專利名稱：前列腺癌中的復(fù)現(xiàn)性基因融合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于癌癥診斷、研究和治療的組合物和方法，包括但不限于癌癥標(biāo)志物。具體來說，本發(fā)明涉及使用復(fù)現(xiàn)性基因融合體(recurrent gene fusion)作為前列腺癌的診斷標(biāo)志物和臨床靶。
背景技術(shù)：
癌癥研究的中心目標(biāo)是鑒定與腫瘤發(fā)生具有因果關(guān)聯(lián)的改變的基因。已經(jīng)鑒定到幾種類型的體細胞突變，包括堿基取代、插入、刪除、易位以及染色體增多和缺失，它們都引起癌基因或腫瘤抑制基因活性的改變。染色體重排是癌癥的病因這一假說，在1900年代早期首次提出，現(xiàn)在有令人信服的證據(jù)(Rowley, Nat Rev Cancer 1:245(2001))。復(fù)現(xiàn)性的染色體畸變被認(rèn)為是白血病、淋巴瘤和肉瘤的首要特征。上皮細胞腫瘤(癌)要常見得多并造成相對高比例的與人類癌癥相關(guān)的發(fā)病和死亡，其包含不到1%的已知的、疾病特異性的染色體重排(MiteIman，Mutat Res 462:247(2000))。盡管血液癌通常具有平衡的、疾病特異性染色體重排的特征，但大多數(shù)實體腫瘤具有過多的非特異性染色體畸變。據(jù)認(rèn)為，實體腫瘤的核型復(fù)雜性是由于通過癌癥演化或發(fā)展而獲得的繼發(fā)改變。已經(jīng)描述了染色體重排的兩種主要機制。在一種機制中，一個基因的啟動子/增強子元件鄰近原癌基因重排，從而引起致癌蛋白表達的改變。這種類型的易位的實例是免疫球蛋白(IG)和T-細胞受體(TCR)基因與MYC的并置，其分別在B-和T-細胞癌中引起該癌基因的活化(Rabbitts，Nature 372:143(1994))。在第二種機制中，重排導(dǎo)致兩個基因的融合，由此產(chǎn)生了可能具有新功能或改變的活性的融合蛋白。這種易位的范例是慢性粒細胞白血病(CML)中的 BCR-ABL 基因融合體(Rowley, Nature 243 :290(1973) ；de Klein等，Nature 300:765(1982))。重要的是,該發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了甲磺酸伊馬替尼(Gleevec)的合理開發(fā)，其成功地靶向BCR-ABL激酶(Deininger等，Blood 105:2640(2005))。因此，在常見上皮細胞腫瘤中鑒定復(fù)現(xiàn)性基因重排，對于癌癥藥物發(fā)現(xiàn)工作以及患者治療可能具有深遠意義。發(fā)明概述在某些實施方案中，本發(fā)明提供了在患者中鑒定前列腺癌的方法，所述方法包含提供來自于患者的樣品；以及檢測樣品中具有來自于SLC45A3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’部分和來自于ERG基因的3 ’部分的基因融合體的存在或不存在，其中在樣品中檢測到該基因融合體的存在鑒定患者患有前列腺癌。在某些實施方案中，SLC45A3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包含SLC45A3基因的啟動子區(qū)。在某些實施方案中，檢測步驟包含檢測具有來自于SLC45A3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’ DNA部分和來自于ERG基因的3’ DNA部分的基因組DNA的染色體重排。在某些實施方案中，檢測步驟包含檢測具有從SLC45A3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄的5’ RNA部分和從ERG基因轉(zhuǎn)錄的3’ RNA部分的嵌合mRNA轉(zhuǎn)錄物。在某些實施方案中，樣品是組織、血液、血漿、血清、尿液、尿液上清液、尿液細胞沉淀物、精液、前列腺分泌物或前列腺細胞。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了在患者中鑒定前列腺癌的方法，所述方法包含提供來自于患者的樣品；以及檢測樣品中具有來自于FLJ35294基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’部分 和來自于ETS家族成員基因的3 ’部分的基因融合體的存在或不存在，其中在樣品中檢測到基因融合體的存在鑒定患者患有前列腺癌。在某些實施方案中，F(xiàn)LJ35294基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包含F(xiàn)LJ35294基因的啟動子區(qū)。在某些實施方案中，ETS家族成員基因是ETVl。在某些實施方案中，檢測步驟包含檢測具有來自于FLJ35294基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’ DNA部分和來自于ETS家族成員基因的3’ DNA部分的基因組DNA的染色體重排。在某些實施方案中，檢測步驟包含檢測具有從FLJ35294基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄的5’ RNA部分和從ETS家族成員基因轉(zhuǎn)錄的3’ RNA部分的嵌合mRNA轉(zhuǎn)錄物。在某些實施方案中，樣品是組織、血液、血漿、血清、尿液、尿液上清液、尿液細胞沉淀物、精液、前列腺分泌物或前列腺細胞。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了在患者中鑒定前列腺癌的方法，所述方法包含提供來自于患者的樣品；以及檢測樣品中具有來自于DDX5基因的5’部分和來自于ETS家族成員基因的3 ’部分的基因融合體的存在或不存在，其中在樣品中檢測到基因融合體的存在鑒定患者患有前列腺癌。在某些實施方案中，ETS家族成員基因是ETV4。在某些實施方案中，檢測步驟包含檢測具有來自于DDX5基因的5’ DNA部分和來自于ETS家族成員基因的3’ DNA部分的基因組DNA的染色體重排。在某些實施方案中，檢測步驟包含檢測具有從DDX5基因轉(zhuǎn)錄的5’ RNA部分和從ETS家族成員基因轉(zhuǎn)錄的3’ RNA部分的嵌合mRNA轉(zhuǎn)錄物。在某些實施方案中，檢測步驟包含檢測具有DDX5基因編碼的氨基端部分和ETS家族成員基因編碼的羧基端部分的嵌合蛋白。在某些實施方案中，樣品是組織、血液、血漿、血清、尿液、尿液上清液、尿液細胞沉淀物、精液、前列腺分泌物或前列腺細胞。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷、治療和研究目的的組合物。在某些實施方案中，組合物包含寡核苷酸探針，所述探針包含與嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的連接處雜交的序列。在某些實施方案中，組合物包含第一個寡核苷酸探針，所述探針包含與嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分雜交的序列，以及第二個寡核苷酸探針，所述探針包含與嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分雜交的序列。在某些實施方案中，組合物包含第一個擴增寡核苷酸，所述寡核苷酸包含與嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分雜交的序列，以及第二個擴增寡核苷酸，所述寡核苷酸包含與嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分雜交的序列。在某些實施方案中，組合物包含針對具有5’基因編碼的氨基端部分和3’基因編碼的羧基端部分的嵌合蛋白的抗體。本發(fā)明的其他實施方案提供在下面的說明書和實施例中。


圖I顯示了微陣列數(shù)據(jù)的癌癥異常值譜分析(Cancer Outlier ProfileAnalysis) (COPA)。(A)顯示了兩個大規(guī)模基因表達研究中所有進行譜分析的樣品的ETVl (左圖)和ERG(中圖)的表達(歸一化的表達單位)。(B)與(A)中相同，差別在于使用了激光捕獲顯微切割的樣品。(C)與(A)中相同，差別在于檢查了多發(fā)性骨髓瘤中已知易位到免疫球蛋白重鏈啟動子(IgH)的癌基因(FGFR3和CCND1)。圖2顯示了前列腺癌(PCA)中TMPRSS2:ETV1和TMPRSS2:ERG基因融合體的鑒定和表征。(A)通過定量PCR(QPCR)分析前列腺癌細胞系(DuCaP、LnCaP和VCaP)和激素抗拒性轉(zhuǎn)移性(MET)前列腺癌組織的ERG( ■)和ETVl ( □ )mRNA表達。⑶與LNCaP細胞中相比，MET26中失去了 ETVl外顯子2和3的過表達。(C)MET26_LN中的ETVl和MET28-LN中的ERG的5' RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴增(RLM-RACE)結(jié)果的示意圖，顯示了與TMPRSS2的基因融合體。(D)在MET26-LN和MET26-RP中使用易位特異性QPCR驗證TMPRSS2:ETV1 的表達。(E)在細胞系和PCA樣本中使用易位特異性QPCR驗證TMPRSS2:ERG的表達。圖3顯示了在福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片上的間期熒光原位雜交(FISH)，證實了 TMPRSS2:ETV1基因融合和ERG基因重排。(A和B)顯示了雙色融合信號方法檢測TMPRS S2 (綠色信號)與ETVl (紅色信號)的融合。(C和D)使用雙色分裂信號方法，利用跨過ERG的5’(綠色信號)和3’(紅色信號)區(qū)域的兩個探針檢測ERG基因重排。(E)使用與(A-D)中相同的探針在獨立的組織微陣列上的FISH結(jié)果的矩陣表示，所述微陣列含有來自13例臨床局限性前列腺癌(PCA)和16例轉(zhuǎn)移的前列腺癌(MET)的核心。圖4顯示了在帶有TMPRSS2:ERG易位的前列腺癌細胞中ERG的雄激素調(diào)控。圖5顯示了癌癥異常值譜分析(COPA)。圖5A顯示了 COPA分析的示意圖。圖5B顯示了 RUNX1T1 (ETO)在Valk等的急性粒細胞白血病數(shù)據(jù)組(n = 293)的90百分位數(shù)處具有最高分值的異常值情況。圖5C顯示了 E2A-PBX1的異常值表達情況圖。圖6顯示了 MET26-LN中的ETVl和PCA4中的ERG的RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴增(RLM-RACE)結(jié)果，表明了與TMPRSS2的基因融合(TMPRSS2:ERGb融合體)。圖7顯示了前列腺癌中ETS家族成員的過表達。從大體切片組織(A)或通過激光捕獲顯微切割分離的組織(B)中進行譜分析的良性前列腺、前列腺上皮內(nèi)瘤(PIN)、臨床局限性前列腺癌和轉(zhuǎn)移前列腺癌中所有被監(jiān)測的ETS家族成員的表達，使用Oncomine進行可視化。圖8顯示了過表達ETV4的前列腺癌病例中TMPRSS2和ETV4基因座的過表達。A.在合并的良性前列腺組織(CPP)、沒有過表達ETV4并且是TMPRSS2:ERG陽性(PCA1-2)或陰性(PCA3-4)的前列腺癌、以及來自我們的具有ETV4過表達的LCM組群的前列腺癌病例(PCA5)中，ETV4的標(biāo)出的外顯子或區(qū)域的表達。B. RLM-RACE顯示出在PCA5中TMPRSS2上游的序列與ETV4融合。C.通過QPCR檢測的PCA5中TMPRSS2: ETV4a和TMPRSS2: ETV4b的表達。D.在福爾馬林固定的石蠟包埋組織上進行的間期熒光原位雜交證實了 PCA5中TMPRSS2與ETV4基因座的融合。圖9顯示了示例性ETS家族基因的mRNA序列。圖10 顯示了 TMPRSS2 的 mRNA 序列。圖11顯示了通過FISH進行的TMPRSS2:ERG基因融合體分析。圖A :核型模式圖，描繪了用于間接檢測TMPRSS2:ERG融合體的分裂(break apart)分析。圖B :基質(zhì)細胞(左偵D和前列腺癌腺體(右側(cè))的間期核。圖C :前列腺癌腺體的間期核，顯示了分裂和同時的刪除，正如端粒探針的失去所指示的(IOOx油浸物鏡放大倍數(shù))。圖D :C中加框區(qū)域的放大視圖，證實了兩個核的分裂和端粒探針的失去^Ox油浸物鏡放大倍數(shù))。圖12顯示了 12號染色體上ERG與TMPRSS2之間的基因組刪除。圖A :樣品包括6個細胞系、13個異種移植物和11個轉(zhuǎn)移PCA樣品，通過qPCR和/或FISH進行TMPRSS2: ERG和TMPRSS2:ETV1狀態(tài)的表征(灰色條表示陰性，藍色條表示陽性狀態(tài))。圖B :A中加綠色框區(qū)域的放大圖。圖C :A中加黑色框區(qū)域的 放大圖。圖13顯示了臨床局限性前列腺癌中的TMPRSS2:ERG重排以及與病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性。圖A.在49.2%的原發(fā)PCA樣品和41.2%的未接觸過激素的轉(zhuǎn)移LN樣品中鑒定到了TMPRSS2: ERG重排。圖B.在腫瘤晚期的PCA病例中傾向于觀察到更高百分率的帶有缺失的TMPRSS2:ERG 重排腫瘤(p = 0. 03)。圖14顯示了位于21q22_23上ERG(著絲粒方向)與TMPRSS2 (端粒方向)之間的已知基因。黑線上方的基因走向為5’ -著絲粒到3’ -端粒方向，黑線下方的基因走向為5’-端粒到3’-著絲粒方向。在圖像的下半部分，描繪了使用FISH探針檢測的ERG基因座的放大圖。圖15顯示了 “異源”前列腺癌病例，絕大部分顯示出帶有缺失的TMPRSS2:ERG重排(右側(cè)的核)，只有少量區(qū)域顯示出沒有缺失的TMPRSS2:ERG重排(左側(cè)的核)。圖16顯示了位于TMPRSS2與ERG之間的基因跨8個已發(fā)表的表達陣列數(shù)據(jù)組的碁萃分析(meta-analysis)。圖17顯示出FISH測定檢測到與TMPRSS2:ERG基因融合相關(guān)的特征性刪除，這與疾病發(fā)展有關(guān)。圖A和B :為了分析染色體21q22. 2上的ERG重排，使用了由分別跨越ERG基因座附近的著絲粒向和端粒向區(qū)域的生物素-14-dCTP標(biāo)記的BAC克隆RP11-24A11 (最終結(jié)合產(chǎn)生紅色信號)和地高辛配基-dUTP標(biāo)記的BAC克隆RPl 1-137J13 (最終結(jié)合產(chǎn)生綠色信號)構(gòu)成的分裂探針(break apart probe)系統(tǒng)。使用該分裂探針系統(tǒng),沒有ERG重排的核顯示出兩對并置的紅色和綠色信號。并置的紅-綠色信號形成黃色的融合信號(圖B，箭頭)。圖C :在累計發(fā)病率回歸模型中，評估了 TMPRSS2:ERG作為累計發(fā)病率或轉(zhuǎn)移或前列腺癌特異性死亡的決定因子。圖18顯示了 FLIl沒有融合轉(zhuǎn)錄物的過表達。圖19顯示了在TMPRSS2-ERG+細胞中雄激素對ERG蛋白表達的誘導(dǎo)。圖20顯示了內(nèi)源和融合ERG多肽的示意圖。圖21顯示了 ERG2的核相互作用物。圖22顯示了針對ERGl的肽抗體的序列和aqua探針的產(chǎn)生。圖23顯示了針對ETVl的肽抗體的序列和aqua探針的產(chǎn)生。圖24顯示了針對FLIl的肽抗體的序列和aqua探針的產(chǎn)生。圖25顯示了針對ETV4的肽抗體的序列和aqua探針的產(chǎn)生。圖26顯示了 LNCaP前列腺癌細胞系中ETVl的過表達和雄激素調(diào)控。圖26A顯示了 VCaP和LNCaP前列腺癌細胞系中雄激素調(diào)控的基因的表達特征。圖26B顯示通過定量PCR(QPCR)證實了在VCaP和LNCaP兩種細胞中PSA被雄激素誘導(dǎo)。圖26C顯示了 LNCaP細胞中ETVl被雄激素誘導(dǎo)。圖26D顯示了在LNCaP細胞中ETVl顯著過表達。圖27顯示了 LNCaP細胞中ETVl的重排。圖27A顯示了在熒光原位雜交(FISH)中用作探針的BAC的示意圖。圖27B顯示了在正常外周血淋巴細胞(NPL)中RP11-124L22和RP11-1149J13共定位于7號染色體。圖27C顯示了在接近四倍體的LNCaP細胞系中確定了 I號BAC和4號BAC在中期涂片(上圖)和間期細胞(下圖)上的定位。圖27D顯示了在LNCaP細胞中來自RP11-124L22的信號定位于14號染色體。圖28顯示了整個ETVl基因座被插入到LNCaP細胞的14號染色體中。圖28A顯示了在本實驗中使用的BAC的示意圖。圖28B顯示了在LNCaP細胞中通過FISH確定了RP11-124L22(1號BAC)和RP11-313C20 (2號BAC)在中期涂片(上圖)和間期細胞(下圖)上的定位。圖29顯示了在LnCaP中ETVl的siRNA擊倒。圖30顯示了在VCaP中ERG的siRNA擊倒。
圖31顯示了病毒過表達系統(tǒng)。圖32顯不了轉(zhuǎn)基因小鼠的不意圖。圖33顯示了尿液中ERG和ETVl轉(zhuǎn)錄物的檢測。圖33A顯示了在LNCaP (高ETVl表達)或VCaP (高ERG和TMPRSS2: ERG表達)前列腺癌細胞中ERG和ETVl的檢測。圖33B顯示了在疑似患有前列腺癌的患者的尿液中ERG和ETVl的檢測。圖34顯示了用于在前列腺癌中檢測TMPRSS2:ETS基因融合體的測定方法。圖34A顯不了用于TMPRSS2和ERG的分裂測定方法(break apart assay)。通過一對分裂的5’和3’信號指示的ERG重排陽性病例(沒有缺失)顯示在左圖中。通過失去一個3’信號指示的TMPRSS2重排陽性病例(具有缺失)顯示在右圖中。圖34B顯示了用于TMPRSS2:ETV1基因融合體的融合測定方法。圖34C顯示了用于ETV4的分裂測定方法。圖35顯示了通過FISH檢測的TMPRSS2、ERG、ETV1和ETV4重排。圖35A顯示了通過圖34中所示的測定方法檢測到的TMPRSS2、ERG、ETVl和ETV4的重排結(jié)果表。圖34B顯示了來自所有四種測定都可以按照A中的描述進行評估的38個病例的TMPRSS2、ERG、ETV1和ETV4狀態(tài)的熱圖表現(xiàn)。圖34C顯示了 TMPRSS2和ETS重排狀態(tài)不一致的病例的熱圖表
/Jn o圖36顯示了本發(fā)明的基因融合體的序列。圖37顯示了用于FLI-I表達分析的引物和探針。圖38顯示了異常值腫瘤樣本中與ETVl融合的前列腺特異性或遍在活性的調(diào)控元件的鑒定。a. ETVl異常值病例的鑒定，b.在異常值病例中與ETVl融合的新的5’配偶體的結(jié)構(gòu)，c.使用5’針對所標(biāo)明的配偶體和3’針對ETVl的探針，通過FISH證實ETVl融合。d. 5’融合配偶體的組織特異性，e. 5’融合配偶體的雄激素調(diào)控的評估。圖39顯示了通過qPCR驗證的新EVTl基因融合體。圖40顯示了通過FISH驗證的新ETVl基因融合體。a.在間期FISH中用作探針的、5’ 和 3，位于 ETVU HNRPA2B1、HERV_K_22qll. 23、C150RF21 和 SLC45A3 的 BAC 的示意圖。b-d.使用所標(biāo)出的BAC以及相應(yīng)的熒光標(biāo)記物在福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片上進行FISH，用于b)5’融合配偶體的分裂信號測定，c) 5’配偶體和ETVl的融合測定，以及d)ETVl的分裂信號測定。
圖41顯示前列腺細胞中ETVl的過表達賦予了浸潤力。a.表達ETVl基因融合產(chǎn)物(外顯子4-直到報道的終止密碼子)的腺病毒和慢病毒。b.將良性永生化前列腺細胞系RWPE按照指示用ETVl或?qū)φ?GUS)慢病毒感染，產(chǎn)生穩(wěn)定克隆并測定穿過修飾基膜的浸潤。c.將原代前列腺上皮細胞(PrEC)按照指示用ETVl或LACZ腺病毒感染并測定浸潤。顯示了平均值(n = 3)+S.E。被浸潤細胞的顯微照片標(biāo)明在插圖中。d-e. LNCaP細胞中ETVl的siRNA擊倒使浸潤受到抑制。將LNCaP細胞只用轉(zhuǎn)染試劑處理(未處理)，或按照指示用非尋靶或ETVl siRNA轉(zhuǎn)染。d. ETVl擊倒通過qPCR得到證實(平均值(n = 4) +S.E.)。e.與b和c中相同評估細胞的浸潤(平均值(n = 3)+S. E.)。f.在Agilent全基因組微陣列上對RWPE-ETV1和RWPE-GUS細胞進行譜分析。顯示了與RWPE-GUS細胞相比，在RWPE-ETV1中過表達的基因的分子概念分析的網(wǎng)絡(luò)圖。每個節(jié)點表示分子概念、或生物相關(guān)基因的組。節(jié)點大小與概念中的基因數(shù)量成正比(例如“RWPE-ETV1”和“細胞外基質(zhì)”概念分別含有527和186個基因)。概念的顏色根據(jù)圖例表示概念類型。每條邊表示顯著富集(P < 0. 005)。g. qPCR證實在所選的參與浸潤的基因在RWPE-ETV1細胞中過表達浸潤。圖42顯示了在前列腺中表達ETVl基因融合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生小鼠前列腺上 皮內(nèi)瘤(mPIN)。a-f.ARR2Pb-ETVl前列腺的蘇木精和曙紅染色，用于形態(tài)學(xué)評估。c. b的高倍率圖，其中插圖顯示了 mPIN病灶中顯著的核。d.在3號ARR2Pb-ETVl小鼠(33周)的腹側(cè)前列腺(VP)中觀察到的正常腺體和mPIN灶。e. d的高倍率圖。f.顯示出正常上皮組織結(jié)構(gòu)以及mPIN的單一腺體。插圖顯示了由箭頭指示的mPIN灶。g_l.使用平滑肌肌動蛋白(SMA)進行的免疫組織化學(xué)證實了 g)良性腺體和h)所有mPIN病灶周圍連續(xù)的纖維肌層，同時基細胞標(biāo)志物i_j)細胞角蛋白5(CK5)和k-l)p63證實了在3號ARR2Pb-ETVl小鼠的背外側(cè)前列腺(DLP)中，在mPIN灶(j，l)中與正常腺體(i，k)相比失去了周圍基細胞。原始放大倍數(shù)對于a、b和d來說是IOOx,對于c和e_l來說是400x。圖43顯示了不同類型的染色體重排活化前列腺癌中的ETS癌基因。圖44顯示了 ETVl的過表達不影響增殖或轉(zhuǎn)化良性前列腺上皮細胞。a.將良性的永生化前列腺細胞系RWPE按照指示用ETVl或?qū)φ?GUS)慢病毒感染，產(chǎn)生穩(wěn)定克隆并測定增殖。b.將原代前列腺上皮細胞(PrEC)按照指示用ETVl或LACZ腺病毒感染并測定增殖。顯示了平均值(n = 3)+S. E.。結(jié)果代表了三次獨立實驗。c. ETVl過表達不增加S期中RWPE細胞的百分率。d. ETVl過表達不增加RWPE細胞的無貼壁依賴性生長。圖45顯示了 ETVl的shRNA擊倒抑制了在LNCaP細胞中的浸潤。a.如圖41e中所示，將對照LNCaP細胞或用表達非尋靶或ETVl shRNAmir的慢病毒感染的LNCaP細胞進行浸潤評估。顯示了平均值(n = 3)+S.E。b.來自a的被浸潤細胞的顯微照片。圖46顯示出ETVl的過表達導(dǎo)致增殖相關(guān)概念的表達降低。圖47顯示了在RWPE-ETV1細胞中過表達的浸潤相關(guān)基因的鑒定。a. RffPE-ETVl和RffPE-GUS細胞在Agilent全基因組微陣列上進行譜分析。b.鑒定RWPE-ETV1概念中和富集網(wǎng)絡(luò)的14個其他概念中的至少5個(由數(shù)字標(biāo)明)中存在的基因的疊加圖。圖48顯示了 ARR2Pb-ETVl小鼠的前列腺中mPIN區(qū)域中ARR2Pb_ETVl_FLAG表達的證實。a.4號ARR2Pb-ETVl小鼠的腹側(cè)前列腺(VP)的低倍率圖，其中良性區(qū)域和mPIN灶分別用黃色和黑色箭頭指示。b. a中指出的良性腺體的高倍率圖，顯示了缺乏ETV1-FLAG表達。c. a中指出的mPIN腺體的高倍率圖，證實了 ETV1-FLAG的表達。
圖49顯示了剝奪LNCaP細胞的雄激素調(diào)節(jié)了雄激素調(diào)控基因的表達。圖50顯示出在雄激素響應(yīng)性VCaP細胞系中R1881不誘導(dǎo)ETVl表達。圖51顯示了本發(fā)明另外的基因融合體的序列。圖52顯示了本發(fā)明其他的基因融合體的序列。圖53顯示了通過QPCR鑒定到兩個前列腺癌(PCa)病例顯示出ETV5異常表達。圖B顯示了通過RACE測定到的這兩個病例的融合轉(zhuǎn)錄物的結(jié)構(gòu)。
圖54顯示了用于在前列腺癌中進行ETS畸變的全面FISH篩選的方法示意圖。a)分裂探針FISH方法使用了側(cè)翼帶有ETS斷點的 IMb探針，并用于前列腺癌TMA以篩選涉及ETS家族基因的遺傳重排。b)來自基于FISH的前列腺癌篩查的可能結(jié)果。c)如果IMb分裂探針表明畸變，將緊接目標(biāo)基因兩側(cè)的探針(100 200Kb)應(yīng)用于組織切片以驗證由初始篩查所鑒定的畸變。d)對于ETS基因和已知5’配偶體兩者都重排的病例來說，執(zhí)行融合探針FISH測定以證實可能的基因融合；在只有ETS基因重排的病例中，使用RLM-RACE鑒定ETS基因的新5’配偶體。圖55a和b顯示了前列腺癌中ETS和5’融合配偶體畸變的匯總矩陣。圖56顯示了鑒定SLC45A3作為ERG的新的5’融合配偶體。a)用作間期FISH探針、5’和3’位于SLC45A3和ERG的BAC的示意圖。b)在福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片上使用具有所標(biāo)明的相應(yīng)熒光標(biāo)記物的BAC進行FISH，分別用于SLC45A3、ERG的分裂信號分析和5’與SLC45A3以及3’與ERG的融合。圖57顯示了前列腺癌中5’融合配偶體FLJ35294、CANTl和DDX5的鑒定。a)通過 5’ RACE 分析鑒定到的 FLJ35294-ETV1 (PCa_54)、CANT1-ETV4(PCa_46)和DDX5-ETV4 (PCa_85)融合物的示意圖?？蛑械臄?shù)字表示外顯子?？蛏系臄?shù)字指示每個外顯子的最后一個堿基。非翻譯區(qū)用較淺的陰影顯示(FLJ35294是預(yù)測的具有未表征的基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物)。b)前列腺癌中FLJ35294、CANT1和DDX5基因與28個其他癌癥類型相比的表達圖，所述其他癌癥類型是基于Oncomine數(shù)據(jù)組中獲取的國際基因組聯(lián)盟(InternationalGenomic Consortium) expOdata 組。圖58 顯示了通過 FISH 驗證 FLJ35294:ETV1、CANT1:ETV4 和 DDX5:ETV4 融合物。a)用作間期FISH探針、5’和3，位于ETV1、ETV4、FLJ5294和CANTl的BAC的示意圖。b-d)在福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片上使用具有所標(biāo)明的相應(yīng)熒光標(biāo)記物的BAC進行FISH，用于b)ETVl和ETV4的分裂信號測定，c)5’融合配偶體的分裂信號測定以及d)5’配偶體與ETVl或ETV4的融合。分裂信號由箭頭標(biāo)出，融合的信號用黃色箭頭標(biāo)出。圖59顯示了前列腺癌中FLJ35294和CANTl基因座的雄激素調(diào)控和DDX5:ETV4融合蛋白的表征。a)通過QPCR測定了良性前列腺和對FLJ35294-ETV1、CANT1-ETV4、DDX5-ETV4或SLC45A3:ERG陽性的前列腺癌病例中ERG、ETV1和ETV4的表達。b)將LNCaP細胞剝奪激素48小時，用R1881或乙醇對照處理，并通過Q-PCR測定FLJ35294、CANT1和DDX5轉(zhuǎn)錄物的表達。c)通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析評估相應(yīng)基因座處的AR富集值。d)上圖，通過DDX5的I到102位氨基酸與ETV4的65到484位氨基酸融合指示的DDX5-ETV4融合蛋白的示意圖。中圖，通過用PCDNA3. 2-DDX5-ETV4表達構(gòu)建物瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293細胞的免疫印跡分析，檢測帶有FLAG標(biāo)簽的DDX5-ETV4融合蛋白。下圖，在源自于帶有DDX5-ETV4基因融合體(PCa_85)的患者的組織裂解液中檢測內(nèi)源DDX5-ETV4融合蛋白(57kDa)。
