癌組織和細(xì)胞株中存在表達(dá)缺失。文獻(xiàn)報(bào)道，雜合性缺失(loss of heterozygosity, L0H)和表觀遺傳學(xué)改變雙重打擊造成前列腺癌中INTS6表達(dá)下調(diào)。INTS6成為RNA激活干預(yù)前列腺癌的理想靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種靶向上調(diào)INTS6基因的小RNA在制備抗激素非依賴性前列腺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)特定序列的小雙鏈RNA誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞中INTS6基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的増殖和運(yùn)動(dòng)能力，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展的目的。所述靶向上調(diào)INTS6基因的小RNA的核苷酸序列由2對(duì)(4條)21個(gè)核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，其序列分別為dsINTS6-374 S (SEQ ID N0:l):5，-CCA CUU UAC UCAACC CUU C [dTdT] -3，，dsINTS6_374 AS (SEQ ID N0:2):5，-GAA GGG UUG AGU AAA GUGG [dTdT] -3’ ；dsINTS6-390 S (SEQ ID N0:3) :5’ -CUA ACC AGG UGU UUG UCC A [dTdT]-3，，dsINTS6-390 AS (SEQ ID N0:4) :5，-UGG ACA AAC ACC UGG UUA G [dTdT] -3，。每條鏈的3’端均懸掛突出兩個(gè)核苷酸(通常為dTdT，中間19個(gè)核苷酸配對(duì))。本發(fā)明的有益之處小RNA操作簡(jiǎn)單,成本較低；用量較少，20nM的轉(zhuǎn)染濃度即可達(dá)到良好的激活效果；激活作用確切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA誘導(dǎo)基因表達(dá)屬于表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)，不破壞基因組的完整性，因此應(yīng)用較為安全。


圖I是不同位點(diǎn)dsRNAs對(duì)PC3細(xì)胞內(nèi)INTS6 mRNA表達(dá)的影響程度，數(shù)據(jù)來(lái)源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。圖2是不同位點(diǎn)dsRNAs對(duì)Dul45細(xì)胞內(nèi)INTS6 mRNA表達(dá)的影響程度，數(shù)據(jù)來(lái)源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖3是dsINTS6-374/-390上調(diào)PC3細(xì)胞內(nèi)INTS6蛋白的表達(dá)，β -actin表達(dá)量作為內(nèi)參。圖4是dsINTS6-374/-390上調(diào)Dul45細(xì)胞內(nèi)INTS6蛋白的表達(dá)，β-actin表達(dá) 量作為內(nèi)參。圖5是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明顯抑制PC3細(xì)胞活性，數(shù)據(jù)以平均值土
標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖6是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明顯抑制Dul45細(xì)胞活性，數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖7是dsINTS6-374/_390處理后PC3細(xì)胞平板克隆形成能力減弱。圖8是流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示dsINTS6-374/-390能誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生Gl期周期阻滯，數(shù)據(jù)來(lái)源于3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差顯示。圖9是dsINTS6-374/_390處理組穿至transwell膜下表面的PC3細(xì)胞數(shù)較少，Migration :細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；invation :細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。圖10是dsINTS6-374/-390處理組穿至transwell膜下表面的Dul45細(xì)胞數(shù)較少，Migration :細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；invation :細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。圖11是dsINTS6-374/_390處理后，PC3裸鼠移植瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯放緩。圖12是免疫組化顯示處理組移植瘤組織中，腫瘤細(xì)胞尤其是胞核中INTS6表達(dá)增強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)ー步的說(shuō)明。但這些具體實(shí)施方案不是要以任何方式限制所要求保護(hù)的發(fā)明范圍。實(shí)施例I dsRNAs上調(diào)前列腺癌細(xì)胞中INTS6基因的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)方案
