專利名稱：：一種與前列腺癌易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法一種與前列腺癌易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)的基因領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)與前列腺癌易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是男性中第二大常見腫瘤，在癌癥相關(guān)死因中位于第六位，全球每年預(yù)計(jì)新發(fā)病例91.4萬人，病死例數(shù)約25.8萬人(JemalA,BrayF，CenterMMjFerlayJ，WardE，F(xiàn)ormanD.Globalcancerstatistics.CACancerJClin2011;61,69-90.)。前列腺癌的病因大多不是很清楚，目前的研究結(jié)果表明，除了年齡和種族，家族史是前列腺癌發(fā)病另一主要的高危險(xiǎn)因素(GronbergH.Prostatecancerepidemiology.Lancet.2003;361(9360):859-64.)。這種家族聚集性在很大程度上提示了遺傳因素對前列腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響。在一項(xiàng)雙胞胎研究中發(fā)現(xiàn)，遺傳因素能解釋42%前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(LichtensteinP,HolmNV,VerkasaloPK,IliadouA,KaprioJ,KoskenvuoMetal.Environmentalandheritablefactorsinthecausationofcancer—analysesofcohortsoftwinsfromSweden,Denmark,andFinland.NEnglJMed.2000;343,78-85.)。造成差異的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)之一就包括SNP(單核苷酸多態(tài)性XSNP主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每5001000個(gè)堿基對中就有I個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多(CollinsF.S.,BrooksL.D.,ChakravartiA.ADNApolymorphismdiscoveryresourceforresearchonhumangeneticvariation.GenomeRes.1998,8(12)，1229-31.)。目前，SNP是研究人類常見疾病遺傳變異的重要依據(jù)。而全基因組關(guān)聯(lián)研究是系統(tǒng)找出疾病SNP遺傳變異的、具有良好前景的分子遺傳學(xué)研究方法。本發(fā)明通過全基因組關(guān)聯(lián)研究，選擇9q31.2區(qū)域作為所研究的基因，同時(shí)選擇9q31.2區(qū)域上的SNP位點(diǎn)作為所研究的方向。經(jīng)對國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，至今未見有9q31.2遺傳區(qū)域與前列腺癌相關(guān)聯(lián)的報(bào)道，也沒有9q31.2區(qū)域上多態(tài)性位點(diǎn)與前列腺癌的相關(guān)性報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2部分基因序列，通過rs817826單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的遺傳研究，提出一個(gè)可作為判定前列腺癌高危人群的易感SNP位點(diǎn)，以利于前列腺癌高危人群的篩查，以利于預(yù)防和治療。本發(fā)明研究表明，遺傳區(qū)域9q31.2與前列腺癌的易感性相關(guān)。本發(fā)明首先提供與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2上的部分基因序列，該基因序列的核苷酸序列如SEQ.1D.NO.1所示，其第501位為T/C。本發(fā)明還提供與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2上的一單核苷多態(tài)性位點(diǎn)，rs817826:rs817826位于RAD23B和KLF4基因之間；rs817826堿基為T/C；rs817826的SNP序列通過http://genome,uses,edu/數(shù)據(jù)庫獲得，其序列如SEQ.1D.NO.2所不。本發(fā)明還提供檢測一單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的特異性核酸引物SEQ.1D.NO.3、SEQ.1D.NO.4、SEQ.1D.NO.5，且特異性地?cái)U(kuò)增出單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明關(guān)于與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2基因序列，其獲得rs817826序列的具體步驟如下通過http://genome,uses,edu/數(shù)據(jù)庫，在遺傳區(qū)域9q31.2上選擇單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs817826;依據(jù)相應(yīng)的堿基序列合成引物ACGTTGGATGCACTTTATCCTCCTAGTGAA(SEQ.1D.NO.3),ACGTTGGATGACCGTTGAGACTTAGTGTAG(SEQ.1D.NO.4)以及UEP引物cccctCTACAGAGGCCCTAGTAAA(SEQ.1D.NO.5);進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取SNPrs817826分型數(shù)據(jù)。PCR擴(kuò)增中，PCR反應(yīng)體系5ul:0.625ul10XTaqBuffer,O.125mMdNTP,O.12ulIOnMPCR引物Mix，O.32525nMMgCl2,0.1ul5U/MLHotstar酶，用ddH20補(bǔ)足5ul；PCR反應(yīng)條件95°C2min；95°C0.5min,96°C0.5min,72°Clmin，45個(gè)循環(huán)；72°C5min,25°C⑴min;SAP純化反應(yīng)體系2ul:0.17ul10XSAPBuffer,0.3lU/ulSAP酶，用ddH20補(bǔ)足2ul;SAP純化反應(yīng)條件37°C40min,85°C5min，25°C^min;單堿基延伸反應(yīng)體系2ul:0.2IOXiPlexBuffer,0.2iPlexTermination,0.33IOOuM終止引物Mix,0.041iPlexEnzyme,用ddH20補(bǔ)足2ul;單喊基延伸反應(yīng)條件94°C30s；94°C5s,92°C5s-80°C5s，內(nèi)部循環(huán)5次，外部循環(huán)40次；72°C180s；25°C^s;將反應(yīng)產(chǎn)物共15nL，經(jīng)樹脂純化后，SpectroCHIP芯片上樣；通過MassARRAYMALD1-TOFMassSpectrometry進(jìn)行質(zhì)譜檢測，并獲取SNPrs817826分型數(shù)據(jù)。