定義為了便于理解本發(fā)明，下面對一些術(shù)語和詞組進行定義當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“基因融合體”是指嵌合的基因組DNA、嵌合的信使RNA、由第一個基因的至少一部分與第二個基因的至少一部分融合產(chǎn)生的截短蛋白或嵌合蛋白。基因融合體不必包括全部基因或基因外顯子。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“在癌癥中上調(diào)的基因”是指與其他組織中的水平相比，在癌癥(例如前列腺癌)中以更高水平表達(例如mRNA或蛋白表達)的基因。在某些實施方案中，在癌癥中上調(diào)的基因的表達水平比在其他組織中的表達水平高至少10 %、優(yōu)選至少25 %、更優(yōu)選至少50 %、更加優(yōu)選至少100 %、更加優(yōu)選至少200 %、最優(yōu)選至少300 %。 在某些實施方案中，在前列腺癌中上調(diào)的基因是“雄激素調(diào)控基因”。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“在前列腺組織中上調(diào)的基因”是指與其他組織中的水平相比，在前列腺組織中以更高水平表達(例如mRNA或蛋白表達)的基因。在某些實施方案中，在前列腺組織中上調(diào)的基因的表達水平比在其他組織中的表達水平高至少10%、優(yōu)選至少25 %、更優(yōu)選至少50 %、更加優(yōu)選至少100 %、更加優(yōu)選至少200 %、最優(yōu)選至少300 %。在某些實施方案中，在前列腺組織中上調(diào)的基因只在前列腺組織中表達。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“高表達啟動子”是指一種啟動子，當(dāng)其與基因融合時，弓丨起基因在特定組織(例如前列腺)中的表達水平與該基因不與所述高表達啟動子融合時的表達水平相比更高(例如高至少10%、優(yōu)選至少25%、更優(yōu)選至少50%、更加優(yōu)選至少100%,更加優(yōu)選至少200%、最優(yōu)選至少300%的水平)。在某些實施方案中，高表達啟動子是來自于雄激素調(diào)控基因或持家基因(例如HNRPA2B1)的啟動子。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)”是指包含有調(diào)節(jié)(例如上調(diào)或下調(diào))基因表達的序列的基因區(qū)域。在某些實施方案中，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包含基因的非編碼上游序列，也稱為5’非翻譯區(qū)(5，UTR)。在其他實施方案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)含有位于基因編碼區(qū)內(nèi)或內(nèi)含子內(nèi)的序列(例如增強子)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“雄激素調(diào)控基因”是指其表達受雄激素(例如睪酮)誘導(dǎo)或抑制的基因或基因部分。雄激素調(diào)控基因的啟動子區(qū)可以包含“雄激素響應(yīng)元件”，其與雄激素或雄激素信號傳導(dǎo)分子(例如下游信號傳導(dǎo)分子)相互作用。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“檢測”可以描述發(fā)現(xiàn)或分辨的一般性行動或可檢測標(biāo)記組合物的特別觀察。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“抑制基因融合體的至少一種生物活性”是指任何藥劑通過直接接觸基因融合體蛋白、接觸基因融合體mRNA或基因組DNA、引起基因融合體多肽的構(gòu)象變化、降低基因融合體蛋白水平或干擾基因融合體與信號傳導(dǎo)配偶體的相互作用、以及影響基因融合體靶基因的表達，從而降低了本發(fā)明的基因融合體的任何活性(例如包括但不限于本文描述的活性)。抑制還包括通過攔截上游信號傳導(dǎo)分子來間接調(diào)控基因融合體生物活性的分子。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“siRNA”是指小干擾RNA。在某些實施方案中，siRNA包含約18-25個核苷酸長的雙鏈體或雙鏈區(qū)；siRNA經(jīng)常在每條鏈的3’末端包含約2到4個未配對的核苷酸。siRNA的雙鏈體或雙鏈區(qū)的至少一條鏈與靶RNA分子基本上同源或基本上互補。與靶RNA分子互補的鏈?zhǔn)恰胺戳x鏈”；與靶RNA分子同源的鏈?zhǔn)恰坝辛x鏈”，其也與siRNA反義鏈互補。siRNA還可以包含其他序列；這些序列的非限制性實例包括連接序列或環(huán)，以及莖和其他折疊結(jié)構(gòu)。siRNA似乎在引發(fā)無脊椎動物和脊椎動物中的RNA干擾和引發(fā)植物中轉(zhuǎn)錄后基因沉默期間的序列特異性RNA降解中，起到關(guān)鍵中介的作用。術(shù)語“RNA干擾”或“RNAi ”是指通過siRNA來沉默或降低基因表達。它是動物和植物中序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，由在雙鏈區(qū)中與被沉默基因的序列同源的siRNA啟動。該基因?qū)τ谏矬w來說可以是內(nèi)源或外源的，可以整合存在于染色體中或存在于不整合到基因組中的轉(zhuǎn)染載體中。基因的表達被部分或完全抑制。也可以考慮RNAi來抑制靶RNA的功能；靶RNA的功能可以是完全的或部分的。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“癌癥階段”是指癌癥發(fā)展水平的定性或定量評估。用于確定癌癥階段的標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于腫瘤的大小和轉(zhuǎn)移程度(例如局限性或遠處)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)”是指將包含核酸序列的組合物遞送到細胞或組織的任何手段。例如，基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包括但不限于載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、 腺相關(guān)病毒和其他基于核酸的遞送系統(tǒng))、裸核酸的微注射、基于聚合物的遞送系統(tǒng)(例如基于脂質(zhì)體和基于金屬粒子的系統(tǒng))、基因槍注射等。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)”是指包含病毒元件(例如完整病毒、修飾病毒和病毒組分例如核酸或蛋白)以便于將樣品遞送到所需細胞或組織的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“腺病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)”是指包含屬于腺病毒科的完整或修改病毒的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“位點特異性重組靶序列”是指提供了重組因子的識別序列和發(fā)生重組的位置的核酸序列。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“核酸分子”是指任何含核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。該術(shù)語涵蓋了包含DNA和RNA的任何已知堿基類似物的序列，所述堿基類似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺嘌呤、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、次黃嘌呤、N6-異戊烯基腺嘌呤、I-甲基腺嘌呤、I-甲基假尿嘧啶、I-甲基鳥嘌呤、I-甲基次黃嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、
3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基甲基-2-硫尿嘧啶、^ -D-甘露糖基辮苷、5’ -甲氧基羰甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxos ine、假尿喃唳、辮苷、2-硫胞喃唳、5-甲基-2-硫尿喃唳、2_硫尿喃唳、4_硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、辮苷、
2-硫胞嘧啶和2，6- 二氨基嘌呤。術(shù)語“基因”是指包含產(chǎn)生多肽、前體或RNA(例如rRNA、tRNA)所需的編碼序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可以由全長編碼序列或由編碼序列的任一部分編碼，只要全長或片段的所需活性或功能性質(zhì)(例如酶活性、配體結(jié)合、信號傳導(dǎo)、免疫原性等)得以保留即可。該術(shù)語還涵蓋了結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和位于編碼區(qū)5’和3’兩個末端附近距任一端約Ikb以上的序列，以便基因?qū)?yīng)于全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)的5’方向并存在于mRNA上的序列被稱為5’非翻譯序列。位于編碼區(qū)3’方向或下游并存在于mRNA上的序列被稱為3’非翻譯序列。術(shù)語“基因”涵蓋了基因的cDNA和基因組兩種形式。基因的基因組形式或克隆含有被非編碼序列打斷的編碼區(qū)，所述非編碼序列被稱為“內(nèi)含子”或“居間區(qū)”或“居間序列”。內(nèi)含子是被轉(zhuǎn)錄成核RNA(hnRNA)的基因區(qū)段；內(nèi)含子可含有調(diào)控元件例如增強子。內(nèi)含子從核或原始轉(zhuǎn)錄物中被移除或“剪接掉”；因此在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中不存在內(nèi)含子。在翻譯過程中，mRNA起到指定新生多肽的氨基酸序列或次序的功能。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“異源基因”是指不在其天然環(huán)境中的基因。例如，異源基因包括來自于一個 物種而被導(dǎo)入另一物種的基因。異源基因還包括生物體固有的但已通過某些方式進行改變(例如突變、以多拷貝添加、與非固有調(diào)控序列相連等)的基因。異源基因與內(nèi)源基因的區(qū)別在于異源基因序列典型地與自然情況下沒有發(fā)現(xiàn)在染色體中與該基因序列有關(guān)聯(lián)的DNA序列相連，或與在自然情況下沒有發(fā)現(xiàn)的染色體部分相關(guān)聯(lián)(例如基因在該基因正常不表達的基因座中表達)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“寡核苷酸”是指長度短的單鏈多核苷酸鏈。寡核苷酸的長度典型小于200個殘基(例如15至100之間)，但是，當(dāng)在本文中使用時，該術(shù)語也打算涵蓋較長的多核苷酸鏈。寡核苷酸通常以其長度稱呼。例如，24個殘基的寡核苷酸被稱為“24聚體”。寡核苷酸可以通過自身雜交或與其他多核苷酸雜交形成二級和三級結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)可以包括但不限于雙鏈體、發(fā)夾、十字形、彎曲和三鏈體。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“互補”或“互補性”被用于指稱通過堿基配對規(guī)則相關(guān)聯(lián)的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“5’ -A-G-T-3’ ”與序列“3’ -T-C-A-5’ ”互補?；パa性可以是“部分的”，其中只有某些核酸堿基根據(jù)堿基配對規(guī)則匹配?；蛘撸诤怂嶂g也可以存在“完全”或“全部”互補性。核酸鏈之間的互補程度對核酸鏈之間的雜交效率和強度有顯著影響。這在擴增反應(yīng)以及依賴于核酸之間的結(jié)合的檢測方法中是特別重要的。術(shù)語“同源”是指互補程度?？梢源嬖诓糠滞椿蛲耆?即同一)。部分互補的序列是至少部分抑制完全互補的核酸分子與“基本上同源的”祀核酸雜交的核酸分子。完全互補的序列與靶序列雜交的抑制，可以在低嚴(yán)緊性條件下使用雜交測定方法(Southern或Northern印跡、溶液雜交等)來檢測。基本上同源的序列或探針將在低嚴(yán)緊性條件下競爭并抑制完全同源的核酸分子與靶的結(jié)合(即雜交)。這并不是說低嚴(yán)緊性條件是允許發(fā)生非特異性結(jié)合的條件；低嚴(yán)緊性條件需要兩個序列彼此的結(jié)合是特異性的(即選擇性的)相互作用。非特異性結(jié)合的不存在可以通過使用基本上不互補(例如同一性低于約30%)的第二個靶來測試；在不存在非特性結(jié)合的情況下，探針將不與第二個非互補靶雜交。當(dāng)用于指稱雙鏈核酸序列例如cDNA或基因組克隆時，術(shù)語“基本上同源的”是指在上述的低嚴(yán)緊性條件下能夠與雙鏈核酸序列的任一條或兩條鏈雜交的任何探針?；蚩梢援a(chǎn)生多種RNA，其由原始RNA轉(zhuǎn)錄物的差異剪接產(chǎn)生。cDNA是相同基因的剪接變體，將含有序列同一或完全同源的區(qū)域(表示在兩個cDNA上存在相同外顯子或相同外顯子的部分)和完全不同一的區(qū)域(例如，表示在cDNA I上存在外顯子“A”，而在cDNA2中代之以含有外顯子“B”)。因為兩個cDNA含有序列同一的區(qū)域，它們將都與含有在這兩個cDNA上發(fā)現(xiàn)的序列的完整基因或基因部分所衍生的探針雜交；因此這兩個剪接變體與該探針同源并彼此基本上同源。當(dāng)用于指稱單鏈核酸序列時，術(shù)語“基本上同源的”是指能夠在如上所述的低嚴(yán)緊性條件下與單鏈核酸序列雜交(即與其互補的)任何探針。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“雜交”被用于指稱互補核酸的配對。雜交和雜交強度(即核酸之間結(jié)合的強度)受到諸如下列因素的影響核酸之間的互補性程度、所涉及條件的嚴(yán)緊性、形成的雜交體的Tni、核酸中的G C比。在其結(jié)構(gòu)中含有互補核酸配對的單個分子，被稱為是“自身雜交的”。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“嚴(yán)緊性”被用于指稱用于執(zhí)行核酸雜交的溫度、離子強度和其他化合物例如有機溶劑的存在的條件。在“低嚴(yán)緊性條件”下，目標(biāo)核酸序列將與其完全互補序列、具有單堿基錯配的序列、密切相關(guān) 的序列(例如具有90%以上同源性的序列)以及只具有部分同源性的序列(例如具有50-90%同源性的序列)雜交。在“中嚴(yán)緊性條件”下，目標(biāo)核酸序列將只與其完全互補序列、具有單堿基錯配的序列和密切相關(guān)的序列(例如具有90%以上同源性的序列)雜交。在“高嚴(yán)緊性條件”下，目標(biāo)核酸序列將只與其完全互補序列以及(取決于條件例如溫度)具有單堿基錯配的序列雜交。換句話說，在高嚴(yán)緊性條件下，可以升高溫度以便排除與具有單堿基錯配的序列的雜交。當(dāng)在核酸雜交的情形中使用時，“高嚴(yán)緊性條件”包含與下述條件等價的條件，SP當(dāng)使用長度約為500個核苷酸的探針時，在42°C下、在由5XSSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/lNaH2PO4 H2O 和 I. 85g/l EDTA，用 NaOH 將 pH 調(diào)整到 7. 4)、0. 5% SDS、5X Denhardt 試劑和100 yg/ml變性鮭魚精子DNA構(gòu)成的溶液中結(jié)合或雜交，然后在包含0. IX SSPEU.0% SDS的溶液中在42°C下清洗。當(dāng)在核酸雜交的情形中使用時，“中嚴(yán)緊性條件”包含與下述條件等價的條件，SP當(dāng)使用長度約為500個核苷酸的探針時，在42°C下、在由5XSSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/lNaH2PO4 H2O 和 I. 85g/l EDTA，用 NaOH 將 pH 調(diào)整到 7. 4)、0. 5% SDS、5X Denhardt 試劑和100 u g/ml變性鮭魚精子DNA構(gòu)成的溶液中結(jié)合或雜交，然后在包含I. OX SSPEU. 0% SDS的溶液中在42°C下清洗?！暗蛧?yán)緊性條件”包含與下述條件等價的條件，即當(dāng)使用長度約為500個核苷酸的探針時，在 42°C下、在由 5X SSPE(43. 8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4 H2O 和 I. 85g/l EDTA，用NaOH 將 pH 調(diào)整到 7. 4) ,0. 1% SDS、5X Denhardt 試劑[50X Denhardt 試劑每 500ml 含有5g Ficoll (400 型,Pharamcia)、5g BSA (級分 V ；Sigma)]和 100 u g/ml 變性鮭魚精子 DNA構(gòu)成的溶液中結(jié)合或雜交，然后在包含5X SSPE、0. 1% SDS的溶液中在42 °C下清洗。本技術(shù)領(lǐng)域熟知可以使用許多等價條件來構(gòu)成低嚴(yán)緊性條件；考慮多種因素，例如探針的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和靶的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成，存在于溶液中或固定化等)以及鹽和其他組分的濃度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)，并且可以改變雜交溶液以產(chǎn)生與上面列出的條件不同但是等價的低嚴(yán)緊性雜交條件。此外，本技術(shù)領(lǐng)域已知在高嚴(yán)緊性條件下促進雜交的條件(例如升高雜交和/或清洗步驟的溫度，在雜交溶液中使用甲酰胺等)(參見上面對“嚴(yán)緊性”的定義)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“擴增寡核苷酸”是指與靶核酸或其互補鏈雜交并參與核酸擴增反應(yīng)的寡核苷酸。擴增寡核苷酸的實例是與模板核酸雜交并含有在擴增過程中被聚合酶延伸的3’OH末端的“引物”。擴增寡核苷酸的另一個實例是不被聚合酶延伸(例如因為它具有3’封閉末端)但是參與或促進擴增的寡核苷酸。擴增寡核苷酸可以任選包括修飾的核苷酸或類似物，或參與擴增反應(yīng)但是不與靶核酸互補或不包含在靶核酸中的其他核苷酸。擴增寡核苷酸可以含有不與靶或模板序列互補的序列。例如，引物的5’區(qū)域可以包括不與靶核酸互補的啟動子序列(被稱為“啟動子-引物”)。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會理解，起引物作用的擴增寡核苷酸可以被修飾以包含5’啟動子序列，并因此起到啟動子-引物的作用。同樣，啟動子-引物可以通過除去啟動子序列或合成為沒有啟動子序列進行修飾，并仍起到引物的作用。3’封閉的擴增寡核苷酸可以提供啟動子序列并用作聚合的模板(被稱為“啟動子提供者”)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“引物”是指在純化的限制性消化物中天然存在的或合成產(chǎn)生的寡核苷酸，當(dāng)其被置于能夠誘導(dǎo)與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下(即在核苷酸和誘導(dǎo)劑例如DNA聚合酶存在下并在適合的溫度和pH下)時,能夠起到合成起始點的作用。引物優(yōu)選為單鏈以使擴增效率最高，但是也可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，引物在用于制備延伸產(chǎn)物之前首先進行處理以將其鏈分開。優(yōu)選，引物是寡脫氧核糖核苷酸。為了在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成，引物必須足夠長。引物的具體長度取決于許多因素，包括溫度、引物來源和使用的方法。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“探針”是指在純化的限制性消化物中天然存在的或合成、重組或通過PCR擴增產(chǎn)生的寡核苷酸(即核苷酸序列)，其能夠與另一個目標(biāo)寡核苷酸的至少一部分雜交。探針可以是單鏈或雙鏈的。探針可用于檢測、鑒定和分離特定基因序列。設(shè)想了在本發(fā)明中使用的任何探針可以用任何“報告分子”標(biāo)記，以便可以在任何檢測系統(tǒng)中檢測，包括但不限于酶(例如ELISA以及基于酶的組織化學(xué)測定法)、熒光、放射活性和發(fā)光系統(tǒng)。不打算將本發(fā)明限于任何特定檢測系統(tǒng)或標(biāo)記物。術(shù)語“分離的”，當(dāng)涉及核酸使用時，像“分離的寡核苷酸”或“分離的多核苷酸”，是指被鑒定并與其在天然來源中通常相伴的至少一種組分或污染物分離開的核酸序列。分離的核酸以與其在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式或環(huán)境不同的形式或環(huán)境中存在。相反，未分離的核酸是以其在自然界中存在的狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)的核酸例如DNA和RNA。例如，給定的DNA序列(例如基因)，在宿主細胞染色體上相鄰基因附近被發(fā)現(xiàn)；RNA序列，例如編碼特定蛋白的特定mRNA序列，在細胞中作為與編碼大量蛋白的許多其他mRNA的混合物而被發(fā)現(xiàn)。但是，編碼給定蛋白的分離的核酸包括，例如，在正常表達給定蛋白的細胞中處于與天然細胞中不同的染色體位置中的核酸，或側(cè)翼帶有與自然界中發(fā)現(xiàn)的不同的核酸序列的核酸。分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以采取單鏈或雙鏈形式存在。當(dāng)分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸將被用于表達蛋白時，所述寡核苷酸或多核苷酸將至少含有有義或編碼鏈(即寡核苷酸或多核苷酸可以是單鏈的)，但也可以含有有義和反義鏈(即寡核苷酸或多核苷酸可以是雙鏈的)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“純化的”或“純化”是指從樣品中移除組分(例如污染物)。例如，抗體通過移除污染性非免疫球蛋白的蛋白進行純化；它們也可以通過移除不與靶分子結(jié)合的免疫球蛋白進行純化。移除非免疫球蛋白的蛋白和/或移除不與靶分子結(jié)合的免疫球蛋白導(dǎo)致樣品中靶反應(yīng)性免疫球蛋白的百分率增加。在另一個實例中，將重組多肽在細菌宿主細胞中表達，并通過移除宿主細胞的蛋白對多肽進行純化；從而增加了樣品中重組多肽的百分率。發(fā)明詳述本發(fā)明是基于在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的復(fù)現(xiàn)性基因融合體。本發(fā)明提供了直接或間接檢測或靶向該基因融合體的診斷、研究和治療方法。本發(fā)明還提供了用于診斷、研究和治療目的的組合物。I.基因融合體