1.細(xì)胞系人激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、Dul45(上海細(xì)胞所)
2.dsRNAs合成dsRNAs均由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司化學(xué)合成。3.實(shí)驗(yàn)分組
20nM的dsINTS6-374和-390組、無(wú)意義dsRNA對(duì)照組(dsControl)和空白轉(zhuǎn)染試劑組(mock)。dsControl組dsRNA與已知人基因組序列非同源正義鏈，5’_ACU ACU GAG UGACAG UAG A [dTdT]-3’ (SEQ ID NO: 5);反義鏈，5’ -UCU ACU ⑶ C ACU CAG UAG U [dTdT]-3， (SEQ ID N0:6)。4.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)在含10%滅活新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，放置于C02含量為5%的37oC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。轉(zhuǎn)染前一天細(xì)胞傳代后種于培養(yǎng)板中，密度大約30 40%。dsRNAs經(jīng)過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000包裹后轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，以6孔板為例(其余培養(yǎng)器皿根據(jù)底面積之間的比例調(diào)整試劑量)，每孔取3μ1 20 μ M dsRNAs儲(chǔ)存液和5μ1脂質(zhì)體分別溶于250μ1無(wú)血清培養(yǎng)基，5min后混合，室溫靜置20min后加入培養(yǎng)板中，補(bǔ)充含血清培養(yǎng)基使dsRNA終濃度為20nM，作用持續(xù)48至144小時(shí)。5.逆轉(zhuǎn)錄ー聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):
利用Trizol Reagent將各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞提取總RNA，紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量。取3 μ g 總 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。GAPDH 上游引物(SEQ ID NO: 7 ): 5 ’ -ATGGCACCGTCAAGGCTGAG-3 ’，下游引物(SEQ ID N0:8):5，-GCAGTGATGGCATGGACTGT-3’，INTS6 上游引物(SEQ ID NO:9):5，- TGCCCATCTTACTGTTCCTG-3，，下游引物(SEQ ID N0:10):5，_ TCTTCGAAAGTGACCAGC-3，。采用SYBR Green染料法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR (real-time PCR)檢測(cè)，結(jié)果按照2-delta法標(biāo)準(zhǔn)化到對(duì)照組進(jìn)行比較。
6.蛋白印跡(Western Blot)
細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞，利用RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA (ニ喹啉甲酸)法測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)整待測(cè)樣本的蛋白質(zhì)含量。每孔加20ug的蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，把膜放入稀釋的一抗中，溫和振湯3h后直4度冰箱中過(guò)夜。再溫和振湯2 h ,回收一抗后在Tris緩沖液中洗膜30 min，中間更換Tris緩沖液2_3次，分別把膜置于稀釋的ニ抗中溫和振蕩lh，后在Tris緩沖液中洗膜30 min，中間換液3-4次。曝光、顯影及定影，用底片掃描儀掃描X線膠片。結(jié)果如下
I.兩對(duì)dsRNAs對(duì)激素非依賴前列腺癌細(xì)胞內(nèi)INTS6 mRNA表達(dá)的影響對(duì)激素非依賴前列腺癌細(xì)胞PC3和Dul45分別轉(zhuǎn)染20nM dsRNAs(dsINTS6-374、_390)以及對(duì)照dsRNA(dsControl)并設(shè)置空白對(duì)照組，72小時(shí)后利用RT-PCR檢測(cè)INTS6的mRNA表達(dá)情況，與對(duì)照組相比，dsINTS6-374、-390作用組細(xì)胞內(nèi)的INTS6 mRNA明顯增加，是對(duì)照組的2倍以上(參見圖1，圖2)。2. dsINTS6-374/-390上調(diào)前列腺癌細(xì)胞內(nèi)INTS6蛋白的表達(dá)
進(jìn)ー步通過(guò)Western Blot檢測(cè)PC3和Dul45細(xì)胞轉(zhuǎn)染72小時(shí)后各作用組細(xì)胞內(nèi)INTS6蛋白表達(dá)情況，與對(duì)照組相比，dsINTS6-374/-390作用組細(xì)胞內(nèi)的INTS6蛋白增加(參見圖
3、4)。實(shí)施例2 dsINTS6-374/-390上調(diào)INTS6在體外對(duì)激素非依賴前列腺癌細(xì)胞的抑制作用
實(shí)驗(yàn)方案
I.細(xì)胞系同實(shí)施例I。2. dsRNAs合成同實(shí)施例I。3.實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)施例I。4.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染同實(shí)施例I。5.四唑鹽(MTT)比色法