本發(fā)明還提供所述的與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2的應(yīng)用，通過提取受試者基因組DNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs817826的基因分型，其中rs817826堿基為C的個(gè)體為前列腺癌易感人群。rs817826堿基為T的個(gè)體為前列腺癌非易感人群。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，以進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1通過提取受試者基因組DNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性rs817826的基因分型，其中rs817826堿基為C的個(gè)體為前列腺癌的易感人群。具體做法是1.基因組DNA的提取受試者均由外周靜脈血抽取2-3ml，采用QIAampBloodMiniKit250(QIAGEN，德國)試劑盒提取基因組DNA，-20°C保存。2.SNP基因分型根據(jù)SNP的序列信息,運(yùn)用Sequenom公司的引物設(shè)計(jì)軟件MassARRAYAssayDesign3.1(Sequenom,Inc.，SanDiego,CA)設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物，并在生物工程(上海)有限公司合成。合成后的引物與樣品DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，混合后的反應(yīng)產(chǎn)物在SequenomiPLEX儀器上進(jìn)行SNP基因分型。具體實(shí)驗(yàn)流程如下(1)引物設(shè)計(jì)運(yùn)用Sequenom公司的引物設(shè)計(jì)軟件MassARRAYAssayDesign3.1(Sequenom,Inc.,SanDiego,CA)為多重反應(yīng)自動(dòng)設(shè)計(jì)PCR引物(SEQ.1D.NO.3;SEQ.1D.NO.4)和iPLEXGold單堿基延伸引物(SEQ.1D.NO.5)；(2)PCR反應(yīng)(A)PCR反應(yīng)液(Mix):按照下表中的順序從上到下依次加入，單位ul權(quán)利要求1.一種與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2上的基因序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ.1D.NO.1所示，其第501位為T/C。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2上的基因序列，其特征在于，所述的與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2上具有一單核苷多態(tài)性位點(diǎn)rs817826,rs817826位于RAD23B和KLF4基因之間；rs817826堿基為T/C；rs817826的SNP序列如SEQ.1D.NO.2所示。3.—種檢測一單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs817826的特異性核酸引物，其特征在于序列為SEQ.1D.NO.3，SEQ.1D.NO.4，SEQ.1D.NO.5，其特異性地?cái)U(kuò)增出單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物。4.從權(quán)利要求2所述的與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2基因序列，獲得rs817826序列的方法,其特征在于具體步驟如下在遺傳區(qū)域9q31.2上選擇單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs817826;依據(jù)相應(yīng)的堿基序列合成引物SEQ.1D.NO.3，SEQ.1D.NO.4以及UEP引物SEQ.1D.NO.5;進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取SNPrs817826分型數(shù)據(jù)。5.從權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系5ul0.625ul10XTaqBuffer,O.125mMdNTP,O.12ulIOnMPCR引物Mix，0.32525nMMgCl2,0.1ul5U/MLHotstar酶，用ddH20補(bǔ)足5ul；PCR反應(yīng)條件95°C2min；95°CO.5min,96°CO.5min,72°Clmin，45個(gè)循環(huán)；72°C5min，25°C⑴min;SAP純化反應(yīng)體系2ul:0.17ul10XSAPBuffer,0.3lU/ulSAP酶，用ddH20補(bǔ)足2ul；SAP純化反應(yīng)條件37°C40min,85°C5min,25°C00min;單喊基延伸反應(yīng)體系2ul:0.210XiPlexBuffer,0.2iPlexTermination,0.33IOOuM終止引物Mix,0.041iPlexEnzyme,用ddH20補(bǔ)足2ul;單喊基延伸反應(yīng)條件94°C30s-MV5s,92°C5s-80°C5s，內(nèi)部循環(huán)5次，外部循環(huán)40次；72°C180s；25°C①s;將反應(yīng)產(chǎn)物共15nL，經(jīng)樹脂純化后，SpectroCHIP芯片上樣；通過MassARRAYMALD1-TOFMassSpectrometry進(jìn)行質(zhì)譜檢測，并獲取SNPrs817826分型數(shù)據(jù)。6.一種權(quán)利要求1所述的與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2基因序列的應(yīng)用，其特征在于，通過提取受試者基因組DNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs817826的基因分型，其中rs817826堿基為C的個(gè)體為前列腺癌易感人群，rs817826堿基為T的個(gè)體為前列腺癌非易感人群。全文摘要本發(fā)明屬于生物技術(shù)的基因領(lǐng)域，具體涉及一種與前列腺癌易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用。本發(fā)明提供與前列腺癌易感性相關(guān)的遺傳區(qū)域9q31.2上的部分基因序列，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；還提供遺傳區(qū)域9q31.2上的單核苷多態(tài)性位點(diǎn)rs817826；rs817826堿基為C的個(gè)體為前列腺癌易感人群，rs817826堿基為Ｔ的個(gè)體為非易感人群；rs817826的SNP序列如SEQ.ID.NO.2所示。還提供檢測單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的特異性核酸引物SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5，其特異性地?cái)U(kuò)增出單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物。文檔編號C12Q1/68GK102994495SQ20121043261公開日2013年3月27日申請日期2012年11月2日優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日發(fā)明者孫穎浩,徐劍鋒,莫曾南,許傳亮,任善成,高旭申請人:上海長海醫(yī)院,復(fù)旦大學(xué)