本發(fā)明鑒定了指示前列腺癌的復(fù)現(xiàn)性基因融合體。該基因融合體是雄激素調(diào)控基因(ARG)或持家基因(HG)與ETS家族成員基因的染色體重排的結(jié)果。盡管它們有復(fù)現(xiàn)性，但ARG或HG與ETS家族成員基因融合的連接處可變。該基因融合體典型地包含來自ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’部分和來自ETS家族成員基因的3’部分。復(fù)現(xiàn)性基因融合體可用作前列腺癌的診斷標(biāo)志物和臨床靶。A.雄激素調(diào)控基因 受雄性激素調(diào)控的基因?qū)τ谌祟惽傲邢俚恼Ｉ砉δ苁侵陵P(guān)重要的。它們也造成了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展。已識別的ARG包括但不限于TMPRSS2，SLC45A3，HERV-K_22qll.23, C150RF21, FLJ35294, CANTI, PSA, PSMA, KLK2, SNRK, Seladin-I 和FKBP51 (Paoloni-Giacobino 等，Genomics 44:309(1997) ；Velasco 等，Endocrinology145(8) :3913(2004)))。已證實相對于其他正常人類組織，TMPRSS2(NM_005656)在前列腺上皮中高度表達(Lin 等，Cancer Research 59:4180(1999))。TMPRSS2 基因位于 21 號染色體上。該基因位于距 pter 41，750，797-41，801，948bp 處(總共 51，151bp ;負鏈走向)。人類 TMPRSS2 蛋白序列可見于GenBank登記號AAC51784 (Swiss蛋白登記號015393),相應(yīng)的cDNA的GenBank登記號為 U75329 (也參見 Paoloni-Giacobino 等，Genomics 44 :309 (1997))。SLC45A3,也稱為prostein或P501S，已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄物和蛋白兩種水平上顯示出專一在正常前列腺和前列腺癌中表達(Kalos等，Prostate 60, 246-56 (2004) ;Xu等，CancerRes 61,1563-8(2001))。通過EST分析和大規(guī)模平行測序，發(fā)現(xiàn)HERV_K_22qll. 23是人類內(nèi)源反轉(zhuǎn)錄病毒元件的HERV-K家族的表達第二強的成員，并且與其他正常組織相比，在前列腺中表達最高(Stauffer等，Cancer Immun 4,2(2004))。盡管還沒有描述HERV-K元件的雄激素調(diào)控，但已經(jīng)顯示內(nèi)源反轉(zhuǎn)錄病毒元件對小鼠的性連鎖蛋白基因C4A賦予了雄激素響應(yīng)性(Stavenhagen等，Cell 55，247-54 (1988))。其他HERV-K家族成員已顯示出在乳腺癌和乳腺癌細胞系中高表達并且受雌激素調(diào)控(Ono等，J Virol 61，2059-62 (1987) ；Patience等，J Virol 70,2654-7(1996) ;Wang-Johanning 等，Oncogene 22，1528-35 (2003))，并且在具有t(8;19) (pl2 ；ql3. 3)的干細胞骨髓增殖性障礙病例中，來自19號染色體上的HERV-K3 元件的序列與 FGFRl 融合(Guasch 等，Blood 101，286-8 (2003))。C150RF21，也稱為D-PCA-2，最初是基于它專一在正常前列腺和前列腺癌中過表達而被分離(Weigle 等，Int J Cancer 109,882-92(2004))。FLJ35294被鑒定為“全長長日本”(full-length long Japan,FLJ)集合中被測序的人類 cDNA 的成員(Nat Genet. 2004 Jan ；36(1) :40-5. Epub 2003 Dec 21)。CANTl，也稱為sSCANl，是可溶性鈣活化的核苷酸酶(Arch Biochem Biophys. 2002Oct I ；406(1) :105-15)。CANTl是371個氨基酸的蛋白?？汕懈畹男盘栯漠a(chǎn)生333個殘基的分泌蛋白，預(yù)測的核心分子量為37，193Da。Northern分析在各種人類組織中鑒定到轉(zhuǎn)錄物，包括睪丸、胎盤、前列腺和肺。在該人類的酶中沒有鑒定到傳統(tǒng)的腺苷三磷雙磷酸酶保守區(qū)域或核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，表明其在新的細胞外核苷酸酶家族中的成員身份。本發(fā)明的基因融合體可以包含ARG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。ARG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可以包含ARG的編碼或非編碼區(qū)，包括啟動子區(qū)。ARG的啟動子區(qū)還可以包含ARG的雄激素響應(yīng)元件(ARE)。具體來說，TMPRSS2的啟動子區(qū)由GenBank登記號AJ276404所提供。B.持家基因持家基因是組成性表達的，并且一般在所有組織中遍在表達。這些基因編碼的蛋白提供了所有細胞存活所需的基本的、必需的功能。持家基因通常在所有細胞和組織中以相同水平表達，但是具有一些變動，特別是在細胞生長和組織發(fā)育的過程中。還未確切了解人類細胞具有多少持家基因，但是大多數(shù)人估計在300-500個的范圍內(nèi)。已經(jīng)鑒定到數(shù)百個之多的持家基因。最常見的已知基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)，編碼對糖酵解途徑至關(guān)重要的酶。另一個重要的持家基因是白蛋白，其協(xié)助在整個身體中運輸化合物。幾個持家基因編碼構(gòu)成細胞骨架的結(jié)構(gòu)蛋白，例如￠-肌動蛋白和微管蛋白。其他持家基因編碼核糖體的18S或28S rRNA亞基。HNRPA2B1是遍在表達的異核核糖核蛋白的成員。其啟動子已被顯示是未甲基化的，并防止轉(zhuǎn)基因中CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄沉默(Williams等，BMC Biotechnol 5，17(2005))。持家基因的示例性名單可以在例如 Trends in Genetics, 19, 362-365 (2003)中發(fā)現(xiàn)。C. ETS家族成員基因轉(zhuǎn)錄因子的ETS家族調(diào)控控制基因表達的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑。作為下游效應(yīng)子，它們活化或阻遏特定靶基因。作為上游效應(yīng)子，它們負責(zé)眾多生長因子受體的時空表達。已經(jīng)鑒定到該家族的接近30個成員，它們涉及廣泛的生理和病理過程。這些成員包括但不限于ERG, ETVl (ER81), FLI I, ETSl，ETS2, ELKl，ETV6 (TELl), ETV7 (TEL2), GABP a，ELFl, ETV4(E1AF、PEA3)，ETV5 (ERM), ERF，PEA3/E1AF, PU.1，ESE1/ESX, SAPl (ELK4)，ETV3(METS), EWS/FLI1, ESEl, ESE2 (ELF5)，ESE3, PDEF，NET(ELK3、SAP2)，NERF(ELF2)和FEV0實例性的ETS家族成員序列提供在圖9中。ERG(NM_004449)已被證實在前列腺上皮中相對于其他正常人類組織高表達。ERG基因位于21號染色體上。該基因位于距pter 38，675，671-38，955，488堿基對處。ERG基因總共279，817bp，為負鏈走向。相應(yīng)的ERG cDNA和蛋白序列分別提供在GenBank登記號M17254 和 NP04440 (Swiss 蛋白登記號 P11308)中。ETVl 基因位于 7 號染色體上(GenBank 登記號 NC_000007. 11、NC_086703. 11和 NT_007819. 15)?；蛭挥诰?pter 13，708330-13，803，555 堿基對處。ETVl 基因總計95，225bp，為負鏈走向。相應(yīng)的ETVl cDNA和蛋白序列分別提供在GenBank登記號NM_004956 和 NP_004947 (Swiss 蛋白登記號 P50549)中。人類ETV4 基因位于 14 號染色體上(GenBank 登記號 NC_000017. 9、NT_010783. 14和 NT_086880. I)?；蛭挥诰?pter 38，960，740-38，979，228 堿基對處。ETV4 基因總計18，488bp，為負鏈走向。相應(yīng)的ETV4 cDNA和蛋白序列分別提供在GenBank登記號NM_001986 和 NP_01977 (Swiss 蛋白登記號 P43268)中。人類ETV5 基因位于 3 號染色體上 3q28 處(NC_000003. 10 (187309570. . 187246803))。相應(yīng)的ETV5 mRNA和蛋白序列分別提供在GenBank登記號NM_004454和CAG33048中。D. ETS基因融合體包括最初鑒定的TMPRSS2:ETS基因融合體，在前列腺癌中已經(jīng)鑒定到5類ETS重排(圖43)。本發(fā)明不限于特定機制。事實上，對于實踐本發(fā)明來說不需要理解機制。然而，設(shè)想了 ETS家族成員在癌癥中通過與ARG或HG融合或插入到表達增加的基因座中而引起上調(diào)表達，為前列腺癌提供了一種機制。了解具體個體中存在的重排類型允許對癌癥療法進行定制。I.基因重排類型TMPRSS2:ETS基因融合(I類)代表了前列腺癌中ETS重排的主要類型。涉及與來自其他前列腺特異性雄激素誘導(dǎo)基因的非翻譯區(qū)的融合(IIa類)和內(nèi)源反轉(zhuǎn)錄病毒元件的融合(IIb類)的重排，分別例如SLC45A3和HERV-K_22qll. 23，在功能上與ETS重排中的TMRPSS2類似。與I類和II類重排中的5’配偶體相似，C150RF21在前列腺癌中顯著過表達。然而，與I類和II類重排中的融合配偶體不同，C150RF21被雄激素抑制，代表了一類新 的涉及前列腺特異性雄激素抑制的5’融合配偶體的ETS重排(III類)。相反，HNRPA2B1不顯示前列腺特異性表達或雄激素響應(yīng)性。因此，HNRPA2B1:ETV1代表了一類新的ETS重排(IV類)，其中涉及非組織特異性啟動子元件的融合驅(qū)動了 ETS表達。在V類重排中，整個ETS基因重排到前列腺特異性區(qū)域?；加型砥谇傲邢侔┑哪行酝ǔＳ眯奂に貏儕Z療法進行治療，常常引起腫瘤消退。但是具有激素抗拒表型的癌癥的進展幾乎不變。因為IV類重排(例如HNRPA2B1:ETV1)由雄激素不敏感的啟動子元件驅(qū)動，結(jié)果表明這些患者可能不響應(yīng)抗雄激素療法，因為這些基因融合體對雄激素剝奪沒有響應(yīng)性。具有III類重排的患者的抗雄激素治療可能增加ETS融合體表達。例如，從患有激素抗拒性轉(zhuǎn)移前列腺癌的患者分離到C150RF21:ETV1，在該患者中抗雄激素治療增加了 C150RF21:ETV1表達。支持這一假說的是，LNCaP的雄激素饑餓顯著降低了內(nèi)源PSA和TMPRSS2的表達，對HNRPA2B1沒有影響，并增加了 C150RF21的表達(圖49)。這允許根據(jù)存在的融合體類型，為患有前列腺癌的男性定制療法(例如選擇雄激素阻斷治療或其他備選療法)。前列腺癌中的多種基因重排類型表明染色體重排在常見上皮癌中的更普遍的作用。例如，在其他激素驅(qū)動型癌癥中組織特異性啟動子元件可以與癌基因融合，例如在乳腺癌中雌激素響應(yīng)性元件與癌基因融合。此外，盡管前列腺特異性融合(i-iii、v類)在其他上皮癌中不提供生長優(yōu)勢并且不被選擇，但涉及遍在表達基因例如HNRPA2B1的強啟動子的融合體，導(dǎo)致癌基因遍及腫瘤類型的異常表達?？偠灾?，該研究支持了染色體重排在常見上皮細胞腫瘤發(fā)展中通過類似于血液癌的各種機制起作用癌。2.ARG/ETS基因融合體正如上面描述的，本發(fā)明提供了 ARG與ETS家族成員基因的融合體。示例性基因融合體序列提供在圖36、51和52中。對于TMPRSS2、ERG、ETVl和ETV4來說，提供了GenBank參比序列ID，并使用2004年5月UCSC人類基因組的裝配圖對外顯子進行比對。對于所有鑒定的融合體來說，圖36提供了從TMPRSS2基因開始通過融合體到ETS家族成員基因的終止密碼子的完整序列。還提供了每個已發(fā)表變體的保藏的GenBank序列。某些TMPRSS2:ERG和TMPRSS2:ETV1融合體通過TMPRSS2和ETS家族成員基因的斷裂點外顯子描述。例如TMPRSS2:ERGa將TMPRSS2的外顯子I與ERG的外顯子4到11融合，其被鑒定為TMPRSS2:ERG(1，4)。在前列腺癌中，某些基因融合體比其他的更常見。本發(fā)明鑒定到50-80%的前列腺癌具有TMPRSS2與ERG、ETVU ETV4或FLIl的復(fù)現(xiàn)性基因融合體。其中，50-70%是TMPRSS2-ERG，其中50% -60%來自于21號染色體上TMPRSS2與ERG基因座之間遺傳信息的缺失(在下面更詳細描述)，5-10%是TMPRSS2-ETV1，1_2 %是TMPRSS2-ETV4，1_2%是TMPRSS2-FLI1。在開發(fā)本發(fā)明的過程中進行的實驗表明，某些融合基因表達融合轉(zhuǎn)錄物，而其他則不表達有功能的轉(zhuǎn)錄物(Tomlins 等，Science, 310 :644-648 (2005) ；Tomlins 等，CancerResearch 66:3396-3400(2006))。a. ERG基因融合體如上所述，發(fā)現(xiàn)包含ERG的基因融合體是前列腺癌中最常見的基因融合體。在開發(fā)本發(fā)明的過程中進行的實驗鑒定到位于染色體21q22. 2-3上TMPRSS2和ERG之間的顯著基因組缺失。在TMPRSS2:ERG融合體陽性的PCA樣品中觀察到缺失。缺失出現(xiàn)在共有區(qū)域中，但是在該區(qū)域內(nèi)顯示出可變性。在Paris等以前發(fā)表的工作中(Hum. Mol. Genet. 75 :1303-13 (2004))，CGH分析在CTD-210307BAC中檢測到距TMPRSS2著絲粒方向6kb的缺失。 ^ 12. 5% (9/72)的臨床局限性PCA樣品和33% (5/15)的轉(zhuǎn)移PCA樣品中觀察到這些缺失。這些結(jié)果支持來自本研究的SNP陣列數(shù)據(jù)，并表明PCA缺失隨著發(fā)展變得更常見，或者在傾向于發(fā)展更快的PCA中更經(jīng)常鑒定到這些缺失。由于TMPRSS2:ERG重排的顯著的腫瘤內(nèi)均勻性，更可能這些分子亞型與不同的疾病發(fā)展特征相關(guān)聯(lián)。評估了 118個臨床局限性PCA病例，其中49. 2%帶有ERG的重排。在60.3%的這些TMPRSS2: ERG融合體陽性病例中觀察到內(nèi)含子缺失。幾乎所有具有顯著ERG過表達的PCA樣品都具有重排，并且發(fā)生過表達和重排的病例數(shù)量大致相同。使用Oncomine，其是可公開獲得的基因表達數(shù)據(jù)概覽，鑒定到位于常見缺失位點區(qū)域中的4個顯著下調(diào)的基因(圖16)。本發(fā)明不限于具體的機制。事實上，對于實踐本發(fā)明來說，對機制的理解不是必需的。然而，結(jié)果表明所有PCA中幾乎一半可以確定為TMPRSS2:ERG重排。這些腫瘤的絕大部分顯示了內(nèi)含子缺失，其根據(jù)寡核苷酸SNP陣列基因組分析在尺寸上是可變的。然而，約30-40%沒有顯示缺失，因此可能帶有TMRPSS2與ERG的平衡易位。這種缺失程度的可變性可能與疾病發(fā)展相關(guān)，正如對于CML所觀察到的。目前的研究鑒定到與腫瘤階段和淋巴結(jié)狀態(tài)的顯著臨床關(guān)聯(lián)性。具有缺失的TMPRSS2:ERG重排腫瘤還顯示出PSA生化失敗率更高的趨勢。在開發(fā)本發(fā)明的過程中進行的其他實驗，根據(jù)在長期隨訪下的早期前列腺癌的觀察等待組群中TMPRSS2:ERG基因融合體的存在，考察發(fā)生轉(zhuǎn)移或前列腺癌特異性死亡的風(fēng)險。使用92個病例估計了 TMPRSS2:ERG基因融合體的頻率。在該基于群體的組群中TMPRSS2:ERG基因融合體的頻率是15. 2% (14/92)，低于在兩個基于住院的組群中觀察到的50%的頻率。本發(fā)明不限于具體的機制。事實上，對于實踐本發(fā)明來說，對機制的理解不是必需的。然而，TMPRSS2:ERG基因融合如列腺癌中的這種差異可能是由于民族和人種遺傳差異。這些差異也可以通過在該觀察等待組群與其他非基于群體的研究中相比高級別病例的百分率較低來解釋。觀察到TMPRSS2:ERG基因融合體與發(fā)生遠距離轉(zhuǎn)移和前列腺癌特異性死亡之間的顯著關(guān)聯(lián)性，累積發(fā)病率為3.6(P = .004，95%置信區(qū)間=I. 5至8. 9)。這些數(shù)據(jù)表明TMPRSS2:ERG基因融合前列腺癌具有具有更為浸潤性的表型。進一步的實驗表明，TMPRSS2:ERG基因融合體中的基因組缺失與晚期和/或轉(zhuǎn)移前列腺癌相關(guān)(參見例如實施例5)。本發(fā)明還證實了雄激素能夠在TMPRSS2-ERG陽性細胞系中，假設(shè)通過ARE，誘導(dǎo)ERG的過表達。本發(fā)明不限于具體的機制。事實上，對于實踐本發(fā)明來說，對機制的理解不是必需的。然而，總起來說，結(jié)果表明ETS家族活性通過TMPRSS2上游的ARE的異常調(diào)節(jié)，可能驅(qū)動了前列腺癌發(fā)展。b. ETVl基因融合體在開發(fā)本發(fā)明的某些實施方案的過程中進行的其他研究調(diào)查了 ETVl異常表達頻率與TMPRSS2:ETV1陽性前列腺癌之間的不一致性。結(jié)果證實了以前研究鑒定的TMPRSS2:ERG基因融合體是在前列腺癌中驅(qū)動ERG過表達的主要機制。然而，在三個過表達ETVl的前列腺癌中，鑒定到新的5’融合配偶體。本發(fā)明不限于具體的機制。事實上，對于 實踐本發(fā)明來說，對機制的理解不是必需的。然而，對于參與ERG和ETVl融合的5’配偶體中這種不一致的原因還不清楚，然而由于TMPRSS2和ERG在21號染色體上的位置相隔約 3MB，因此它們的接近可能有利于TMPRSS2作為ERG的5’配偶體。在轉(zhuǎn)基因小鼠中ETVl在雄激素調(diào)控下的過表達，在小鼠前列腺中產(chǎn)生高滲透性mPIN(12個中的9個，75% )。沒有觀察到癌的發(fā)生。這些結(jié)果支持了體外研究，其中ETVl的過表達增加了浸潤良性前列腺上皮細胞，但是不足以轉(zhuǎn)化，并且以前的研究表明在人類中，ETS融合可能發(fā)生在PIN向癌轉(zhuǎn)變期間或前列腺癌發(fā)展的早期(Tomlins等，NatGenet 39,41-51(2007)).本發(fā)明不限于具體的機制。事實上，對于實踐本發(fā)明來說，對機制的理解不是必需的。然而，設(shè)想了在人類前列腺癌發(fā)生中，ETS基因融合出現(xiàn)在較早病變例如失去單個NKX3-1和/或PTEN等位基因的背景中(Tomlins等，Annual Review ofPathology Mechanisms of Disease 1,243-271(2006))。此外，在沒有早期發(fā)展到癌的ETVl轉(zhuǎn)基因小鼠中mPIN的發(fā)生，與人類前列腺癌中這些其他早期事件的小鼠模型相似，例如 NKX3-1+/-和 PTEN+/-小鼠(Kim 等，Proc Natl Acad Sci U S A 99，2884-9 (2002)；Abdulkadir 等，Mol Cell Biol 22，1495-503(2002) ；Di Cristofano 等，Nat Genet 27，222-4(2001))。因此，設(shè)想了 ARR2Pb-ETVl小鼠與這些小鼠之間的雜交將產(chǎn)生模擬人類前列腺癌發(fā)生中的早期事件的癌基因/腫瘤抑制物模型。為了鑒定在RWPE-ETVI中受ETVl調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序，將表達特征裝載在分子概念圖
(Molecular Concepts Map)-一種用于探索分子概念或生物學(xué)相關(guān)基因組集的不斷增
加的集合中相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的分析框架中。除了是用于關(guān)聯(lián)性分析的基因組集的最大集合之夕卜，MCM的獨特之處在于計算數(shù)據(jù)庫中所有基因組集之間的成對關(guān)聯(lián)性，允許鑒定和顯示關(guān)聯(lián)概念的“富集網(wǎng)絡(luò)”。該分析顯示，在具有ETVl異常表達的前列腺癌中過表達的基因的體內(nèi)特征，與沒有ETS基因異常表達的癌癥中相比，富集(P = 0. 003)在RWPE-ETV1細胞中過表達的基因的體外特征中(圖41f)，支持了體外模型的生物學(xué)關(guān)聯(lián)性。更普遍來說，MCM分析鑒定到與細胞浸潤相關(guān)的分子概念的網(wǎng)絡(luò)，所述分子概念是在ETVl過表達特征中富集到的，與本報告中描述的表型效應(yīng)相符。例如，特征共同富集了概念，這些概念代表了在浸潤性膀胱癌中相對于淺表性膀胱移行細胞癌中過表達的基因(Modlich等，P = 2. 9E-14，Dyrskjot等，P =I. 2E-8)29，30，以及在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌中相對于原位導(dǎo)管癌中過表達的基因(Schuetz等，P = 3. 8E-13)。更直接來說,特征共同富集了 InterPro蛋白概念,所述蛋白含有“肽酶MlOA和M12B、基質(zhì)蛋白酶或adamalysin結(jié)構(gòu)域”(P = 8. 5E-5)，其包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域(ADAM)。 幾種MMP和尿激酶纖溶酶原活化途徑的成員在RWPE-ETV1細胞中過表達(圖41g)，這兩者已知都介導(dǎo)浸潤并據(jù)報道是ETS轉(zhuǎn)錄因子的直接靶。此外，“在RWPE-ETV1中過表達”這一特征，與在過表達STAT3-C癌基因的MCF-10A細胞中過表達的基因特征共有重疊之處(P = 8. 9E-14)。在該模型中，STAT3-C過表達不影響增殖，但是增加了以MMP9依賴性方式進行的浸潤。該結(jié)果也與尤文氏(Ewing’ s)肉瘤中EWSRl :ETS基因融合的研究平行，所述研究證實了 EWS:FLI1的擊倒或過表達影響浸潤，但是不影響增殖(Smith等，Cancer Cell 9，405-16 (2006))。RWPE-ETV1特征低表達的MCM分析顯示出富集了增殖相關(guān)概念(圖50)，表明了在FACS或增殖測定法中對細胞增殖的微妙影響不明顯。本研究還論證了使用異?；虮磉_指導(dǎo)細胞遺傳學(xué)研究的用途。例如，盡管存在大量核型分析、SKY和高分辨率陣列CGH研究，但在最常用的前列腺癌體外模型LNCaP中還沒有報道隱蔽性 ETVl 重排(Beheshti 等，Mol Diagn 5，23-32 (2000) ；Beheshti 等，Neoplasia 3,62-9(2001) ;Gibas等，Cancer Genet Cytogenet 11,399-404(1984) ；ffatson等，Hum Genet 120，795-805 (2007) ；Pang 等，Prostate 66，157-72 (2006) ；Murillo 等，Genes Chromosomes Cancer 45,702-16 (2006) ；Shi 等，Prostate 60,257-71 (2004)；Takaha 等，Cancer Res 62,647-51(2002) ;Strefford 等，Cancer Genet Cytogenet 124，112-21 (2001) ;Thalmann 等，Cancer Res 54, 2577-81 (1994)) 同樣地，TMPRSS2:ERG 融合往往由21q上TMPRSS2與ERG之間的染色體內(nèi)缺失引起，其不能通過核型分析檢測。同樣，本文中鑒定的HNRPA2B1:ETV1融合也通過跨幅約15MB的染色體內(nèi)缺失產(chǎn)生。這些結(jié)果表明在其他常見上皮癌中可能發(fā)生癌基因活化的隱蔽性重排和染色體內(nèi)缺失。C.ETV4基因融合體進行了實驗以審查在Oncomine數(shù)據(jù)庫的前列腺癌情況研究中監(jiān)測到的所有ETS家族成員的表達(Rhodes等，同上)。從兩項研究一項分析大體解剖組織的情況(Lapointe等，同上)(圖7A)、另一項分析激光捕獲顯微切割(LMC)組織1(圖7B)的情況的每一項中，在單一前列腺癌病例中鑒定到ETS家族成員ETV4的顯著過表達。發(fā)現(xiàn)在癌性組織中ETV4與TMPRSS2融合。d.ETV5基因融合體其他實驗鑒定到TMPRSS2:ETV5和SLC45A3:ETV5基因融合體(實施例20)。發(fā)現(xiàn)ETV5在前列腺癌樣品中具有異常表達，并隨后發(fā)現(xiàn)其存在于基因融合體中。3.HG/ETS基因融合體其他實驗鑒定了前列腺癌中的FINRPA2B1:ETV1基因融合體。FINRPA2B1不顯示前列腺特異性表達或雄激素調(diào)控，并且反倒是在所有腫瘤類型中強烈表達。FINRPA2B1編碼遍在表達的異型核核糖核蛋白的成員，并且其啟動子與其他持家基因具有結(jié)構(gòu)相似性(Antoniou 等，Genomics 82，269-79 (2003))。此外，已顯示 FINRPA2B I 啟動子未被甲基化，并在轉(zhuǎn)基因中阻止CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄沉默(Williams等，BMC Biotechnol 5,17 (2005) ) 因此，HNRPA2B1:ETV1代表了常見上皮癌中一類新的基因融合體，其中非組織特異性啟動子元件驅(qū)動癌基因的表達。盡管MPRSS2:ETS融合體在功能上類似于B細胞惡性腫瘤中的IGH-MYC重排，但HNRPA2B1:ETVl更類似于急性粒細胞白血病中的inv(3) (q21q26)和t (3 ;3) (q21 ;q26)，它們被認(rèn)為導(dǎo)致將EVlI置于組成性表達的RPNl基因的增強子元件控制之下(Suzukawa 等，Blood 84,2681-8 (1994) ;Wieser 等，Leuk Lymphoma 43,59-65(2002))。