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的癌細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，以每孔2000 5000個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)(為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)驗(yàn)前測(cè)定細(xì)胞的貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種數(shù)目細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，再確定每孔細(xì)胞的接種數(shù)，以保證培養(yǎng)終止時(shí)細(xì)胞不至于過(guò)滿)，將培養(yǎng)板置于37°C，5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜后，吸去舊培養(yǎng)液，加入20nM dsINTS6-374/-390，并設(shè)立陰性對(duì)照(dsControl)和空白對(duì)照(Mock)。作用48 144小時(shí)后，每孔加入20μ1 MTT溶液(5 mg/ml)，37°C孵育4小時(shí)后棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μ1，室溫放置10分鐘，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(OD)值。按下述公式計(jì)算細(xì)胞存活率存活率=治療組OD值/空白對(duì)照組OD值X 100% ；
6.平板克隆形成
經(jīng)胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock組處理72h后的細(xì)胞，分別取400個(gè)細(xì)胞種于六孔板的孔中培養(yǎng)，直至出現(xiàn)肉眼可見的克隆形成，100%甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，觀察各處理組細(xì)胞克隆形成的數(shù)量。7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
經(jīng)胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock組處理72h后的細(xì)胞，70%酒精固定，用PBS洗滌并細(xì)胞計(jì)數(shù)，取含有IXlO5個(gè)細(xì)胞的懸液，RNA酶處理細(xì)胞去除RNA，4°C、2000rpm離心5分鐘，棄上清液，每個(gè)樣本加入500μ1的PI染料，室溫避光保存30分鐘，Beckman Coulter FC500流式細(xì)胞儀檢測(cè),粗?jǐn)?shù)據(jù)使用modfit軟件判讀,計(jì)算GO/Gl、S和G2/M各期細(xì)胞的比例。8. Transwell穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力
利用孔徑8 μ m (略小于細(xì)胞直徑)的transwell小室檢驗(yàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。小室的上室采用無(wú)血清的培養(yǎng)基，小室的下室采用含20%血清的培養(yǎng)基，由此建立趨化梯度。經(jīng)胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390,dsControl以及Mock組處理72h后的細(xì)胞，分別將8X IO4個(gè)不同處理組的細(xì)胞置于上室的低血清環(huán)境中培養(yǎng)，比較一定時(shí)間后趨化至下室的細(xì)胞數(shù)，從而評(píng)價(jià)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。其中，使用無(wú)基質(zhì)膠的transwell小室評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移能力，使用基質(zhì)膠預(yù)先處理的transwell小室評(píng)價(jià)細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果如下
I. dsINTS6-374/-390抑制激素非依賴前列腺癌細(xì)胞的活性
為了明確dsINTS6-374/-390對(duì)激素非依賴前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和活性的抑制程度，我們進(jìn)行了 MTT試驗(yàn)。在96孔板中，分別對(duì)PC3和Du 145細(xì)胞轉(zhuǎn)染20nM的dsINTS6_374/-390和dsControl RNA,并設(shè)置空白對(duì)照組mock,姆個(gè)組共設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,結(jié)果均標(biāo)準(zhǔn)化到mock組(以mock組為I)。參見圖5、6，dsINTS6-374/-390對(duì)兩種癌細(xì)胞的抑制作用出現(xiàn)在48h時(shí)間點(diǎn)，且持續(xù)至144h。在轉(zhuǎn)染144h時(shí)，dsINTS6-374/-390對(duì)兩種癌細(xì)胞的抑制率均超過(guò)50%。2. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的體外克隆形成能力 利用平板克隆形成，研究dsINTS6-374/-390抑制激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞活性是
否與細(xì)胞增殖減弱有夫。對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC3分別轉(zhuǎn)染20nM的dsINTS6-374/-390和對(duì)照dsRNA (dsControl)，觀察處理后每400個(gè)細(xì)胞最終在平板中形成克隆的數(shù)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照RNA組相比，dsINTS6-374/-390處理的PC3細(xì)胞形成克隆的數(shù)目更少。(參見圖7)