設(shè)想了其他常見上皮癌由組織特異性啟動子元件驅(qū)動，例如乳腺癌中與癌基因融合的雌激素響應(yīng)性元件。此外，盡管在本文中鑒定到的前列腺特異性融合體(例如SLC45A3:ETV1)在其他上皮癌中不提供生長優(yōu)勢，但設(shè)想包含遍在表達基因例如HNRPA2B1的強啟動子的融合體能夠引起跨腫瘤類型的癌基因的異常表達。在本文中鑒定到的FINRPA2B1:ETV1融合通過跨度約為15MB的染色體內(nèi)缺失產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，在其他常見上皮癌中可能發(fā)生癌基因活化的隱蔽型重排和染色體內(nèi)缺失。II.抗體本發(fā)明的基因融合體蛋白、包括其片段、衍生物和類似物，可以用作免疫原來產(chǎn)生可用于下面描述的診斷、研究和治療方法的抗體?？贵w可以是多克隆或單克隆、嵌合、人源化、單鏈的或Fab片段。本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員已知的各種程序可用于生產(chǎn)和標(biāo)記這 樣的抗體和片段。參見例如Burns主編的《免疫化學(xué)方案》(Immunochemical Protocols)第三版，Humana Press (2005) ;Harlow和Lane,《抗體實驗室指南》(Antibodies :A LaboratoryManual), Cold Spring Harbor Laboratory(1988) ；Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983) ;K6hler和 Milstein，Nature 256:495(1975)。利用截短的 ETS 家族成員蛋白或嵌合蛋白與其相應(yīng)的天然蛋白之間的差異的抗體或片段，是特別優(yōu)選的。III.診斷應(yīng)用ARG或HG與ETS家族成員基因的融合可以作為DNA、RNA或蛋白質(zhì)檢測。最初，基因融合體可以作為具有來自ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’部分和來自ETS家族成員基因的3’部分的基因組DNA的染色體重排被檢測。在轉(zhuǎn)錄后，基因融合體可以作為具有來自ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’部分和來自ETS家族成員基因的3’部分的嵌合mRNA被檢測。在翻譯后，基因融合體可以作為由ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)與ETS家族成員基因融合所產(chǎn)生的氨基端截短的ETS家族成員蛋白、具有來自ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的氨基端部分和來自ETS家族成員基因的羧基端部分的嵌合蛋白、或上調(diào)但在其他方面沒有差別的天然ETS家族成員蛋白被檢測。截短的ETS家族成員蛋白和嵌合蛋白可能在氨基酸序列、翻譯后加工和/或二級、三級或四級結(jié)構(gòu)方面與其相應(yīng)的天然蛋白不同。這樣的差別，如果存在的話，可用于鑒定基因融合體的存在。檢測的具體方法在下文更詳細描述。本發(fā)明提供了基于DNA、RNA和蛋白質(zhì)的診斷方法，直接或間接檢測基因融合體。本發(fā)明還提供了用于診斷目的的組合物和試劑盒。本發(fā)明的診斷方法可以是定性或定量的。定量診斷方法可用于例如通過截止值或閾值水平區(qū)別進展緩慢和蔓延性癌癥。當(dāng)適用時，定性或定量診斷方法也可以包括靶、信號或中間物(例如通用引物)的擴增。初始測定可以證實基因融合體的存在，但是不能鑒定具體的融合。如果需要，然后進行二級測定，以確定具體融合的身份。二次測定可以使用與初始測定不同的檢測技術(shù)。本發(fā)明的基因融合體可以與其他標(biāo)志物一起以多路或組的格式檢測。標(biāo)志物根據(jù)它們單獨或與基因融合體相組合的預(yù)測價值進行選擇。示例性前列腺癌標(biāo)志物包括但不限于AMACR/P504S(美國專利 6, 262, 245) ;PCA3(美國專利 7, 008, 765) ;PCGEM1(美國專利 6，828，429) ;prostein/P501S、P503S、P504S、P509S、P510S、前列腺酶 /P703P、P710P (美國專利公布No. 20030185830)；以及在美國專利5，854，206和6，034，218和美國專利公布No. 20030175736中所公開的，上述每個文獻在此以其全文引為參考。用于其他癌癥、疾病、感染和代謝病癥的標(biāo)志物也可考慮包含在多路的組格式中。本發(fā)明的診斷方法也可以參考將特定基因融合與疾病的階段、蔓延性或發(fā)展或者轉(zhuǎn)移的存在或風(fēng)險相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)進行修改。最終，由本發(fā)明方法提供的信息將幫助醫(yī)生為特定患者選擇最佳治療過程。A.樣品任何懷疑含有基因融合體的患者樣品可以按照本發(fā)明的方法進行測試。作為非限制性的實例，樣品可以是組織(例如前列腺活檢樣品或通過前列腺切除術(shù)獲得的組織樣品)、血液、尿液、精液、前列腺分泌物或其級份(例如血漿、血清、尿液上清液、尿液細胞沉淀物或前列腺細胞)。尿液樣品優(yōu)選在仔細的直腸指診(DRE)后立即進行，所述直腸指診引起來自前列腺的前列腺細胞脫落到尿道中。
患者的樣品典型地需要初步加工，用于從樣品分離或富集基因融合體或含有基因融合體的細胞。本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員已知的各種技術(shù)可用于該目的，包括但不限于離心、免疫捕獲、細胞裂解和核酸靶捕獲(參見例如歐洲專利No. 1409727，在此以其全文引為參考)。B. DNA 和 RNA 檢測本發(fā)明的基因融合體可以使用本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員已知的各種核酸技術(shù)，作為基因組DNA的染色體重排或嵌合mRNA來檢測，所述技術(shù)包括但不限于核酸測序、核酸雜交和核酸擴增。I.測序核酸測序技術(shù)的說明性而非限制性實例包括但不限于鏈終止劑(Sanger)測序和染料終止劑測序。本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到，因為RNA在細胞中較不穩(wěn)定并且更易受核酸酶攻擊，因此在實驗上通常在測序前將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA。鏈終止劑測序使用修飾的核苷酸底物，利用了 DNA合成反應(yīng)的序列特異性終止。在模板DNA的特定位點處，通過使用與模板該區(qū)域處互補的短的放射活性或其他標(biāo)記的寡核苷酸來引發(fā)延伸。寡核苷酸引物使用DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)的四種脫氧核苷酸堿基以及低濃度的一種鏈終止核苷酸——最常用為雙脫氧核苷酸進行延伸。該反應(yīng)在四個獨立的試管中重復(fù)，每個試管取一種堿基輪流作為雙脫氧核苷酸。鏈終止核苷酸被DNA聚合酶的有限摻入，產(chǎn)生了一系列僅在使用特定雙脫氧核苷酸的位置處被終止的相關(guān)DNA片段。對于每個反應(yīng)試管，將片段在板狀聚丙烯酰胺凝膠或填充有粘稠聚合物的毛細管中通過電泳按大小進行分離。當(dāng)從凝膠頂部向底部掃描時，通過讀取那個泳道產(chǎn)生來自于標(biāo)記引物的可視化標(biāo)志，來確定序列?；蛘撸玖辖K止劑測序?qū)K止劑進行標(biāo)記。通過將每種雙脫氧核苷酸鏈終止劑用在不同波長處發(fā)射熒光的不同熒光染料標(biāo)記，可以在單個反應(yīng)中執(zhí)行完全測序。2.雜交核酸雜交技術(shù)的說明性而非限制性實例包括但不限于原位雜交(ISH)、微陣列和Southern 或 Northern 印跡。原位雜交(ISH)是一種雜交類型，其使用標(biāo)記的互補DNA或RNA鏈作為探針，定位組織部分或切片中的特定DNA或RNA序列(原位)，或者如果組織足夠小，則定位整個組織中(整裝制片ISH)的特定DNA或RNA序列。DNA ISH可用于確定染色體的結(jié)構(gòu)。RNA ISH被用于測量和定位組織切片或整裝制片中的mRNA和其他轉(zhuǎn)錄物。通常對樣品細胞和組織進行處理，以將靶轉(zhuǎn)錄物固定在位并增加探針的接近。將探針與靶序列在升高的溫度下雜交，然后洗掉過量的探針。使用放射自顯影、熒光顯微術(shù)或免疫組織化學(xué)，分別對組織中使用放射性、熒光或抗原標(biāo)記的堿基所標(biāo)記的探針進行定位和定量。ISH也可以使用兩種或以上用放射活性或其他非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針，以同時檢測兩種或以上的轉(zhuǎn)錄物。a. FISH在某些實施方案中，使用熒光原位雜交(FISH)檢測融合序列。用于本發(fā)明的優(yōu)選FISH測定法利用了細菌人工染色體(BAC)。它們已被廣泛用于人類基因組測序計劃(參見 Nature 409 :953-958 (2001))，并且可以通過經(jīng)銷商獲得含有特定BAC的克隆，所述經(jīng)銷者可以通過許多來源例如NCBI來定位。來自人類基因組的每個BAC克隆已給出了明確鑒別它的參考名稱。這些名稱可用于尋找相應(yīng)的GenBank序列以及從經(jīng)銷商訂購克隆的拷貝。在某些實施方案中，檢測分析方法是利用了針對ETVl的探針(例如bacRPl 1-692L4)、一組針對c-ERG: t-ERG分裂物的探針(例如bac RPl 1-24A11和作為用于t-ERG RP11-372017或RP11-137J13的探針)的FISH測定法。在其他實施方案中，F(xiàn)ISH測定法通過用一組探針檢測ETVl缺失或擴增來進行，其中一種探針跨越ETVl基因座(例如bac RP11-692L4)，另一種探針與7號染色體雜交(例如染色體著絲粒上的探針)。在其他實施方案中，方法通過使用一組探針檢測ERG缺失或擴增來進行，其中一種探針跨越ERG基因座(例如bac RP11-476D17)，另一種參比探針位于21號染色體上(例如 PR11-32L6 ；RP11-752M23 ;RP11_1107H21 ;RP11_639A7 或 RP11-1077M21)。在另一個實施方案中，方法通過使用一組探針檢測TMPRSS2缺失/擴增來進行，其中一種探針跨越 TMPRSS2(例如 RP11-121A5 ;RP11_120C17 ;PR11_814F13 ;或 RR11-535H11)基因座，另一種參比探針位于 21 號染色體上(例如 PR11-32L6 ；RP11-752M23 ;RP11_1107H21 ;RP11_639A7或RP11-1077M21)。在某些實施方案中，方法還包含使用選自但不限于RP11-121A5、RP11-120C17、PR11-814F13 和 RR11-535H11 的探針進行雜交。本發(fā)明還提供了在人類前列腺細胞、人類前列腺組織上或所述人類前列腺細胞或人類前列腺組織周圍的流體上進行FISH測定的方法。在某些實施方案中，測定方法包含雜交步驟，其使用選自但不限于下列的探針RP11_372017、RP11-137J13、RP11-692L4、RP11-476D17、PR11-32L6、RP11-752M23、RPl卜 1107H21、RP11-639A7、RP11-1077M21、RP11-121A5、RP11-120C17、PR11-814F13 和 RR11-535H11?？捎糜贔ISH方案中檢測與本發(fā)明相關(guān)的重排的具體BAC克隆如下 為了檢測ETV1-TMPRSS2融合，可以使用一種跨越ETVl的探針和一種跨越TMPRSS2基因座的探針用于ETVl 的 BAC :RP11_692L4用于TMPRSS2 的 BAC :RP11_121A5，(RP11-120C17，PR11-814F13，RR11-535H11) 使用針對c-ERG: t-ERG分裂物的探針組檢測ERG易位用于c-ERG 的 BAC :RP11_24A11用于t-ERG 的 BAC :RP11-372017，RP11-137J13
使用探針組檢測ETVl缺失/擴增，一種探針跨越ETVl基因座，一種參比探針位于7號染色體上用于ETVl 的 BAC :RP11_692L4使用探針組檢測ERG缺失/擴增，一種探針跨越ERG基因座，一種參比探針位于21號染色體上用于ERG 的 BAC :RP11_476D17用于21號染色體上的參比探針的BAC * 使用探針組檢測TMPRSS2缺失/擴增，一種探針跨越TMPRSS2基因座，一種參比探針位于21號染色體上用于TMPRSS2 的 BAC :RP11_121A5，(RP11-120C17，PR11-814F13，RR11-535H11) 用于21 號染色體上的參比探針的 BAC PR11-32L6, RP11-752M23，RP11-1107H21，RP11-639A7, (RP11-1077M21)。用于檢測導(dǎo)致TMPRSS2與ERG之間融合的缺失突變的最優(yōu)選探針是RP11-24A11和RP11-137J13。將這些探針或如上所述的探針，用適合的熒光或其他標(biāo)志物標(biāo)記，然后使用在雜交中。本文中提供的實施例部分提出了有效測量缺失的具體方案，但本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會認(rèn)識到該測定方法的許多變體可以同樣好地使用。具體方案在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的，并可以容易地改造以適應(yīng)于本發(fā)明。與方法相關(guān)的指導(dǎo)可以從許多參考文獻獲得，包括《原位雜交醫(yī)學(xué)應(yīng)用》(In situ Hybridization Medical Applications)(G. R. Coulton 和 J. de Belleroche 主編)，Kluwer Academic Publishers, Boston (1992)；《神經(jīng)生物學(xué)中的原位雜交，方法學(xué)改進》(In situ Hybridization In NeurobioloRY Advances in MethodoloRy) (J. H. Eberwine、K. L. Valentino 和 J. D. Barchas 主編)，Oxford University Press Inc. , England (1994);《原位雜交實用方法》(In situHybridization A Practical Approach)(D. G. Wilkinson 主編)，Oxford UniversityPress Inc. , England (1992) ;Kuo 等，Am. J. Hum. Genet. 49 :112-119 (1991) ；Klinger,等，Am. J. Hum. Genet. 51 :55-65 (1992)；以及 Ward 等，Am. J. Hum. Genet. 52 :854-865 (1993)。還存在可商購并為執(zhí)行FISH測定法提供方案的試劑盒(可以從例如Oncor，Inc.，Gaithersburg,MD獲得)。為方法學(xué)提供指導(dǎo)的專利包括美國專利5，225，326,5, 545，524、6，121，489和6，573，043。所有這些參考文獻在此以其全文引為參考，并可以與本技術(shù)領(lǐng)域中相似的參考文獻和本文實施例部分中提供的信息一起，用于建立便于具體實驗室的程序化步驟。下面的表13顯示了可用作FISH探針的其他BAC克隆。表13
其他可用于本發(fā)明方法的FISH探針顯示在表16中(圖46)。b.微陣列被稱為微陣列的不同種類的生物測定法包括但不限于DNA微陣列(例如cDNA微陣列和寡核苷酸微陣列)、蛋白質(zhì)微陣列、組織微陣列、轉(zhuǎn)染或細胞微陣列、化學(xué)化合物微陣列和抗體微陣列。DNA微陣列通常被稱為基因芯片、DNA芯片或生物芯片，是附著于固相表面(例如玻璃、塑料或硅芯片)上形成陣列的微小DNA斑點的集合，用于同時對數(shù)千個基因進行表達譜分析或監(jiān)測其表達水平。附著的DNA區(qū)段被稱為探針，在單個DNA微陣列中可以使用數(shù)千個探針。通過比較疾病和正常細胞中的基因表達，微陣列可用于鑒定疾病基因。微陣列可以使用各種技術(shù)制造，包括但不限于使用尖頭針在玻璃載片上印刷；使用預(yù)制掩模進行光刻；使用動態(tài)微鏡器件進行光刻；噴墨印刷；或微電極陣列上的電化學(xué)。Southern和Northern印跡法分別用于檢測特定DNA或RNA序列。將從樣品提取的DNA或RNA片段化，在基質(zhì)凝膠上電泳分離，并轉(zhuǎn)移到濾膜上。將結(jié)合有DNA或RNA的濾膜和與目標(biāo)序列的互補標(biāo)記探針進行雜交。檢測與濾膜雜交的探針。程序的變化形式是反向Northern印跡，其中附著到膜上的底物核酸是分離的DNA片段的集合，探針是從組織提取并標(biāo)記的RNA。3.擴增基因組DNA的染色體重排和嵌合mRNA在檢測之前或同時可以進行擴增。核酸擴增技術(shù)的說明性而非限制性實例包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴增(SDA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到某些擴增技術(shù)(例如PCR)需要在擴增前將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA (例如RT-PCR)，而其他擴增技術(shù)直接擴增RNA (例如TMA和NASBA)。聚合酶鏈反應(yīng)(美國專利4，683，195,4, 683, 202,4, 800, 159 和 4，965，188，在本文中各以其全文引為參考)，通常為稱為PCR，使用變性、引物對與相反鏈的退火以及引物延伸的多個循環(huán)來指數(shù)級增加靶核酸序列的拷貝數(shù)。在被稱為RT-PCR的變化形式中，使用反轉(zhuǎn)錄酶(RT)從mRNA制造互補DNA (cDNA)，然后通過PCR擴增cDNA以產(chǎn)生DNA的多個拷貝。對于PCR的其他各種變換形式，參見例如美國專利No. 4，683，195,4, 683，202和4，800, 159 ；Mullis 等，Meth. Enzymol. 155 :335(1987);以及 Murakawa 等，DNA 7 :287 (1988)，在本文中各以其全文引為參考。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(美國專利No.5，480，784和5，399，491，在本文中各以其全文引為參考)，通常被稱為TMA，在靶序列的多個RNA拷貝自催化產(chǎn)生附加拷貝的基本上恒定的溫度、離子強度和PH條件下，自催化地合成靶核酸序列的多個拷貝。參見例如美國專利No. 5, 399,491和5，824，518，在本文中各以其全文引為參考。在美國專利公布No. 20060046265 (在此以其全文引為參考)中描述的變化形式中，TMA任選結(jié)合使用阻斷部分、終止部分和其他修飾部分來改進TMA方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。連接酶鏈反應(yīng)(Weiss，R.，Science 254 :1292 (1991)，在此以其全文引為參考)，通常稱為LCR，使用與靶核酸相鄰區(qū)域雜交的兩組互補DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在熱變性、雜交和連接的重復(fù)循環(huán)中被DNA連接酶共價連接，產(chǎn)生可檢測的雙鏈連接寡核苷酸產(chǎn)物。鏈置換擴增(Walker,G.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :392-396(1992);美國專利No. 5，270, 184和5，455，166，在本文中各以其全文引為參考)，通常被稱為SDA’使用下面的循環(huán)引物序列對與靶序列的相反鏈退火、在存在dNTPa S的情況下延伸引物以產(chǎn)生雙鏈體半硫代磷酸酯化引物延伸產(chǎn)物、將半修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點進行核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的切口、以及聚合酶介導(dǎo)的從切口 3’末端延伸引物來置換現(xiàn)有的鏈，并產(chǎn)生鏈用于下一輪的引物退火、切口和鏈置換，導(dǎo)致產(chǎn)物的幾何擴增。嗜熱SDA(tSDA)在基本上相同的方法中在較高溫度下使用嗜熱核酸內(nèi)切酶和聚合酶(歐洲專利No. 0 684 315)。其他擴增方法包括例如基于核酸序列的擴增(美國專利5，130，238，在此以其全文引為參考)，通常被稱為NASBA ;使用RNA復(fù)制酶擴增探針分子自身的方法(Lizardi等，BioTechnol. 6 :1197(1988)，在此以其全文引為參考)，通常被稱為QP復(fù)制酶；基于轉(zhuǎn)錄的擴增方法(Kwoh等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173(1989));以及自持續(xù)序列復(fù)制(Guatelli 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :1874 (1990)，在本文中各以其全文引為參考)。對于已知擴增方法的進一步討論，參見Persing, David H.,《診斷醫(yī)學(xué)微生物學(xué)原理與應(yīng)用》中的“體外核酸擴增技術(shù)”(“In Vitro Nucleic Acid AmplificationTechniques”， Diagnostic Medical MicrobiologyPrinciples and Applications)(Persing 等主編),pp. 51-87 (美國微生物學(xué)會(American Society for Microbiology),Washington, DC (1993))。
4.檢測方法可以通過任何常規(guī)手段檢測未擴增或擴增的基因融合體核酸。例如，可以通過與可檢測的標(biāo)記探針雜交并測量得到的雜交體來檢測基因融合體。檢測方法的說明性而非限制性實例描述如下。一種說明性檢測方法，雜交保護測定法(HPA)包括將化學(xué)發(fā)光寡核苷酸探針(例如吖啶酯(AE)探針)與靶序列雜交，選擇性水解未雜交探針上存在的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，并在照度計中測量從剩余探針產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光。參見例如美國專利5，283，174和Norman C. Nelson 等，《非同位素探測、印跡和測序》(Nonisotopic Probing, Blotting, andSequencing)第17章(Larry J. Kricka主編，第二版，1995,在本文中各以其全文引為參考)。另一種說明性檢測方法為擴增過程提供實時定量評估?！皩崟r地”評估擴增過程包 括在擴增反應(yīng)過程中連續(xù)或周期性測定反應(yīng)混合物中擴增子的量，以及使用測定值計算樣品中最初存在的靶序列的量。用于測定樣品中最初存在的靶序列的量的各種基于實時擴增的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。它們包括美國專利No. 6，303，305和6，541，205公開的方法，在本文中各以其全文引為參考。另一種用于測定樣品中最初存在的靶序列的量、但是不基于實時擴增的方法，公開在美國專利5，710，029中，在此以其全文引為參考。 擴增產(chǎn)物可以通過使用各種自雜交探針進行實時檢測，大部分自雜交探針具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對這些自雜交探針進行標(biāo)記，使得它們根據(jù)探針是處于自雜交狀態(tài)還是通過與靶序列雜交而處于改變的狀態(tài)，發(fā)射不同的可檢測信號。作為非限制性實例，“分子炬”是一類自雜交探針，其包括由連接區(qū)(例如非核苷酸接頭)相連的、在預(yù)定雜交測定條件下彼此雜交的自身互補的不同區(qū)域(被稱為“靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和“靶封閉結(jié)構(gòu)域”)。在優(yōu)選實施方案中，分子炬在靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域中含有長度為I至約20個堿基的單鏈堿基區(qū)域，并允許在鏈置換條件下與擴增反應(yīng)中存在的靶序列雜交。在鏈置換條件下，有利于分子炬的兩個可以完全或部分互補的互補區(qū)域之間的雜交，除非在存在靶序列的情況下，靶序列將與靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域中存在的單鏈區(qū)結(jié)合并置換所有或部分靶封閉結(jié)構(gòu)域。分子炬的靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域和靶封閉結(jié)構(gòu)域包括可檢測標(biāo)記物或一對相互作用標(biāo)記物(例如發(fā)光劑/淬滅劑)，其位置使得當(dāng)分子炬自雜交時產(chǎn)生的信號與分子炬同靶序列雜交時產(chǎn)生的信號不同，從而允許在存在未雜交分子炬的情況下檢測測試樣品中的探針靶雙鏈體。分子炬和各種類型的相互作用探針對公開在美國專利6，534，274中，在此以其全文引為參考。具有自身互補性的檢測探針的另一個實例是“分子信標(biāo)”。分子信標(biāo)包括具有靶互補序列的核酸分子、在不存在擴增反應(yīng)中存在的靶序列的情況下將探針保持在封閉構(gòu)象中的親和對(或核酸臂)、以及當(dāng)探針處于封閉構(gòu)象時相互作用的標(biāo)記物對。靶序列與靶互補序列的雜交將親和對的成員分開，從而將探針轉(zhuǎn)變成開放構(gòu)象。由于標(biāo)記物對相互作用的降低，向開放構(gòu)象的轉(zhuǎn)變是可檢測的，所述標(biāo)記物對可以是例如熒光團和淬滅劑(例如DABCYL和EDANS)。分子信標(biāo)公開在美國專利No. 5，925，517和6，150，097中，在此以其全文引為參考。其他的自雜交探針對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員來說是公知的。作為非限制性的實例，具有相互作用標(biāo)記物的探針結(jié)合對，例如美國專利5，928，862 (在此以其全文引為參考)中所公開的，可以適合用于本發(fā)明。用于檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)的探針系統(tǒng)也可用于本發(fā)明。其他檢測系統(tǒng)包括“分子開關(guān)”，例如在美國專利公布No. 20050042638中所公開的，在此以其全文引為參考。其他探針，例如包含嵌入染料和/或熒光染料的探針，也可用于檢測本發(fā)明的擴增產(chǎn)物。參見例如美國專利5，814，447 (在此以其全文引為參考)。C.蛋白質(zhì)檢測本發(fā)明的基因融合體可以使用本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員已知的各種蛋白質(zhì)技術(shù)，作為截短的ETS家族成員蛋白或嵌合蛋白來檢測，所述技術(shù)包括但不限于蛋白質(zhì)測序和免疫測定法。I.測序蛋白質(zhì)測序技術(shù)的說明性而非限制性的實例包括但不限于質(zhì)譜和Edman降解。 原則上說，質(zhì)譜能夠測序任何尺寸的蛋白，但是當(dāng)尺寸增加時變得更難計算。將蛋白用內(nèi)切蛋白酶消化，并將得到的溶液通過高壓液相色譜柱。在該柱末端，將溶液從充電至高正電勢的狹小噴嘴中噴出，進入質(zhì)譜儀。液滴上的電荷使它們裂成片段，直到只剩單種離子。然后將肽裂成片段并測量片段的質(zhì)荷比。質(zhì)譜圖通過計算機分析，并通常針對以前測序的蛋白質(zhì)進行比較，以便確定片段的序列。然后使用不同的消化酶重復(fù)該過程，并使用序列重疊來構(gòu)建蛋白質(zhì)序列。在Edman降解反應(yīng)中，將待測序的妝吸附在固相表面上(例如包被有聚凝胺的玻璃纖維)。向吸附的肽加入Edman試劑苯基異硫氰酸酯(PTC)和12%三甲胺的弱堿性緩沖溶液，并與N-端氨基酸的胺基反應(yīng)。然后通過加入無水的酸選擇性脫開該末端氨基酸衍生物。衍生物進行異構(gòu)化以產(chǎn)生取代的苯基硫代乙內(nèi)酰脲，其可以被洗掉并通過色譜鑒定，然后重復(fù)該循環(huán)。每一步的效率約為98%，其允許可靠地測定約50個氨基酸。2.免疫測定法免疫測定法的說明而非限制性實例包括但不限于免疫沉淀、Western印跡、ELISA、免疫組織化學(xué)、免疫細胞化學(xué)、流式細胞術(shù)和免疫PCR。使用本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員已知的各種技術(shù)(例如比色、熒光、化學(xué)發(fā)光或放射活性)進行可檢測標(biāo)記的多克隆或單克隆抗體，適合用于免疫測定法中。免疫沉淀是使用特異性針對抗原的抗體將該抗原從溶液中沉淀出來的技術(shù)。通過靶向據(jù)認(rèn)為存在于復(fù)合物中的蛋白質(zhì)，該方法可用于鑒定細胞提取液中存在的蛋白質(zhì)復(fù)合物。通過最初從細菌分離的不溶性抗體結(jié)合蛋白例如A蛋白和G蛋白，從溶液中取得復(fù)合物?？贵w也可以與瓊脂糖凝膠珠偶聯(lián)，其可以容易地從溶液中分離出來。在洗滌后，可以使用質(zhì)譜、Western印跡或任何數(shù)量的用于鑒定復(fù)合物中的組分的其他方法來分析沉淀物。Western印跡或免疫印記是在組織勻漿液或提取液的給定樣品中檢測蛋白質(zhì)的方法。它使用凝膠電泳根據(jù)質(zhì)量分離變性蛋白。然后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)出，并轉(zhuǎn)移到典型為聚二氟乙烯或硝酸纖維素的膜上，在此使用特異性針對目標(biāo)蛋白的抗體在膜上探測它們。結(jié)果，研究人員能夠檢測給定樣品中的蛋白量并比較幾個組之間的水平。ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測定法的簡稱，是檢測樣品中抗體或抗原的存在的生物化學(xué)技術(shù)。它利用至少兩種抗體，一種特異性針對抗原，另一種與酶偶聯(lián)。第二抗體引起產(chǎn)色或產(chǎn)熒光底物產(chǎn)生信號。ELISA的變化形式包括夾心ELISA、競爭性ELISA和ELISP0T。因為可執(zhí)行ELISA來評估樣品中抗原的存在或抗體的存在，它對于測定血清抗體濃度和確定抗原的存在兩者來說，都是有用的工具。
免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)是指通過組織或細胞中的抗原與其相應(yīng)抗體結(jié)合的原理，分別在組織切片或細胞中定位蛋白質(zhì)的方法。通過用產(chǎn)色或熒光標(biāo)簽標(biāo)記抗體，使得能夠可視化。有色標(biāo)簽的典型實例包括但不限于辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。熒光團標(biāo)簽的典型實例包括但不限于熒光素異硫氰酸酯(FITC)或藻紅蛋白(PE)。流式細胞術(shù)是用于計數(shù)、檢測和分揀懸浮在流體流中的顯微粒子的技術(shù)。它允許對流過光學(xué)/電子檢測裝置的單個細胞的物理和/或化學(xué)特性進行同時的多參數(shù)分析。將一束單一頻率或顏色的光(例如激光)導(dǎo)向流體力學(xué)集中的流體流上。多個檢測器瞄準(zhǔn)液流通過光束的點；一個與光束成一直線(正向散射或FSC)，幾個與其垂直(側(cè)向散射(SSC)和一個或多個熒光檢測器)。每個通過光束的懸浮粒子以某種方式散射光，并且粒子中的熒光化學(xué)物質(zhì)可以被激發(fā)以發(fā)射頻率比光源低的光。散射光和熒光的組合被檢測器獲取，通過分析每個檢測器處亮度的波動，每個熒光發(fā)射峰對應(yīng)一個檢測器，能夠推導(dǎo)出關(guān)于每個單個粒子的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)的各種實際情況。FSC與細胞體積相關(guān)聯(lián)，SSC與粒子的密度或內(nèi)部復(fù)雜程度(例如核的形狀、細胞質(zhì)顆粒的量和類型或膜的粗糙度)相關(guān)聯(lián)。
免疫-聚合酶鏈反應(yīng)(IPCR)利用核酸擴增技術(shù)在基于抗體的免疫測定中增加信號產(chǎn)生。因為不存在等同的蛋白質(zhì)PCR，也就是說，蛋白質(zhì)不能以與PCR過程中核酸復(fù)制相同的方式進行復(fù)制，因此增加檢測靈敏度的唯一方式是通過信號放大。靶蛋白與直接或間接結(jié)合寡核苷酸的抗體結(jié)合。將未結(jié)合的抗體洗掉，并對剩余的結(jié)合抗體進行其寡核苷酸的擴增。通過使用標(biāo)準(zhǔn)的核酸檢測方法包括實時方法檢測被擴增的寡核苷酸，來進行蛋白質(zhì)檢測。D.數(shù)據(jù)分析在某些實施方案中，使用基于計算機的分析程序?qū)z測分析法產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)(例如給定基因融合體或其他標(biāo)志物的存在、不存在或量)轉(zhuǎn)變成臨床醫(yī)生使用的預(yù)測值數(shù)據(jù)。臨床醫(yī)生可以使用任何適合的手段評估預(yù)測數(shù)據(jù)。因此，在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了進一步的優(yōu)點，即可能沒有在遺傳學(xué)或分子生物學(xué)方面受過訓(xùn)練的臨床醫(yī)生，不需要理解原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以其最有用的形式直接呈遞給臨床醫(yī)生。然后臨床醫(yī)生能夠立即使用信息以便優(yōu)化對象的護理。本發(fā)明設(shè)想了能夠從執(zhí)行測定的實驗室、信息提供者、醫(yī)務(wù)人員和對象接收、處理和發(fā)送信息，或接收、處理和發(fā)送信息給執(zhí)行測定的實驗室、信息提供者、醫(yī)務(wù)人員和對象的任何方法。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，從對象獲得樣品(例如活檢或血清或尿液樣品)，并將其送至位于世界任何位置(例如與對象所在或最終使用信息的國家不同的國家)的譜分析服務(wù)機構(gòu)(例如醫(yī)學(xué)機構(gòu)的臨床實驗室、基因組譜分析企業(yè)等)以產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)。當(dāng)樣品包含組織或其他生物樣品時，對象可以就診于醫(yī)學(xué)中心進行樣品獲取并將其送往譜分析中心，或?qū)ο罂梢宰约菏占瘶悠?例如尿液樣品)并將其直接送往譜分析中心。當(dāng)樣品包含以前測定的生物信息時，信息可以由對象直接送往譜分析服務(wù)機構(gòu)(例如可以通過計算機掃描含有信息的信息卡，并使用電子通訊系統(tǒng)將數(shù)據(jù)發(fā)送到譜分析中心的計算機)。在譜分析服務(wù)機構(gòu)接收后，對樣品進行處理，并產(chǎn)生特異性針對對象所需的診斷或預(yù)后信息的譜分析(即表達數(shù)據(jù))。然后將譜分析數(shù)據(jù)制備成適合于由治療臨床醫(yī)生解釋的格式。例如，并非提供原始表達數(shù)據(jù)，所制備的格式可以表示對象的診斷或風(fēng)險評估(例如癌癥存在的可能性)以及對具體治療選項的推薦意見。數(shù)據(jù)可以通過任何適合的方法顯示給臨床醫(yī)生。例如，在某些實施方案中，譜分析服務(wù)機構(gòu)產(chǎn)生報告，其可以為臨床醫(yī)生打印(例如在護理位點)或在計算機監(jiān)視器上顯示給臨床醫(yī)生。在某些實施方案中，信息首先在護理位點或地區(qū)站進行分析。然后將原始數(shù)據(jù)送往中央處理站進行進一步分析，和/或?qū)⒃紨?shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成對臨床醫(yī)生或患者有用的信息。中央處理站提供私密性(所有數(shù)據(jù)儲存在具有統(tǒng)一安全協(xié)議的中央站中)、速度和數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)一性的優(yōu)點。然后中央處理站可以按照對象的治療控制數(shù)據(jù)的命運。例如，使用電子通訊系統(tǒng)，中央處理站可以將數(shù)據(jù)提供給臨床醫(yī)生、對象或研究人員。在某些實施方案中，對象能夠使用電子通訊系統(tǒng)直接訪問數(shù)據(jù)。對象可以根據(jù)結(jié)果選擇進一步干預(yù)或咨詢。在某些實施方案中，數(shù)據(jù)被用于研究用途。例如，數(shù)據(jù)可用于進一步優(yōu)化包含或消除標(biāo)志物作為疾病具體狀況或階段的有用指示物。E.體內(nèi)成像 本發(fā)明的基因融合體也可以使用體內(nèi)成像技術(shù)檢測，所述技術(shù)包括但不限于放射性核素成像、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、計算機軸向斷層掃描、X射線或磁共振成像方法、熒光檢測和化學(xué)發(fā)光檢測。在某些實施方案中，體內(nèi)成像技術(shù)被用于使動物(例如人類或非人類哺乳動物)中癌癥標(biāo)志物的存在或表達可視化。例如，在某些實施方案中，使用特異性針對癌癥標(biāo)志物的標(biāo)記抗體來標(biāo)記癌癥標(biāo)志物的mRNA或蛋白。可以使用體內(nèi)成像方法在個體中檢測特異性結(jié)合和標(biāo)記的抗體，所述方法包括但不限于放射性核素成像、正電子發(fā)射斷層掃描、計算機軸向斷層掃描、X射線或磁共振成像方法、熒光檢測和化學(xué)發(fā)光檢測。用于產(chǎn)生針對本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物的抗體的方法在下文描述。本發(fā)明的體內(nèi)成像方法可用于診斷表達本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物的癌癥(例如前列腺癌)。體內(nèi)成像被用于使得指示癌癥的標(biāo)志物的存在可視化。這樣的技術(shù)可以不使用不受歡迎的活檢來進行診斷。本發(fā)明的體內(nèi)成像方法也可用于為癌癥患者提供預(yù)后。例如，可以檢測指示癌癥可能轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物的存在。本發(fā)明的體內(nèi)成像方法還可用于檢測身體的其他部分中的轉(zhuǎn)移癌。在某些實施方案中，特異性針對本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物的試劑(例如抗體)被熒光標(biāo)記。將標(biāo)記的抗體導(dǎo)入對象(例如口服或腸胃外)。使用任何適合的方法檢測熒光標(biāo)記的抗體(例如使用在此引為參考的美國專利6，198，107中描述的裝置)。在其他實施方案中，抗體被放射活性標(biāo)記。使用抗體進行體內(nèi)診斷在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。Sumerdon等(Nucl. Med. Biol 17 :247-254[1990])描述了優(yōu)化的抗體-螯合齊U，使用銦-111作為標(biāo)記物用于腫瘤的放射免疫閃爍成像。Griffin等(J Clin One 9 631-640[1991])描述了使用該藥劑在懷疑患有復(fù)發(fā)結(jié)腸直腸癌的患者中檢測腫瘤。帶有順磁性離子作為磁共振成像標(biāo)記物的類似試劑的應(yīng)用，在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(Lauffer，Magnetic Resonance in Medicine 22 :339-342 [1991])。使用的標(biāo)記物將取決于所選的成像形式。放射性標(biāo)記物例如銦-111、锝_99m或碘-131可用于平面掃描或單光子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT)。發(fā)射正電子的標(biāo)記物例如氟-19也可用于正電子發(fā)射斷層掃描(PET)。對于MRI來說，可以使用順磁性離子例如釓(III)或錳(II)。半衰期為I小時至3. 5天的放射性金屬可用于結(jié)合抗體,例如鈧-47(3. 5天)、鎵-67 (2. 8天)、鎵-68 (68分鐘)、锝_99m (6小時)和銦-111 (3. 2天)，其中鎵-67、锝_99m和銦-111優(yōu)選用于Y相機成像，鎵-68優(yōu)選用于正電子斷層掃描。使用這類放射性金屬來標(biāo)記抗體的有用方法是利用雙功能螯合劑，例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，正如由例如 Khaw 等(Science 209 :295[1980])對 In-Ill 和 Tc_99m 的描述，以及Scheinberg等(Science 215 1511 [1982])的描述。也可以使用其他螯合劑，但是I-(對羧基甲氧基苯甲基)EDTA和DTPA的羧基碳酐是有利的，因為使用它們允許結(jié)合而基本不影響抗體的免疫反應(yīng)性。將DPTA與蛋白偶聯(lián)的另一種方法是使用DTPA的環(huán)狀酐，如Hnatowich等(Int.J. Appl. Radiat. Isot. 33 327[1982])對于用In-Ill標(biāo)記白蛋白所描述的，但是其可適用于標(biāo)記抗體。用Tc-99m標(biāo)記抗體而不使用DPTA進行螯合的適合方法是Crockford等的亞錫法(pretinning method)(美國專利4, 323, 546,在此引為參考)。用Tc_99m標(biāo)記免疫球蛋白的優(yōu)選方法是Wong等(Int. J. Appl :Radiat. Isot,29 251 [1978])描述的用于血漿蛋白的方法，以及最近由Wong等(J. Nucl. Med.，23 : 229[1981])成功應(yīng)用于標(biāo)記抗體的方法。在放射性金屬與特異性抗體結(jié)合的情況下，同樣希望將盡可能高比例的放射性標(biāo)記物導(dǎo)入抗體分子而不破壞其免疫特異性。為了確?？贵w上的抗原結(jié)合位點得到保護，可以通過在本發(fā)明的特定癌癥標(biāo)志物存在下執(zhí)行放射性標(biāo)記以獲得進一步改進。在標(biāo)記后分尚抗原。在其他實施方案中，使用體內(nèi)生物光子成像(Xenogen, Almeda, CA)進行體內(nèi)成像。該實時體內(nèi)成像利用螢光素酶。將螢光素酶基因摻入到細胞、微生物和動物中(例如作為與本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物的融合蛋白)。當(dāng)活化時，它引起發(fā)光反應(yīng)。使用CCD相機和軟件捕獲圖像并對其進行分析。F.組合物和試劑盒在本發(fā)明的診斷方法中使用的組合物包括但不限于探針、擴增寡核苷酸和抗體。特別優(yōu)選的組合物只有在ARG或HG與ETS家族成員基因融合時才檢測到產(chǎn)物。這些組合物包括單個標(biāo)記探針，其包含與來自ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’部分與來自ETS家族成員基因的3’部分融合的連接處雜交(即跨越基因融合體連接處)的序列；一對擴增寡核苷酸，其中第一個擴增寡核苷酸包含與ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)雜交的序列，第二個擴增寡核苷酸包含與ETS家族成員基因雜交的序列；針對由ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)與ETS家族成員基因的融合所產(chǎn)生的氨基端截短的ETS家族成員蛋白的抗體；或針對具有來自于ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的氨基端部分和來自ETS家族成員基因的羧基端部分的嵌合蛋白的抗體。然而，其他有用的組合物包括一對標(biāo)記探針，其中第一個標(biāo)記探針包含與ARG或HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)雜交的序列，第二個標(biāo)記探針包含與ETS家族成員基因雜交的序列。任何這些組合物，單獨地或與本發(fā)明的其他組合物組合，可以提供為試劑盒的形式。例如，單個標(biāo)記探針和一對擴增寡核苷酸可以提供在試劑盒中，用于本發(fā)明的基因融合體的擴增和檢測。試劑盒還可以包含適合的對照和/或檢測試劑。本發(fā)明的探針和抗體組合物也可以提供為陣列的形式。IV.預(yù)后應(yīng)用在本發(fā)明的開發(fā)過程中進行的實驗證實了本發(fā)明的基因融合體與前列腺癌患者的預(yù)后之間的密切關(guān)聯(lián)性(參見例如下面的實施例5)。特別是在融合體由位于TMPRSS2與ERG之間的基因組DNA缺失而產(chǎn)生的情況下，發(fā)現(xiàn)癌細胞表現(xiàn)出更具蔓延性的表型。因此，在某些實施方案中，能夠檢測其中存在居間DNA缺失的TMPRSS2與ERG之間基因融合體的測定方法，可用于提供預(yù)后并幫助醫(yī)生決定適合的治療策略。例如，在某些實施方案中，具有該特定重排的腫瘤患者進行更強烈的治療，因為他們的預(yù)后比缺乏重排的患者明顯更糟。任何測定方法都可用于確定細胞是否呈現(xiàn)出具有上面討論類型(例如上面描述)的重排。盡管本發(fā)明最優(yōu)選用于獲得前列腺癌患者的預(yù)后，但也可以檢測其他上皮細胞腫瘤，并可以使用本文描述的測定方法和探針確定來自這些腫瘤的癌細胞是否具有可能使其特別具有蔓延性、即可能具有浸潤性和轉(zhuǎn)移的重排?？梢允褂眠@種程序表征的腫瘤的實例包括乳腺、肺、結(jié)腸、卵巢、子宮、食道、胃、肝、腎、腦、皮膚和肌肉的腫瘤。測定方法對于研究人員在細胞系和動物模型中研究這些癌癥來說，也是有價值的。
在本發(fā)明的開發(fā)過程中進行的其他實驗證實，通過測定樣品以確定是否存在位于缺失區(qū)域中的一種或多種基因表達的喪失，能夠檢測染色體缺失。例如，在TMPRSS2與ERG之間的融合體形成中典型地缺失約2. 8兆堿基的基因組DNA，并且當(dāng)這種情況發(fā)生時位于該區(qū)域中的至少四個基因丟失。它們是ETS2基因、WRB基因、PCP4基因和MXl基因。它們中的一個或多個在癌性前列腺細胞中的降低表明預(yù)后不良。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了測定上皮細胞中指示癌癥相關(guān)重排的染色體DNA缺失的方法，所述方法包含使用至少第一和第二個探針進行FISH測定，其中第一個探針長度為至少15個核苷酸(例如至少15、20、35等)、與第一種熒光標(biāo)記物相連、并且在嚴(yán)緊條件下與人類基因組中的第一個序列雜交，其中所述第一個序列包括雄激素響應(yīng)性基因(例如TMPRSS2基因)或ETS家族基因(例如ERG基因、ETVl基因或ETV4基因)的至少一部分；并且第二個探針長度為至少15個核苷酸、與不同于第一種熒光標(biāo)記物的第二種熒光標(biāo)記物相連、并且在嚴(yán)緊條件下與人類基因組中不同于第一個序列并包括雄激素響應(yīng)性基因(例如TMPRSS2基因)或ETS家族基因(例如ERG基因、ETVI基因或ETV4基因)的至少一部分的第二個序列雜交。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了測定上皮細胞(例如前列腺細胞)中指示癌癥相關(guān)重排的基因組DNA缺失的方法，所述方法包含獲得上皮細胞的測試樣品；測定上皮細胞樣品以確定一種或多種基因的表達水平，所述基因選自包括但不限于ETS2、WRB、PCP4和MXl ;將步驟b)中測定的表達水平與對照樣品中的水平進行比較；以及得出結(jié)論，如果在測試樣品中測定到的基因表達水平低于對照樣品，則缺失發(fā)生。V.藥物篩選應(yīng)用在某些實施方案中，本發(fā)明提供了藥物篩選測定法(例如篩選抗癌藥物)。本發(fā)明的篩選方法利用了使用本發(fā)明的方法鑒定到的癌癥標(biāo)志物(例如包括但不限于本發(fā)明的基因融合體)。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了改變(例如降低)基因融合體表達的化合物的篩選方法?；衔锘蛩巹┛梢酝ㄟ^例如與啟動子區(qū)相互作用而干擾轉(zhuǎn)錄?；衔锘蛩巹┛梢愿蓴_從融合體產(chǎn)生的mRNA (例如通過RNA干擾、反義技術(shù)等)。化合物或藥劑可以干擾融合體生物活性的上游或下游的途徑。在某些實施方案中，候選化合物是針對癌癥標(biāo)志物的反義或干擾RNA藥劑(例如寡核苷酸)。在其他實施方案中，候選化合物是特異性結(jié)合本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物調(diào)控物或表達產(chǎn)物并抑制其生物功能的抗體或小分子。在一種篩選方法中，通過將化合物與表達癌癥標(biāo)志物的細胞相接觸，然后測定候選化合物對表達的影響，來評估候選化合物改變癌癥標(biāo)志物表達的能力。在某些實施方案中,通過檢測細胞所表達的癌癥標(biāo)志物mRNA的水平，來測定候選化合物對癌癥標(biāo)志物基因的表達的影響。mRNA表達可以通過任何適合的方法檢測。在其他實施方案中，通過測量癌癥標(biāo)志物編碼的多肽的水平來測定候選化合物對癌癥標(biāo)志物基因的表達的影響。所表達的多肽的水平可以使用任何適合的方法來測量，包括但不限于本文公開的方法。