3.dsINTS6-374/-390能誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞發(fā)生Gl期阻滯 對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC3和Dul45分別轉(zhuǎn)染20nM的dsINTS6_374/-390和對(duì)照dsRNA(dsCon),72小時(shí)后利用PI染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)研究細(xì)胞周期分布。如圖8所示，dsINTS6-374/-390處理組G0/G1期細(xì)胞增加而S期細(xì)胞減少。4. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)能力
利用transwell穿膜實(shí)驗(yàn)，研究dsINTS6-374/-390處理后激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞PC3和Dul45運(yùn)動(dòng)能力的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照RNA組相比，dsINTS6_374/-390處理的PC3和Dul45穿至transwell膜下表面的細(xì)胞數(shù)較少。(參見圖9、10)
實(shí)施例3 dsINTS6-374上調(diào)INTS6在體內(nèi)抑制激素非依賴性前列腺癌的生長(zhǎng) 實(shí)驗(yàn)方案
I.細(xì)胞系人激素非依賴前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3。2.動(dòng)物模型采用4周齡BALB-c裸鼠,皮下荷瘤。成瘤后分non-sense dsRNA對(duì)照組和dsINTS6-374/-390 RNA組進(jìn)行干預(yù)，每組4只。3.給藥方案瘤內(nèi)注射30ii g脂質(zhì)體包被的RNA，3天一次，共三周。4.結(jié)果觀察同步觀察瘤體大小變化情況。最后處死裸鼠，免疫組化染色觀察腫瘤組織中INTS6蛋白的表達(dá)。結(jié)果如下 小激活RNA能夠激活PC3裸鼠皮下移植瘤中INTS6的表達(dá)，同時(shí)抑制移植瘤的生長(zhǎng)利用PC3細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤，移植瘤內(nèi)重復(fù)注射dsINTS6-374/-390小激活RNA，移植瘤生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)瘤組織內(nèi)INTS6表達(dá)增強(qiáng)。(參見圖11、12)。
權(quán)利要求
1.ー種靶向上調(diào)INTS6基因的小RNA在制備抗激素非依賴性前列腺癌藥物中的應(yīng)用，所述靶向上調(diào)INTS6基因的小RNA的核苷酸序列由4條21個(gè)核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，其序列分別為dsINTS6-374 S :5，-CCA CUU UAC UCA ACC CUU C [dTdT] -3’，dsINTS6-374 AS :5’ -GAA GGG UUG AGU AAA GUG G [dTdT] -3’ ；dsINTS6-390 S :5’ -CUAACC AGG UGU UUG UCC A [dTdT] -3’，dsINTS6_390 AS :5’ -UGG ACA AAC ACC UGG UUA G[dTdT] -3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種靶向上調(diào)INTS6基因的小RNA在制備抗激素非依賴性前列腺癌藥物中的應(yīng)用，其特征在干，每條鏈的3’端均懸掛突出兩個(gè)核苷酸，為dTdT，中間19個(gè)核苷酸配對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種靶向上調(diào)PAR-4基因的小RNA在制備抗膀胱癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物還有制劑允許的賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種靶向上調(diào)INTS6基因的小RNA在制備抗激素非依賴性前列腺癌藥物中的應(yīng)用。所述的小RNA的核苷酸序列由4條21個(gè)核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，每條鏈的3’端均懸掛突出兩個(gè)核苷酸，通常為dTdT，中間19個(gè)核苷酸配對(duì)。本發(fā)明通過(guò)特定序列的小雙鏈RNA誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞中INTS6基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)能力，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展的目的。本發(fā)明的小RNA操作簡(jiǎn)單，成本較低；用量較少，20nM的轉(zhuǎn)染濃度即可達(dá)到良好的激活效果；激活作用確切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA誘導(dǎo)基因表達(dá)屬于表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)，不破壞基因組的完整性，因此應(yīng)用較為安全。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102657878SQ20121013090
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月1日
發(fā)明者楊凱, 林奕偉, 毛祺琦, 秦杰, 胡政麾, 茅葉青, 謝立平, 鄭祥毅, 金勇豐, 陳弘 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)