具體來說，本發(fā)明提供了用于鑒定與本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物結(jié)合、對例如癌癥標(biāo)志物表達或癌癥標(biāo)志物活性具有抑制(或刺激)效應(yīng)、或?qū)绨┌Y標(biāo)志物底物的表達或活性具有刺激或抑制效應(yīng)的調(diào)節(jié)物、即候選或測試化合物或藥劑(例如蛋白、肽、肽模擬物、類肽、小分子或其他藥物)的篩選方法。由此鑒定的化合物可用于在治療方案中直接或間接調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)物(例如癌癥標(biāo)志物基因)的活性、闡明靶基因產(chǎn)物的生物功能、或鑒定破壞正常靶基因相互作用的化合物。抑制癌癥標(biāo)志物的活性或表達的化合物可用于增殖性紊亂例如癌癥、特別是前列腺癌的治療。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選候選或測試化合物的測定方法，所述化合物是癌癥標(biāo)志物蛋白或多肽或其生物活性部分的底物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選候選或測試化合物的測定方法，所述化合物結(jié)合癌癥標(biāo)志物蛋白或多肽或其生物活性部分，或調(diào)節(jié)它們的活性。 本發(fā)明的測試化合物可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的組合文庫方法中的大量方法的任一種來獲得，所述文庫包括生物文庫、類肽文庫(具有肽的功能性但是帶有新的非肽骨架的分子的文庫，所述骨架對酶降解具有抗性但仍然保留生物活性；參見例如Zuckennann等，J. Med. Chem. 37 :2678-85 [1994])、空間可尋址平行固相或溶液相文庫、需要去褶合的合成文庫方法、“一顆珠子一種化合物”的文庫方法、以及使用親和層析選擇的合成文庫方法。生物文庫和類肽文庫方法優(yōu)選用于肽文庫，而其他四種方法適用于肽、非肽低聚物、或化合物的小分子文庫(Lam(1997) Anticancer Drug Des. 12 :145)。用于合成分子文庫的方法的實例可以在本技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)，例如在下述文獻中Deffitt 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 :6909 [1993] ；Erb 等，Proc. Nad. Acad. Sci.USA 91 :11422 [1994] ；Zuckermann 等，J. Med. Chem. 37 :2678 [1994] ；Cho 等，Science 261 1303 [1993] ；Carre11 等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33. 2059[1994] ；Care11 等，Angew.Chem. Int. Ed. Engl. 33 :2061 [1994];以及 Gallop 等，J. Med. Chem. 37 :1233 [1994]。化合物文庫可以存在于溶液中(例如Houghten, Biotechniques 13 412-421 [1992])，或存在于珠子(Lam, Nature 354 :82-84[1991])、芯片(Fodor, Nature364 :555-556[1993])、細菌或孢子(美國專利5，223，409 ;在此引為參考)、質(zhì)粒(Cull等，Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89 :1865_1869[1992])或噬菌體上(Scott 和 Smith，Science249 :386-390[1990] ；Devlin Science 249 :404-406[1990] ;Cwirla 等，Proc. Natl. Acad.Sci. 87 :6378-6382[1990] ；Felici, J. Mol. Biol. 222 :301[1991])。在一個實施方案中，測定方法是基于細胞的測定方法，其中將表達癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白或其生物活性部分的細胞與測試化合物相接觸，并測定測試化合物調(diào)節(jié)癌癥標(biāo)志物活性的能力。測定測試化合物調(diào)節(jié)癌癥標(biāo)志物活性的能力，可以通過監(jiān)測例如酶活性、破壞或mRNA的變化等來實現(xiàn)。也可以評估測試化合物調(diào)節(jié)癌癥標(biāo)志物與化合物、例如癌癥標(biāo)志物底物或調(diào)節(jié)物結(jié)合的能力。這可以通過例如將化合物例如底物與放射性同位素或酶標(biāo)記物偶聯(lián)來實現(xiàn)，以便化合物例如底物與癌癥標(biāo)志物的結(jié)合可以通過檢測復(fù)合物中的標(biāo)記化合物例如底物來測定?；蛘撸瑢┌Y標(biāo)志物與放射性同位素或酶標(biāo)記物偶聯(lián)，以監(jiān)測測試化合物調(diào)節(jié)癌癥標(biāo)志物與復(fù)合物中的癌癥標(biāo)志物底物結(jié)合的能力。例如，化合物(例如底物)可以用1251、35S、14C或3H直接或間接標(biāo)記，并通過對放射性發(fā)射進行直接計數(shù)或通過閃爍計數(shù)來檢測放射性同位素。或者，化合物可以用例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶進行酶標(biāo)記，并通過測定適合的底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來檢測酶標(biāo)記物。
化合物(例如癌癥標(biāo)志物底物)與癌癥標(biāo)志物相互作用的能力可以在標(biāo)記或不標(biāo)記任何相互作用物的情況下評估。例如，可以使用微生理計在不標(biāo)記化合物或癌癥標(biāo)志物的情況下檢測化合物與癌癥標(biāo)志物的相互作用(McConnell等，Science 257 1906-1912[1992])。當(dāng)在本文中使用時，“微生理計”(例如細胞傳感器)是使用可光尋址的電勢測定傳感器(LAPS)測量細胞酸化其環(huán)境的速率的分析儀器。該酸化速率的變化可用作化合物與癌癥標(biāo)志物之間的相互作用的指示物。在另一個實施方案中，提供了無細胞測定方法，其中將癌癥標(biāo)志物蛋白或其生物活性部分與測試化合物相接觸，并評估測試化合物與癌癥標(biāo)志物蛋白、mRNA或其生物活性部分結(jié)合的能力。用于本發(fā)明的測定方法的癌癥標(biāo)志物蛋白或mRNA的優(yōu)選生物活性部分包括參與與底物或其他蛋白的相互作用的片段，例如具有高表面概率分值的片段。無細胞測定方法包括制備靶基因蛋白與測試化合物的反應(yīng)混合物，在足以允許兩種組分相互作用和結(jié)合的條件下和時間內(nèi)反應(yīng)，從而形成可以被取出和/或檢測的復(fù)合物。也可以使用例如熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)來檢測兩種分子之間的相互作用(參見例如Lakowicz等,美國專利5，631, 169 ；Stavrianopoulos等,美國專利4，968, 103 ;其每個在此引為參考)。對熒光團標(biāo)記物進行選擇，使得第一個供體分子發(fā)射的熒光能量將被第二個“受體”分子上的熒光標(biāo)記物吸收，所述第二個受體分子進而由于吸收能量而發(fā)射熒光?；蛘撸肮w”蛋白分子可以簡單地利用色氨酸殘基的天然熒光能量。選擇的標(biāo)記物發(fā)射不同波長的光，使得“受體”分子的標(biāo)記物可以與“供體”的相區(qū)分。因為標(biāo)記物之間的能量轉(zhuǎn)移效率與分子相隔的距離相關(guān)，因此可以評估分子之間的空間關(guān)系。在分子之間發(fā)生結(jié)合的情形下，“受體”分子標(biāo)記物的熒光發(fā)射將最大化。通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)熒光測定手段(例如使用熒光計)，可以方便地測量FRET結(jié)合事件。在另一個實施方案中，癌癥標(biāo)志物蛋白或mRNA與靶分子結(jié)合的能力的測定，可以使用實時生物分子相互作用分析(BIA)來實現(xiàn)(參見例如Sjolander和Urbaniczky, Anal.Chem. 63 :2338-2345 [1991]以及 Szabo 等，Curr. Opin. Struct. Biol. 5 :699-705 [1995])?！氨砻娴入x激元共振”或“BIA”不用標(biāo)記任何相互作用物即可實時檢測生物特異性相互作用(例如BIAcore)。結(jié)合表面處質(zhì)量的變化(表明結(jié)合事件)導(dǎo)致表面附近光的折射率的改變(表面等離激元共振(SPR)的光學(xué)現(xiàn)象)，產(chǎn)生可檢測信號，其可用作生物分子之間實時反應(yīng)的指示。在一個實施方案中，將靶基因產(chǎn)物或測試物質(zhì)錨定在固相上。錨定在固相上的靶基因產(chǎn)物/測試化合物復(fù)合物可以在反應(yīng)結(jié)束時檢測。優(yōu)選，靶基因產(chǎn)物可以錨定在固相表面上，并且測試化合物(其沒有被錨定)可以用本文中討論的可檢測標(biāo)記物直接或間接
I■■己 O將癌癥標(biāo)志物、抗癌癥標(biāo)志物抗體或其靶分子固定化，以便于將復(fù)合形式中的一種或兩種蛋白與未復(fù)合形式的分離，以及適應(yīng)于測定方法的自動化，可能是理想的。測試化合物與癌癥標(biāo)志物蛋白的結(jié)合，或癌癥標(biāo)志物蛋白與靶分子在候選化合物存在或不存在下的相互作用，可以在適合于包含反應(yīng)試劑的任何容器中進行。這種容器的實例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個實施方案中，可以提供融合蛋白，其添加了允許所述蛋白中的一種或二者與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。例如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-癌癥標(biāo)志物融合蛋白或谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶/靶融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠子(Sigma Chemical,St. Louis,MO)或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板上，然后將其與測試化合物或測試化合物與 未吸附的靶蛋白或癌癥標(biāo)志物蛋白合并，并將混合物在引起復(fù)合物形成的條件下(例如在鹽和PH的生理條件下)溫育。在溫育后，清洗珠子或微量滴定板的孔以除去任何未結(jié)合的組分，在珠子的情況下將基質(zhì)固定化，如上所述直接或間接測定復(fù)合物?；蛘?，可以將復(fù)合物從基質(zhì)上解離，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定癌癥標(biāo)志物的結(jié)合或活性水平。用于將癌癥標(biāo)志物蛋白或靶分子固定化在基質(zhì)上的其他技術(shù)包括使用生物素和鏈親和素的結(jié)合。生物素化的癌癥標(biāo)志物蛋白或靶分子可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals, Rockford, EL)從生物素-NHS (N_輕基-琥拍酰亞胺)制備，并固定化在鏈親和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。為了進行測定，將未固定化的組分添加到含有錨定組分的包被表面上。在反應(yīng)完成后，在使任何形成的復(fù)合物保持固定化在固體表面上的條件下除去(例如通過洗滌)未反應(yīng)組分。錨定在固相表面上的復(fù)合物的檢測可以用各種方式實現(xiàn)。當(dāng)事先未固定化的組分被預(yù)先標(biāo)記時，檢測到在表面上固定化的標(biāo)記物表明復(fù)合物形成。當(dāng)事先未固定化的組分沒有預(yù)先標(biāo)記時，可以使用間接標(biāo)記物檢測錨定在表面上的復(fù)合物，例如使用特異性針對固定化的組分的標(biāo)記抗體(該抗體又可以用例如標(biāo)記的抗IgG抗體直接標(biāo)記或間接標(biāo)記)。這種測定方法使用與癌癥標(biāo)志物蛋白或靶分子具有反應(yīng)性但是不干擾癌癥標(biāo)志物蛋白與其靶分子結(jié)合的抗體來進行。這樣的抗體可以衍生化到板的孔上，并且未結(jié)合的靶或癌癥標(biāo)志物蛋白通過抗體結(jié)合捕獲在孔中。用于檢測這種復(fù)合物的方法，除了上述用于GST固定化復(fù)合物的方法之外，還包括使用與癌癥標(biāo)志物蛋白或靶分子具有反應(yīng)性的抗體進行復(fù)合物的免疫檢測，以及依賴于檢測與癌癥標(biāo)志物蛋白或靶分子相關(guān)的酶活性的酶聯(lián)測定法?；蛘撸瑹o細胞測定方法可以在液相中進行。在這樣的測定方法中，通過多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)中的任一種將反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的組分分離，所述技術(shù)包括但不限于差速離心(參見例如，Rivas和Minton,Trends Biochem Sci 18 :284_7[1993])、層析(凝膠過濾層析、離子交換層析)、電泳(參見例如Ausubel等主編《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(Current Protocolsin Molecular Biology), 1999, J. Wiley New York.)以及免疫沉淀(參見例如 Ausubel 等主編《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(Current Protocols in Molecular Biology), 1999, J. Wiley New York.)。這樣的樹脂和層析技術(shù)對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是公知的(參見例如Heegaard J. Mol. Recognit 11 141-8[1998] ；Hageand Tweed J.Chromatogr. Biomed. Sci.Appl 699 :499-525[1997])。此外，也可以如本文中所述方便地利用熒光能量轉(zhuǎn)移，不需從溶液中進一步純化復(fù)合物即可檢測結(jié)合。測定方法可以包括將癌癥標(biāo)志物蛋白、mRNA或其生物活性部分與結(jié)合癌癥標(biāo)志物的已知化合物結(jié)合以形成測定混合物，將測定混合物與測試化合物相接觸，并測定測試化合物與癌癥標(biāo)志物蛋白或mRNA相互作用的能力，其中測定測試化合物與癌癥標(biāo)志物蛋白或mRNA相互作用的能力包括測定測試化合物與已知化合物相比優(yōu)先結(jié)合癌癥標(biāo)志物或其生物活性部分、或調(diào)節(jié)靶分子活性的能力。對于癌癥標(biāo)志物在體內(nèi)能夠與一種或多種細胞或細胞外大分子、例如蛋白質(zhì)相互作用的程度來說，這種相互作用的抑制劑是有用的。均相測定方法可用于鑒定抑制劑。
例如，制備靶基因產(chǎn)物與相互作用的細胞或細胞外結(jié)合配偶體產(chǎn)物的預(yù)制復(fù)合物，使得靶基因產(chǎn)物或其結(jié)合配偶體被標(biāo)記，但是由標(biāo)記物產(chǎn)生的信號由于復(fù)合物形成而被淬滅(參見例如美國專利4，109, 496，在此引為參考，其利用了這種免疫測定方法)。添加與來自預(yù)制復(fù)合物的一種物質(zhì)競爭并取代它的測試物質(zhì)，將導(dǎo)致產(chǎn)生高于背景的信號。通過這種方式，可以鑒定破壞靶基因產(chǎn)物-結(jié)合配偶體相互作用的測試物質(zhì)?；蛘?，癌癥標(biāo)志物蛋白可以在雙雜交測定法或三雜交測定法中用作“誘餌蛋白”(參見例如美國專利 5, 283, 317 ；Zervos 等，Cell 72 :223-232[1993] ;Madura 等，J. Biol.Chem. 268. 12046-12054[1993] ；Bartel 等，Biotechniques 14 :920-924[1993] ；Iwabuchi等，Oncogene 8 1693-1696 [1993];以及&'ent WO 94/10300 ;其每個在此引為參考)，以鑒定與癌癥標(biāo)志物結(jié)合或相互作用(“癌癥標(biāo)志物結(jié)合蛋白”或“癌癥標(biāo)志物_bp”)和參與癌癥標(biāo)志物活性的其他蛋白。這樣的癌癥標(biāo)志物_bp可以是癌癥標(biāo)志物蛋白的信號或作為例如癌癥標(biāo)志物介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑的下游元件的靶的激活劑或抑制劑。也可以鑒定癌癥標(biāo)志物表達的調(diào)節(jié)物。例如，將細胞或無細胞混合物與候選化合物相接觸，并相對于不存在候選化合物的情況下癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白的表達水平，評估癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白的表達。當(dāng)癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白的表達在候選化合物存在下高于其不存在下的表達時，候選化合物被鑒定為癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白表達的刺激劑?；蛘撸?dāng)癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白的表達在候選化合物存在下低于(即統(tǒng)計學(xué)顯著低于)其不存在下的表達時，候選化合物被鑒定為癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白表達的抑制劑。癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白表達的水平可以通過本文描述的用于檢測癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白的方法來確定?？梢允褂没诩毎幕驘o細胞的測定方法鑒定調(diào)節(jié)劑，并且藥劑調(diào)節(jié)癌癥標(biāo)志物蛋白活性的能力能夠在體內(nèi)得到證實，例如在動物例如疾病的動物模型(例如患有前列腺癌或轉(zhuǎn)移的前列腺癌的動物；或帶有來自于動物(例如人類)的前列腺癌異種移植物的動物)、或來自由前列腺癌轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的癌癥(例如轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、骨或肝臟)的細胞、或來自前列腺癌細胞系的細胞中。本發(fā)明還涉及通過上述的篩選測定法鑒定到的新的藥劑(參見例如下面癌癥治療的描述)。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括將如本文所述鑒定到的藥劑(例如癌癥標(biāo)志物調(diào)節(jié)劑、反義癌癥標(biāo)志物核酸分子、siRNA分子、癌癥標(biāo)志物特異性抗體或癌癥標(biāo)志物結(jié)合配偶體)進一步使用在適合的動物模型中(例如本文描述的模型)，以確定使用這種藥劑的治療的效能、毒性、副作用或作用機制。此外，通過上述篩選測定法鑒定到的新藥劑可以例如用于本文所述的治療。VI.治療性應(yīng)用在某些實施方案中，本發(fā)明提供了癌癥(例如前列腺癌)的療法。在某些實施方案中，療法直接或間接靶向本發(fā)明的基因融合體。A. RNA干擾和反義療法在某些實施方案中，本發(fā)明靶向基因融合體的表達。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明使用了包含寡聚反義或RNAi化合物、特別是寡核苷酸(例如在上面描述的藥物篩選方 法中鑒定的寡核苷酸)的組合物，用于調(diào)節(jié)編碼本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物的核酸分子的功能，最終調(diào)節(jié)表達的癌癥標(biāo)志物的量。I. RNA 干擾(RNAi)在某些實施方案中，使用RNAi抑制融合蛋白功能。RNAi代表了用于控制大多數(shù)真核生物包括人類中外來基因表達的進化保守的細胞防御機制。RNAi典型地由雙鏈RNA(dsRNA)觸發(fā)，并對dsRNA做出響應(yīng)引起單鏈靶RNA同源物的序列特異性mRNA降解。mRNA降解的介導(dǎo)物是小干擾RNA雙鏈體(siRNA)，其通常在細胞中通過酶切割長dsRNA而產(chǎn)生。siRNA通常長度約為21個核苷酸(例如長度為21-23個核苷酸)，并具有以兩個核苷酸3’ -突出為特征的堿基配對結(jié)構(gòu)。在將小RNA或RNAi導(dǎo)入細胞后，據(jù)認(rèn)為序列被遞送到被稱為RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)的酶復(fù)合物。RISC識別靶并使用內(nèi)切核酸酶將其切開。應(yīng)該注意的是，如果將較大的RNA序列遞送到細胞，RNase III酶(Dicer)將較長dsRNA轉(zhuǎn)變成21-23nt的ds siRNA片段。在某些實施方案中，RNAi寡核苷酸被設(shè)計成靶向融合蛋白的連接區(qū)域?；瘜W(xué)合成的siRNA已經(jīng)變成在培養(yǎng)的體細胞中對哺乳動物基因功能進行全基因組分析的有力試劑。除了它們用于驗證基因功能的價值之外，siRNA作為基因特異性治療劑也具有極大潛力(Tuschl 和 Borkhardt,Molecular Intervent. 2002 ；2(3) :158-67,在此引為參考)。將siRNA轉(zhuǎn)染到動物細胞中，引起特定基因的強有力、持久的轉(zhuǎn)錄后沉默(Caplen等，Proc Natl Acad Sci U. S. A. 2001 ；98 :9742-7 ;Elbashir 等，Nature. 2001 ；411 :494-8 ；Elbashir 等，Genes Dev. 2001 ; 15 188-200 ；以及 Elbashir 等，EMBO J. 2001 ；20 =6877-88,其全部在此引為參考)。使用siRNA執(zhí)行RNAi的方法和組合物描述在例如美國專利6，506，559中，在此引為參考。siRNA格外有效地降低被靶向的RNA的量，并推廣到蛋白質(zhì)，經(jīng)常降低到通常檢測不到的水平。沉默效應(yīng)能夠持續(xù)幾個月，并且是格外特異性的，因為靶RNA與siRNA的中心區(qū)域之間一個核苷酸的錯配經(jīng)常足以阻止沉默(Brummelkamp等，Science 2002 ；296 550-3 ;以及 Holen 等，Nucleic Acids Res. 2002 ;30 :1757-66，兩者在此引為參考)。在siRNA設(shè)計中的重要因素是存在可及的siRNA結(jié)合位點。Bahoia等(J. Biol.Chem. ,2003 ；278 :15991-15997 ;在此引為參考)描述了使用一種被稱為掃描陣列的DNA陣列來發(fā)現(xiàn)mRNA中用于設(shè)計有效siRNA的可及位點。這些陣列包含的寡核苷酸的尺寸范圍從單體到一定的最大值，通常為Comer，其使用物理屏障(掩膜)通過逐步添加序列中的每個堿基來合成。因此陣列代表了靶基因區(qū)域的全部寡核苷酸互補物。靶mRNA與這些陣列的雜交提供了該靶mRNA區(qū)域的窮舉的可及譜。這樣的數(shù)據(jù)可用于設(shè)計反義寡核苷酸(范圍從7聚體到25聚體)，其中重要的是在寡核苷酸長度與結(jié)合親和性之間實現(xiàn)折衷，以保留效能和靶特異性(Sohail 等，Nucleic Acids Res. ,2001 ；29(10) :2041-2045)。用于選擇 siRNA 的其他方法和考慮描述在例如 WO 05054270,W005038054AUW003070966A2, J MolBiol.2005 May 13 ；348(4) :883-93,J Mol Biol. 2005 May 13 ；348(4) :871-81和NucleicAcids Res. 2003 Aug I ；31(15) :4417-24中，其每個在此以其全文引為參考。此外，用于選擇siRNA的軟件(例如，MWG在線siMAX siRNA設(shè)計工具)是商業(yè)或公眾可獲得的。2.反義在其他實施方案中，使用與一種或多種編碼本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物的核酸特異性雜交的反義化合物調(diào)節(jié)融合蛋白表達。寡聚體化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾了所述核
酸的正常功能。這種通過與靶核酸特異性雜交的化合物對靶核酸功能的調(diào)節(jié)一般被稱為“反義”。被干擾的DNA功能包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的RNA的功能包括所有至關(guān)重要的功能例如RNA向蛋白翻譯位點的易位、從RNA翻譯蛋白、剪接RNA以獲得一種或多種mRNA物質(zhì)、以及可能由RNA參與或促進的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總體效應(yīng)是調(diào)節(jié)本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物的表達。在本發(fā)明的情形中，“調(diào)節(jié)”是指基因表達的增加(刺激)或降低(抑制)。例如，可以抑制表達以潛在地阻止腫瘤增殖。優(yōu)選靶向特異性核酸以求反義。在本發(fā)明的情形中，將反義化合物“靶向”特定核酸是多步驟的過程。該過程通常始于鑒定要調(diào)節(jié)功能的核酸序列。這可以是例如其表達與特定障礙或疾病狀態(tài)相關(guān)的細胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或來自感染性因子的核酸分子。在本發(fā)明中，靶是編碼本發(fā)明的基因融合體的核酸分子。靶向過程還包括確定該基因中的位點，所述位點用于反義相互作用以便產(chǎn)生所需效應(yīng)例如蛋白表達的檢測或調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的情形中，優(yōu)選的基因內(nèi)位點是涵蓋基因的開放閱讀框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的區(qū)域。因為翻譯起始密碼子典型為5’-AUG (在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應(yīng)的DNA分子中為5’ -ATG)，因此翻譯起始密碼子也被稱為“AUG密碼子”、“起始密碼子”或“AUG起始密碼子”。少部分基因具有RNA序列為5’ -GUG、5’ -UUG或5’ -CUG的翻譯起始密碼子，并且5’ -AUA、5’ -ACG和5’ -CUG已顯示在體內(nèi)有功能。因此，術(shù)語“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可以涵蓋許多密碼子序列，盡管在每種情況下初始氨基酸典型為甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰基甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可以具有兩種以上可變起始密碼子，其任一種可以優(yōu)選用于具體細胞類型或組織、或在一組具體條件下的翻譯起始。在本發(fā)明的情形中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”是指在體內(nèi)用于從編碼本發(fā)明的腫瘤抗原的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子啟動翻譯的密碼子，而不管這些密碼子的序列?；虻姆g終止密碼子(或“終止密碼子”)可以具有三種序列之一(即5’ -UAA、5’ -UAG和5’ -UGA ;相應(yīng)的DNA序列分別為5’ -TAA、5’ -TAG和5’ -TGA)。術(shù)語“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”是指這種mRNA或基因涵蓋了從翻譯起始密碼子起在任一方向(即5’或3’)上約25至約50個連續(xù)核苷酸的部分。同樣地，術(shù)語“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”是指這種mRNA或基因涵蓋了從翻譯終止密碼子起在任一方向(即5’或3’)上約25至約50個連續(xù)核苷酸的部分。
開放閱讀框(ORF)或“編碼區(qū)”是指翻譯起始密碼子與翻譯終止密碼子之間的區(qū)域，也是可以被有效靶向的區(qū)域。其他靶區(qū)域包括5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，其是指mRNA從翻譯起始密碼子起5’方向上的部分，因此包括了 mRNA的5’帽位點與翻譯起始密碼子之間的核苷酸或基因上的相應(yīng)核苷酸，以及3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)，其是指mRNA從翻譯終止密碼子起3’方向上的部分，因此包括了 mRNA的翻譯終止密碼子與3’末端之間的核苷酸或基因上的相應(yīng)核苷酸。mRNA的5’帽包含通過5’ -5’磷酸三酯鍵與mRNA的最5’端殘基相連的N7-甲基化鳥苷殘基。mRNA的5’帽區(qū)被認(rèn)為包含了 5’帽結(jié)構(gòu)本身以及與帽相鄰的前50個核苷酸。帽區(qū)也可以是優(yōu)選的靶區(qū)域。盡管一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物直接翻譯，但許多含有一個或多個被稱為“內(nèi)含子”的區(qū)域，內(nèi)含子在翻譯之前從轉(zhuǎn)錄物中切除。剩余的(以及因此被翻譯的)區(qū)域被稱為“外顯子”，并被剪接在一起形成連續(xù)的mRNA序列。mRNA剪接位點(即內(nèi)含子_外顯子連接處)也可以是優(yōu)選的靶區(qū)域，并且在異常剪接與疾病相關(guān)或特定mRNA剪接產(chǎn)物的過表達與疾病相關(guān)的情況下特別有用。由于重排或缺失造成的異常融合體連接處也是優(yōu)選的靶。還已發(fā)現(xiàn)，對于靶向例如DNA或mRNA前體的反義化合物來說，內(nèi)含子也可以是有效的、并因此優(yōu)選的靶區(qū)域?！ぴ谀承嵤┓桨钢?，用于反義抑制的靶位點使用可商購軟件程序來鑒定(例如Biognostik,Gottingen,德國；SysArris Software,Bangalore,印度；Antisense ResearchGroup, University of Liverpool, Liverpool,英格蘭；GeneTrove, Carlsbad, CA)。在其他實施方案中，反義抑制的靶位點使用在PCT公布No. W00198537A2中描述的可及位點方法來鑒定，所述文獻在此引為參考。一旦鑒定到一個或多個靶位點后，選擇與靶具有足夠互補性(即雜交足夠好并具有足夠特異性)的寡核苷酸以提供所需效果。例如，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，反義寡核苷酸靶向起始密碼子或其附近。在本發(fā)明的情形中，對于反義組合物和方法來說，“雜交”是指互補核苷或核苷酸堿基之間的氫鍵形成，其可以是Watson_Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氫鍵形成。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過形成氫鍵配對的互補核酸堿基。應(yīng)該理解，反義化合物的序列不需要與其靶核酸100%互補才能特異性雜交。當(dāng)反義化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾了靶DNA或RNA的正常功能，引起功用喪失，并存在足夠程度的互補性以避免在特異性結(jié)合所需的條件下(即在體內(nèi)測定或治療性治療情況中的生理條件下，或體外測定情況中的執(zhí)行測定的條件下)反義化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合時，反義化合物就是可特異性雜交的。反義化合物通常被用作研究試劑和診斷試劑。例如，能夠特異性抑制基因表達的反義寡核苷酸可用于闡述特定基因的功能。反義化合物也可用于例如辨別生物途徑的各個成員的功能。反義的特異性和靈敏度也適用于治療性應(yīng)用。例如，反義寡核苷酸已在動物和人類的疾病狀態(tài)的治療中用作治療性部分。反義寡核苷酸已安全有效地給藥于人類，并且大量臨床試驗?zāi)壳罢谶M行中。因此確定了寡核苷酸是有用的治療模式，其可以被配置成可用于治療細胞、組織和動物特別是人類的治療方案中。盡管反義寡核苷酸是反義化合物的優(yōu)選形式，但本發(fā)明包含了其他寡聚反義化合物，包括但不限于例如下面描述的寡核苷酸模擬物。本發(fā)明的反義化合物優(yōu)選包含約8至約30個核酸堿基(即約8至約30個相連的堿基)，盡管更長和更短的序列也可以在本發(fā)明中找到應(yīng)用。特別優(yōu)選的反義化合物是反義寡核苷酸，更優(yōu)選的是包含約12至約25個核酸堿基的反義寡核苷酸?？捎糜诒景l(fā)明的優(yōu)選反義化合物的具體實例包括含有修飾骨架或非天然核苷間連鍵的寡核苷酸。正如在本說明書中所定義的，具有修飾骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子和在骨架中不具有磷原子的寡核苷酸。出于本說明書的目的，在其核苷間骨架中不具有磷原子的修飾的寡核苷酸也可以被當(dāng)作寡核苷酸。優(yōu)選的修飾寡核苷酸骨架包括例如具有正常的3’ -5’連鍵的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷 基膦酸酯包括3’-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯、氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫逐氨基磷酸酯、硫逐烷基膦酸酯、硫逐烷基磷酸三酯和硼代磷酸酯，它們的2’ -5’連接的類似物，以及具有顛倒極性、其中相鄰的核苷單元對以3’ -5’到5’ -3’或2’ -5’到5’ -2’連接的類似物。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。優(yōu)選的其中不包括磷原子的修飾寡核苷酸骨架，具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連鍵、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連鍵、或一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連鍵形成的骨架。它們包括具有嗎啉代連鍵(部分從核苷的糖部分形成)的骨架，硅氧烷骨架，硫醚、亞砜和砜骨架，甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰骨架，亞甲基甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰骨架，含亞烷基骨架，氨基磺酸酯骨架，亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架，磺酸酯和磺酰胺骨架，酰胺骨架，以及其他具有混合的N、O、S和CH2組成部分的骨架。在其他優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間連鍵(即骨架)被新的基團代替。維持了堿基單元與適合的核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物是已顯示出具有出色的雜交性質(zhì)的寡核苷酸模擬物，被稱為肽核酸(PM)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架、特別是氨基乙基甘氨酸骨架代替。核酸堿基被保留，并與骨架的酰胺部分的氮雜氮原子直接或間接相連。教授PNA化合物的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利No. 5，539，082,5, 714，331和5，719，262，其每個在此引為參考。關(guān)于PNA化合物的進一步講授可見于Nielsen等，Science 254 1497 (1991)。本發(fā)明的最優(yōu)選實施方案是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸，和具有雜原子骨架、特別是上面引用的美國專利 5，489, 677 的一CH2、一NH-O-CH2—、一CH2—N (CH3) —0—CH2--[被稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架]、--CH2-O-N(CH3)—CH2—、一CH2—N(CH3) —N(CH3) -CH2--和一O-N (CH3) -CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯骨架被表示成--O--P--O-CH2--]骨架以及上面引用的美國專利5，602，240的酰胺骨架的寡聚核苷。此外，優(yōu)選的是具有上面引用的美國專利5，034，506的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾的寡核苷酸也可以含有一個或多個取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置包含下列之一 0H ；F ;0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或0-烷基-0-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1到Cltl烷基或C2到Cltl烯基和炔基。特別優(yōu)選的是 0[ (CH2)n0]mCH3、O(CH2)n0CH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2 和0(CH2)n0N[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是I至約10。其他優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置包含下列之一 C1到Cltl短鏈烷基、取代的短鏈烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團、報告基團、嵌入劑、用于改進寡核苷酸的藥物動力學(xué)性質(zhì)的基團或用于改進寡核苷酸的藥效學(xué)性質(zhì)的基團，以及其他具有類似性質(zhì)的取代基。優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧基乙氧基(2’ -O--CH2CH2OCH3，也被稱為2’ -0-(2-甲氧基乙基)或 2’ -M0E) (Martin 等，Helv. Chim. Acta 78 :486[1995]),即燒氧基燒氧基基團。其他優(yōu)選的修飾包括2’ 二甲基氨基氧基乙氧基(即O(CH2)2ON(CH3)2基團)，也被稱為2’-DMA0E，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本技術(shù)領(lǐng)域中也稱為2’-0-二甲基氨基乙氧基乙基或 2’ _DMAE0E)，即 2’ _0—CH2—0—CH2一N(CH2)2。其他優(yōu)選的修飾包括2’-甲氧基(2’-0—CH3)、2’_氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’ -氟(2’ -F)。類似的修飾也可以在寡核苷酸的其他位置上作出，特別是在3’末端核苷酸上的糖的3’位置或在2’ -5’連接的寡核苷酸中以及5’末端 核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可以具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分代替戊呋喃糖基糖。寡核苷酸也可以包括核酸堿基(在本技術(shù)領(lǐng)域中經(jīng)常簡稱為“堿基”)修飾或取代。當(dāng)在本文中使用時，“未修飾的”或“天然”核酸堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核酸堿基包括其他合成和天然的核酸堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、
4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤和7-去氮雜腺嘌呤、以及
3-去氮雜鳥嘌呤和3-去氮雜腺嘌呤。其他核酸堿基包括在美國專利3，687，808中公開的。這些核酸堿基中的某些對于增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和性特別有用。它們包括
5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示出將核酸雙鏈體的穩(wěn)定性增加0. 6-1. 2°C，并且是目前優(yōu)選的堿基取代，特別是當(dāng)與2’ -0-甲氧基乙基糖修飾組合時。本發(fā)明的寡核苷酸另一種修飾涉及向寡核苷酸化學(xué)連接一個或多個增強寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取的部分或結(jié)合物。這樣的部分包括但不限于脂類部分例如膽固醇部分、膽酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如二 -十六烷基-消旋甘油或1，2- 二 -0-十六烷基-消旋甘油-3-H-膦酸三乙基銨)、多胺或聚乙二醇鏈或金剛烷乙酸、棕櫚基部分或十八胺或己基氨基-羰基-氧基膽固醇部分。相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員非常了解如何產(chǎn)生含有上述修飾的寡核苷酸。本發(fā)明不限于上面描述的反義寡核苷酸。可以利用任何適合的修飾或取代。在給定化合物中不是所有位置都需要一致修飾，事實上單一化合物乃至寡核苷酸內(nèi)的單一核苷內(nèi)可以摻入超過一種上述修飾。本發(fā)明還包括作為嵌合化合物的反義化合物。在本發(fā)明的情形中，“嵌合”反義化合物或“嵌合體”是含有兩種或多種化學(xué)上不同的區(qū)域的反義化合物、特別是寡核苷酸，其中每個區(qū)域由至少一個單體單元、即在寡核苷酸化合物的情況下的核苷酸構(gòu)成。這些寡核苷酸典型地含有至少一個區(qū)域，其中寡核苷酸被修飾以便賦予寡核苷酸對核酸酶降解的抗性增加、細胞攝取增加和/或?qū)Π泻怂岬慕Y(jié)合親和性增加。寡核苷酸的其他區(qū)域可以用作能夠切開RNA:DNA或RNA:RNA雜合體的酶的底物。例如，RNaseH是能夠切開RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈的細胞內(nèi)切核酸酶。因此，RNase H的活化導(dǎo)致切開RNA靶，從而極大增強寡核苷酸抑制基因表達的效率。因此，當(dāng)使用嵌合寡核苷酸時，相比于與相同靶區(qū)域雜交的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸，以更短的寡核苷酸往往能夠獲得類似的結(jié)果。RNA靶的切開可以通過凝膠電泳以及如果需要的話通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)來常規(guī)檢測。
本發(fā)明的嵌合反義化合物可以作為上面描述的兩種或多種寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)來形成。本發(fā)明還包括如下所述的包含本發(fā)明的反義化合物的藥物組合物和劑型。B.基因治療本發(fā)明設(shè)想了使用任何遺傳操作用于調(diào)節(jié)本發(fā)明的基因融合體的表達。遺傳操作的實例包括但不限于基因敲除(例如使用例如重組將融合基因從染色體上除去)、帶有或不帶誘導(dǎo)型啟動子的反義構(gòu)建物的表達等。在體外或體內(nèi)將核酸構(gòu)建物遞送到細胞，可以使用任何適合的方法來進行。適合的方法是將核酸構(gòu)建物導(dǎo)入細胞使得所需事件(例如反義構(gòu)建物的表達)發(fā)生的方法。遺傳治療也可用于遞送siRNA或在體內(nèi)表達(例如在被誘導(dǎo)型啟動子(例如雄激素響應(yīng)性啟動子)刺激后)的其他干擾分子。將攜帶遺傳信息的分子導(dǎo)入細胞是通過各種方法中的任一種來實現(xiàn)的，所述方法包括但不限于直接注射裸DNA構(gòu)建物、使用載有所述構(gòu)建物的金粒子進行轟擊、以及使用例如脂質(zhì)體、生物聚合物等進行的大分子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的方法使用源自于病毒的基因遞送載體，所述病毒包括但不限于腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒和腺相關(guān)病毒。由于與反轉(zhuǎn)錄病毒相比具有更高的效率，源自于腺病毒的載體是用于在體內(nèi)將核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主細胞中的優(yōu)選基因遞送載體。已經(jīng)顯示，腺病毒載體在動物模型的各種實體腫瘤中以及在免疫缺陷小鼠的人類實體腫瘤異種移植物中，提供了非常有效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。用于基因轉(zhuǎn)移的腺病毒載體和方法的實例描述在PCT公布WO 00/12738和WO 00/09675以及美國專利申請 No. 6，033，908,6, 019，978,6, 001，557,5, 994，132,5, 994，128,5, 994，106、5981，225,5, 885，808,5, 872，154,5, 830，730 和 5，824，544 中，其每個在此以其全文引為參考。載體可以以各種方式給藥于對象。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，使用直接注射將載體給藥到腫瘤或與腫瘤相聯(lián)的組織中。在其他實施方案中，通過血液或淋巴循環(huán)給藥(參見例如PCT公布99/02685，在此以其全文引為參考)。腺病毒載體的示例性劑量水平優(yōu)選向灌注液添加IO8至IO11個載體粒子。C.抗體治療在某些實施方案中，本發(fā)明提供了靶向表達本發(fā)明的基因融合體的前列腺腫瘤的抗體。在本文公開的治療方法中可以利用任何適合的抗體(例如多克隆、多克隆或合成的抗體)。在優(yōu)選實施方案中，用于癌癥治療的抗體是人源化抗體。將抗體人源化的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的(參見例如美國專利No. 6, 180, 370,5, 585, 089,6, 054, 297
5，565，332，其每個在此引為參考)。
在某些實施方案中，治療性抗體包含針對本發(fā)明的基因融合體產(chǎn)生的抗體，其中抗體與細胞毒性劑結(jié)合。在這樣的實施方案中，產(chǎn)生了不靶向正常細胞的腫瘤特異性治療齊U，從而減少了傳統(tǒng)化療的許多不利副作用。對于某些應(yīng)用來說，設(shè)想治療劑將是可用作連接抗體的有用藥劑的藥理學(xué)藥劑，特別是具有殺死或抑制內(nèi)皮細胞生長或細胞分裂的細胞毒性或其他抗細胞藥劑。本發(fā)明設(shè)想了使用任何能夠與抗體結(jié)合并以活性形式遞送的藥理學(xué)藥劑。示例性的抗細胞藥劑包括化療藥劑、放射性同位素和細胞毒素。本發(fā)明的治療性抗體可以包括各種細胞毒性部分，包括但不限于放射活性同位素(例如碘-131、碘-123、锝-99m、銦-111、錸-188、錸-186、鎵-67、銅-67、釔-90、碘-125或砹-211)、激素例如甾類、抗代謝物例如胞嘧啶(例如阿拉伯糖苷、氟尿嘧唆、氨甲蝶呤或氨基喋呤；蒽環(huán)類藥物；絲裂霉素C)、長春花生物堿(例如秋水仙胺、依托泊苷、光神霉素)以及抗腫瘤烷基化藥劑例如苯丁酸氮芥或美法侖。其他實施方案可以包括藥劑例如抗凝劑、細胞因子、生長因子、細菌內(nèi)毒素或細菌內(nèi)毒素的脂A部分。例如，在某些實施方案中，治療藥劑可以包括植物、真菌或細菌來源的毒素，例如A鏈毒素、核糖體失活蛋白、a-帚曲菌素、曲霉菌素、局限曲菌素、核糖核酸酶、白喉毒素或假單胞菌外毒素，這僅僅是舉幾個例子。在某些優(yōu)選實施方案中，使用去糖基化蓖麻毒蛋白A鏈。 在任何情況下，已經(jīng)提出例如這些的藥劑，如果需要可以使用已知的結(jié)合技術(shù)(參見例如Ghose等,Methods Enzymol. ,93 280[1983])與抗體成功結(jié)合,所述結(jié)合的方式將允許它們根據(jù)需要在被靶向的腫瘤細胞位點處尋靶、內(nèi)化、釋放或呈遞給血液組分。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了靶向本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物(例如ERG或ETVl融合體)的免疫毒素。免疫毒素是特異性靶向藥劑、典型為腫瘤定向抗體或片段與細胞毒性藥劑例如毒素部分的結(jié)合物。靶向藥劑將毒素導(dǎo)向攜帶有被靶向抗原的細胞并因此選擇性殺死它們。在某些實施方案中，治療性抗體使用提供高的體內(nèi)穩(wěn)定性的交聯(lián)劑(Thorpe 等，Cancer Res. ,48 :6396 [1988])。在其他實施方案中，特別是涉及實體腫瘤治療的實施方案中，抗體被設(shè)計成通過抑制血管內(nèi)皮細胞的生長或細胞分裂而對腫瘤血管系統(tǒng)具有細胞毒性或其他抗細胞效應(yīng)。這種攻擊目的在于引起腫瘤局域性血管崩坍，剝奪腫瘤細胞、特別是血管系統(tǒng)遠端的腫瘤細胞的氧氣和營養(yǎng)物，最終引起細胞死亡和腫瘤壞死。在優(yōu)選實施方案中，基于抗體的治療藥物被配制成如下所述的藥物組合物。在優(yōu)選實施方案中，給藥本發(fā)明的抗體組合物導(dǎo)致癌癥可測量的縮小(例如腫瘤的縮小或消除)。D.藥物組合物本發(fā)明還提供了藥物組合物(例如包含調(diào)節(jié)本發(fā)明的基因融合體的表達或活性的藥劑)。取決于需要的是局部還是全身治療并取決于待治療的區(qū)域，本發(fā)明的藥物組合物可以用多種方式給藥。給藥可以是局部(包括眼部和粘膜包括陰道和直腸遞送)、肺部(例如通過吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮)、口或腸胃外給藥。腸胃外給藥包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或灌注；或顱內(nèi)例如鞘內(nèi)的或腦室內(nèi)給藥。用于局部給藥的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼片、軟膏、洗劑、霜劑、凝膠、滴齊U、栓劑、噴劑、液體和粉劑。常規(guī)的藥物載體、水性、粉末或油性基料、增稠劑等，可以是需要或合乎需要的。用于口服給藥的組合物或制劑包括粉劑或顆粒劑、在水或非水性介質(zhì)中的懸液或溶液、膠囊、袋劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是合乎需要的。用于腸胃外、鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給藥的組合物和制劑可以包括無菌水性溶液，其還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其他適合的添加劑例如但不限于滲透增強劑、載體化合物和其他可藥用載體或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳液和含脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以從各種各樣的組分產(chǎn)生，包括但不限于預(yù)制液體、自乳化固體和自乳化半固體?？梢苑奖愕匾詥挝粍┬痛嬖诘谋景l(fā)明的藥物劑型，可以按照制藥工業(yè)中公知的常規(guī)技術(shù)來制備。這樣的技術(shù)包括將活性成分與藥物載體或賦形劑進行混合的步驟。一般來說，通過將活性成分與液體載體或細分的固體載體或兩者均勻充分地混合，然后如果需要 對產(chǎn)品進行成形，來制備劑型。本發(fā)明的組合物可以配制成許多可能劑型中的任一種，所述劑型例如但不限于片齊U、膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物也可以配制成在水性、非水性或混合介質(zhì)中的懸液。水性懸液還可以含有增加懸液粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸液還可以含有穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物可以作為泡沫劑配制并使用。藥物泡沫劑包括的制劑例如但不限于乳液、微乳液、霜劑、膠凍和脂質(zhì)體。盡管在本質(zhì)上基本相似，但這些劑型在組分和終產(chǎn)物的稠度方面各不相同。在細胞水平上增強寡核苷酸攝取的藥劑也可以添加到本發(fā)明的藥物和其他組合物中。例如，陽離子脂類例如Iipofectin(美國專利5，705, 188)、陽離子型甘油衍生物和聚陽離子分子例如聚賴氨酸(W0 97/30731)，也增加寡核苷酸的細胞攝取。本發(fā)明的組合物可以另外含有常規(guī)見于藥物組合物中的其他輔助組分。因此，例如，組合物可以含有附加的、相容的、有藥物活性的物質(zhì)，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或者可以含有對本發(fā)明組合物的各種劑型的物理配制有用的其他材料，例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧化劑、乳濁劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，這樣的材料在添加時，不應(yīng)該過度地干擾本發(fā)明組合物的組分的生物活性。制劑可以被滅菌，并且如果需要，可以與不與制劑的核酸發(fā)生有害相互作用的輔助劑混合，所述輔助劑例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽類、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香物質(zhì)等。本發(fā)明的某些實施方案提供了藥物組合物，其含有(a) —種或多種反義化合物，以及(b) —種或多種通過非反義機制起作用的其他化療藥劑。這樣的化療藥劑的實例包括但不限于抗癌藥物例如道諾紅菌素、更生霉素、阿霉素、博來霉素、絲裂霉素、氮芥子氣、苯丁酸氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5_氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、長春新堿、長春堿、依托泊苷、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)?？寡姿幬锇ǖ幌抻诜晴拮蹇寡姿幬锖推べ|(zhì)類固醇，以及抗病毒藥物包括但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、阿苷洛韋和更昔洛韋，也可以組合在本發(fā)明的組合物中。其他非反義化療藥劑也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。兩種或多種組合的化合物可以一起或相繼使用。
劑量取決于待治療疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和響應(yīng)性，其中治療過程持續(xù)數(shù)日至數(shù)月，或直到實現(xiàn)治愈或獲得疾病狀態(tài)的消減?？梢詮幕颊唧w內(nèi)藥物積累的測量值計算出最適的給藥日程安排。給藥的醫(yī)生可以容易地確定最適劑量、給藥方法和重復(fù)頻率。最適劑量可以隨著各寡核苷酸的相對效力而變，一般可以根據(jù)在體外和體內(nèi)動物模型中發(fā)現(xiàn)有效的EC5q或根據(jù)本文所述的實例進行估算。一般來說，劑量為每kg體重0. 01 y g至100g，并且可以每日、每周、每月或每年給藥一次或多次。治療醫(yī)生可以根據(jù)藥物在體液或組織中的測量的停留時間和濃度估算給藥的重復(fù)頻率。在成功治療后，可能希望使對象經(jīng)歷維持治療以防止疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中寡核苷酸以維持劑量給藥，其范圍從每kg體重0. Olii g至100g，每日一次或多次到每20年一次。VII.轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明設(shè)想了包含本發(fā)明的外源癌癥標(biāo)志物基因(例如基因融合體)或其突變體和變體(例如截短或單核苷酸多態(tài)性)的轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生。在優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物與野生型動物相比顯示出改變的表型(例如標(biāo)志物的增加或減少出現(xiàn))。分析這些表型的存在或不存在的方法包括但不限于本文公開的方法。在一些優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)基因 動物還表現(xiàn)出腫瘤生長或癌癥依據(jù)的增加或減少。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物可用于藥物(例如癌癥治療)篩選。在某些實施方案中，將測試化合物(例如懷疑可用于治療癌癥的藥物)和對照化合物(例如安慰劑)給藥于轉(zhuǎn)基因動物和對照動物，并對效應(yīng)進行評估。轉(zhuǎn)基因動物可以通過各種方法產(chǎn)生。在某些實施方案中，使用處于各種發(fā)育階段的胚胎細胞來導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。根據(jù)胚胎細胞的發(fā)育階段使用不同的方法。合子是用于未注射的最好的靶。在小鼠中，雄原核達到直徑約20微米的大小，允許可重復(fù)地注射1-2皮升(pi)的DNA溶液。使用合子作為基因轉(zhuǎn)移的靶的主要優(yōu)點在于，在大多數(shù)情況下被注射的DNA將在第一次卵裂前摻入到宿主基因組中(Brinster等，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 82 :4438-4442 [1985])。結(jié)果，轉(zhuǎn)基因非人類動物的所有細胞將帶有摻入的轉(zhuǎn)基因。這一般也將反映在轉(zhuǎn)基因向建立者后代的有效傳遞中，因為50%的生殖細胞將帶有轉(zhuǎn)基因。美國專利4，873，191描述了合子的微注射方法；該專利的公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。在其他實施方案中，使用反轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨祟悇游?。在某些實施方案中，通過將反轉(zhuǎn)錄病毒載體注入卵母細胞的卵周空間，利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染卵母細胞(美國專利6，080，912，在此引為參考)。在其他實施方案中，可以將發(fā)育中的非人類胚胎在體外培養(yǎng)到囊胚階段。在此期間，卵裂球可以作為反轉(zhuǎn)錄病毒感染的靶(Janenich，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 :1260[1976])。卵裂球的有效感染可以通過酶處理以除去透明帶來獲得(Hogan 等，《操作小鼠胚胎》(Manipulating the Mouse Embryo), Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. [1986])。用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)典型為帶有轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner等，Proc. Natl. Acad Sci.USA 82 :6927[1985])。通過將卵裂球在單層病毒產(chǎn)生細胞上培養(yǎng)，可以容易有效地獲得轉(zhuǎn)染(Stewart等，EMBO J.，6 :383 [1987])?；蛘撸腥究梢栽诟淼碾A段執(zhí)行?？梢詫⒉《净虿《井a(chǎn)生細胞注射到囊胚腔中(Jahner等，Nature 298 :623 [1982])。大多數(shù)建立者對于轉(zhuǎn)基因是嵌合的，因為摻入只發(fā)生在形成轉(zhuǎn)基因動物的一部分細胞中。此外，建立者可能在基因組的不同位置處包含轉(zhuǎn)基因的各種反轉(zhuǎn)錄病毒插入，其在后代中一般將分離。此外，還可能通過妊娠中期胚胎的子宮內(nèi)反轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因?qū)敕N系，盡管效率較低(Jahner等，同上[1982])。本技術(shù)領(lǐng)域已知的使用反轉(zhuǎn)錄病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的其他手段，包括將反轉(zhuǎn)錄病毒粒子或絲裂霉素C處理的反轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生細胞微注射到受精卵或早期胚胎的卵周空間中(PCT國際專利申請WO 90/08832 [1990]，以及Haskell和Bowen, Mol.Reprod. Dev. ,40 :386[1995])。在其他實施方案中，將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛ジ杉毎?，并使用轉(zhuǎn)染的干細胞形成胚胎。ES細胞通過將預(yù)先植入的胚胎在體外的適合條件下培養(yǎng)來獲得(Evans等，Nature 292 154 [1981] ；Bradley 等，Nature 309 :255 [1984] ；Gossler 等，Proc. Acad. Sci. USA 83:9065[1986];和Robertson等,Nature 322 :445[1986])。轉(zhuǎn)基因可以利用本技術(shù)領(lǐng)域已知的各種方法通過DNA轉(zhuǎn)染有效地導(dǎo)入ES細胞，所述方法包括磷酸鈣共沉淀、原生質(zhì)體或原生質(zhì)球融合、脂轉(zhuǎn)染和DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)基因也可以通過反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)或通過微注射導(dǎo)入到ES細胞中。這些轉(zhuǎn)染的ES細胞在導(dǎo)入到囊胚階段胚胎的囊胚腔中之后定植于胚胎，并促成所產(chǎn)生的嵌合動物的種系(綜述參見Jaenisch, Science 240 1468 [1988])。在將轉(zhuǎn)染的ES細胞導(dǎo)入囊胚腔之前，可以對轉(zhuǎn)染的ES細胞實施各種選擇方 案以富集整合有轉(zhuǎn)基因的ES細胞，假如所述轉(zhuǎn)基因具有這樣的選擇手段的話?；蛘?，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)篩選整合有轉(zhuǎn)基因的ES細胞。這種技術(shù)不需要將轉(zhuǎn)染的ES細胞在轉(zhuǎn)入囊胚腔之前在適合的選擇條件下生長。在其他實施方案中，使用同源重組來敲除基因功能或產(chǎn)生缺失突變體(例如截短突變體)。同源重組的方法描述在美國專利5，614，396中，在此引為參考。實驗提供了下面的實施例以便對本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方面進行演示和進一步說明，這些實施例不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明范圍的限制。實施例I :ERG與ETVl基因融合體A.材料和方法癌癥異常值譜分析(COPA)對Oncomine 3. 0中包含10，486個微陣列實驗的132個基因表達數(shù)據(jù)組進行了COPA分析。此外，COPA分析中包括來自99個擴增的激光捕獲顯微切割前列腺組織樣品的數(shù)據(jù)。COPA分三步進行。首先，將基因表達值以中位數(shù)為中心，將每個基因的中位數(shù)表達值設(shè)為零。其次，計算中位數(shù)的絕對偏差(MAD)，并通過將每個基因表達值除以其MAD而以I為標(biāo)度。使用中位數(shù)和MAD而不是平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差進行變換，以便異常表達值不過份影響分布估算值，因此在歸一化后得到保留。第三，對于每個基因?qū)⒆儞Q過的表達值的75th、9(^和95th百分位數(shù)制表，然后將基因按照其百分位數(shù)分值進行排序，提供了異常值譜的以優(yōu)先順位排列的名單。樣品使用的組織來自于密歇根大學(xué)(University of Michigan)的根治性前列腺切除術(shù)系列和快速尸檢計劃(Rapid Autopsy Program) (Shah等，Cancer Res 64,9209 (Dec 15,2004)), 二者都是密歇根大學(xué)前列腺癌杰出研究專項(Specialized Program of ResearchExcellence) (S. P. 0. R. E.)組織核心的一部分。
也從Ulm大學(xué)醫(yī)院(Ulm，德國)的根治性前列腺切除術(shù)系列獲得組織。所有樣品在得到每個相應(yīng)機構(gòu)的學(xué)術(shù)審查委員會批準(zhǔn)后從同意的患者中收集。使用Trizol (Invitrogen),按照制造商的說明書從所有樣品分離總RNA。也從RWPE、PC3、PC3+AR(Dai 等，Steroids 61，531 (1996) )、LNCaP、VCaP 和 DuCaP 細胞系分離總 RNA。RNA 的完整性通過變性福爾馬林凝膠電泳或Agilent Bioanalyzer 2100進行驗證。還使用了可商購的良性前列腺組織總RNA的合并物(CPP，Clontech)。定量PCR (QPCR)定量PCR(QPCR)在 Applied Biosystems 7300 實時 PCR 系統(tǒng)上，使用 SYBR Green染料基本上按照描述進行(Chinnaiyan 等，Cancer Res 65, 3328 (2005) ; Rub in 等，CancerRes 64,3814(2004))。簡單來說,使用 Superscript III (Invitrogen),在存在隨機引物或隨機引物和寡聚dT引物的情況下，將1-5 u g總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。所有反應(yīng)使用SYBRGreen Master Mix (Applied Biosystems)和正向與反向引物各25ng,使用制造商推薦的熱循環(huán)條件進行。所有反應(yīng)經(jīng)歷了解鏈曲線分析，并將來自所選實驗的產(chǎn)物在I. 5%瓊脂 糖凝膠上通過電泳進行分離。對于每個實驗來說，在QPCR反應(yīng)的指數(shù)期中使用序列檢測軟件 I. 2. 2 版(Sequence Detection Software version I. 2. 2) (Applied Biosystems)設(shè)置閾值水平。使用比較閾值循環(huán)(Ct)方法(Applied Biosystems用戶手冊#2)測定了每個樣品的每個靶基因相對于持家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的量，其中在每個實驗中用作校準(zhǔn)物的cDNA樣品描述在圖例說明中。所有寡核苷酸引物由Integrated DNATechnologies 公司合成。GAPDH 引物如(Vandesompele 等，Genome Biol 3, RESEARCH0034 (2002))中所述，并列出了所有其他引物(表4)。使用前列腺癌cDNA或質(zhì)粒模板的連續(xù)稀釋液證實了引物的效率近似相等，以便使用比較Ct方法。RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴增(RLM-RACE)RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴增使用GeneRacer RLM-RACE試劑盒(Invitrogen)，按照制造商的說明書來進行。首先，通過QPCR根據(jù)ERG或ETVl的表達來選擇樣品。將5微克總RNA用牛腸磷酸酶進行處理以從截短的mRNA和非mRNA除去5’磷酸，并用煙草酸性焦磷酸酶去帽。將GeneRace RNA寡聚物連接到全長轉(zhuǎn)錄本上，并使用Superscript III進行反轉(zhuǎn)錄。為了獲得5’末端,對于ETVl使用GeneRacer 5’引物和ETVl外顯子4-5_r、或者對于ERG使用GeneRacer 5’引物和ERG外顯子4a_r或ERG外顯子4b_r,使用 Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen)擴增第一鏈 cDNA。給出了引物序列(表S2)。將產(chǎn)物在I. 5%瓊脂糖凝膠上通過電泳分離，并將條帶切下、純化并T0P0 TA克隆到pCR 4-T0P0中。使用M13反向和M13正向(-20)引物或T3和T7引物，在ABI Model3730自動測序儀上對來自至少4個克隆的純化的質(zhì)粒DNA進行雙向測序，測序由密歇根大學(xué) DNA 測序中心(University of Michigan DNA Sequencing Core)進行。RLM-RACE 得到的cDNA不用于其他測定。TMPRSS2:ERG融合體的反轉(zhuǎn)錄PCR在如上所述使用QPCR鑒定到TMPRSS2:ERG陽性病例后，使用Platinum Taq HighFi de I i ty和TPRSS2: ERG引物，對同樣的cDNA樣品進行PCR擴增。將產(chǎn)物通過電泳分離，克隆到pCR 4-T0P0中并如上所述進行測序。體外雄激素響應(yīng)性將用人類雄激素受體(PC3+AR) (3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RWPE、LNCaP、VCap DuCaP、PC3和PC3細胞用I %乙醇對照或InM合成的雄激素R1881處理24小時。分離總RNA并如上所述使用ERG外顯子5-6_f和_r引物進行反轉(zhuǎn)錄和QPCR。將每個樣品的ERG/GAPDH的相對量針對RWPE對照樣品進行校正。熒光原位雜交(FISH)使用來自正常外周血淋巴細胞和轉(zhuǎn)移的前列腺癌樣品MET-26和MET-28的福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)組織切片進行間期熒光原位雜交(FISH)分析。此外，在含有來自13個臨床局限性前列腺癌和16個轉(zhuǎn)移前列腺癌樣品的FFPE切片的核心的組織微陣列上，進行了間期FISH。使用雙色雙信號方法，使用了跨越大部分相應(yīng)基因座的探針評估 TMPRSS2與ETVl的融合體。生物素-14-dCTP BAC克隆RP11-124L22用于ETVl基因座，地高辛-dUTP標(biāo)記的BAC克隆RPP11-35CD用于TMPRSS2基因座。為了分析包含ERG的基因重排，使用了分離信號探針策略，使用了跨過ERG基因座的兩個探針(生物素-14-dCTP標(biāo)記的BAC克隆RP11-476D17和地高辛-dUTP標(biāo)記的BAC克隆RP11-95I21)。所有BAC克隆從奧克蘭研究所兒童醫(yī)院(Children，s Hospital of Oakland Research Institute)(CHORD獲得。在組織分析之前，所有探針的完整性和純度通過與正常外周血淋巴細胞的中期涂片進行雜交來驗證。組織雜交、清洗和顏色檢測按照描述進行(Rubin等，Cancer Res64,3814(2004) ;Garraway 等，Nature 436,117(2005))。B.結(jié)果癌癥異常值譜分析近年來，使用DNA微陣列進行的基因表達譜分析已變成研究癌癥轉(zhuǎn)錄組學(xué)的常用方法。微陣列研究為癌癥的分子異質(zhì)性提供了深入的了解，常常鑒定到與腫瘤組織學(xué)、患者結(jié)果和治療響應(yīng)相對應(yīng)的新的疾病分子亞型(Valk等，N Engl J Med 350,1617 (2004)) 0然而，一般來說，轉(zhuǎn)錄組分析不導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新的致癌基因。據(jù)假定，引起癌基因顯著過表達的重排和高水平拷貝數(shù)變化，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中應(yīng)該是明顯的，但以傳統(tǒng)分析方法不一定明顯。在絕大部分癌癥類型中，已經(jīng)觀察到癌基因活化的異質(zhì)樣式，因此，在一類癌癥樣品中搜索基因的共同活化的傳統(tǒng)分析方法(例如t_檢驗或信噪比)不能發(fā)現(xiàn)這樣的癌基因表達譜。相反，需要搜索在一部分病例中明顯過表達的方法。在開發(fā)本發(fā)明的過程中進行的實驗導(dǎo)致開發(fā)出癌癥異常值譜分析(COPA)。COPA通過在基因表達譜的中位數(shù)和中位數(shù)絕對偏差的基礎(chǔ)上進行簡單的數(shù)字變換，設(shè)法突出并鑒定異常值譜(Ross等，Blood 102，2951 (2003))。這種方法顯示在圖5A中。將COPA應(yīng)用于Oncomine數(shù)據(jù)庫(Bittner等，Nature 406，536 (2000))，該數(shù)據(jù)庫包含了代表10，486個微陣列實驗的132個基因表達數(shù)據(jù)組的概覽。在已知發(fā)生復(fù)現(xiàn)性重排或高水平擴增的特定癌癥類型中，COPA正確鑒定到了基因的幾個異常值譜。分析集中于由癌基因普查(Cancer Gene Census)所確定的已知致癌基因的異常值譜(Vasselli 等，Proc Natl Acad Sci U S A 100，6958 (2003))，其在Oncomine數(shù)據(jù)組中排序在前10位異常值情況中(表I和表3)。例如，在Valk等的急性粒細胞性白血病(AML)數(shù)據(jù)組中，RUNX1T1 (ETO)在95th百分位數(shù)處具有最強的異常值譜，與該基因在AML亞組中已知的易位和致癌活性相符(Davis等，Proc Natl Acad Sci U S A100,6051 (2003))(表I)。異常值譜與具有已記載的融合了 RUNXl (AMLl)和RUNX1T1 (ETO)的t(8;21)易位的病例精確相關(guān)(圖5B)。同樣地，在Ross等的急性成淋巴細胞白血病(ALL)數(shù)據(jù)組中，PBXl在90th百分位數(shù)處顯示出最強的異常值譜，與在ALL亞組中已知發(fā)生的 E2A-PBX1 易位相一致(Segal 等，J Clin Oncol 21,1775(2003))(表 I)。同樣地，異常值表達譜與該ALL組中特征性t (I ；19)E2A-PBX1易位精確相關(guān)(圖51C)。在前列腺癌中鑒定ETS家族成員ERG和ETVl的異常值譜接下來對新的COPA預(yù)測進行檢驗。在幾個獨立的數(shù)據(jù)組中，COPA鑒定到了 ERG和ETVl在前列腺癌中的強的異常值譜，ERG和ETVl是已知與尤文氏肉瘤和粒細胞性白血病中的致癌易位相關(guān)的兩種ETS家族轉(zhuǎn)錄因子(Lapointe等，Proc Natl Acad Sci USA101,811 (2004) ;Tian 等，N Engl J Med 349, 2483 (2003))。在 Dhanasekaran 等(Keats 等，Blood 105,4060 (2005))、Welsh 等(Dhanasekaran 等，F(xiàn)aseb J 19, 243 (2005))和 Lapointe等(Wang等，Lancet 365,671 (2005))的前列腺癌基因表達數(shù)據(jù)組中，ERG在75th百分位數(shù)處具有分值最高的異常值譜(表I)，而在Lapointe等和Tomlins等(Welsh等,Cancer Res 61,5974(2001))的數(shù)據(jù)組中，ETVl在90th百分位數(shù)處具有分值最高的異常值譜(表I)?？偟膩碚f，在七次獨立的前列腺癌譜分析研究中，COPA將ERG或ETVl九次排序在前十位異常值基因中。ERG和ETVl 二者都與尤文氏肉瘤中的致癌易位相關(guān)。EWS基因的5’活化結(jié)構(gòu)域與ETS家族成員高度保守的3’ DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合，例如ERG (t (21 ；22) (q22 ；ql2))或 ETVl (t (7 ；22) (p21 ；ql2)),是尤文氏肉瘤的特征(Lapoint 等，同上；Zhan 等,Blood 99,1745(2002) ;Fonseca 等，Cancer Res 64,1546(2004))。因為涉及 ETS 家族成員的易位在致癌轉(zhuǎn)化中是功能上冗余的，因此在每個尤文氏肉瘤病例中典型地只觀察到一種類型的易位。設(shè)想了如果ERG和ETVl同樣地參與前列腺癌的發(fā)生，它們的異常值譜應(yīng)該是相互排斥的，也就是說，在每個病例中應(yīng)該只過表達兩種基因中的一種。在功能上冗余的基因或相同致癌途徑的基因中的突變，在腫瘤發(fā)展中不可能被共同選擇。在幾個前列腺癌數(shù)據(jù)組中檢查了 ERG和ETVl的聯(lián)合表達譜，并發(fā)現(xiàn)它們顯示出互相排斥的異常值譜。鑒定了來自兩項大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究(Wang等，同上；Cheok等，Nat Genet 34,85 (2003))的ERG和ETVl的表達譜(圖1A，左圖和中圖)，所述研究使用不同的微陣列平臺對大體切片的前列腺組織進行了譜分析。由Lapointe等進行的研究對良性前列腺組織、臨床局限性前列腺癌和轉(zhuǎn)移前列腺癌進行了譜分析，其中ERG和ETVl的異常表達僅限于前列腺癌和轉(zhuǎn)移的前列腺癌，而由Glinsky等進行的研究只對臨床局限性前列腺癌樣品進行了譜分析。在這兩項研究中，前列腺癌排他性地表達ERG或ETVl (圖1A，右圖)。在通過激光捕獲顯微切割(LCM)獲得的99個前列腺組織樣品的譜分析研究中，發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果(Welsh等，同上)。除了ERG或ETVl的排他性的異常表達之外(圖1B，右圖)，LCM研究的結(jié)果還證實，ETVl和ERG只在來自前列腺癌或轉(zhuǎn)移前列腺癌的上皮細胞中過表達，而在一般認(rèn)定的前期病變前列腺上皮內(nèi)瘤(PIN)或附近的良性上皮中沒有過表達。為了直接確定觀察到的排他性異常值樣式是否與其中活化基因能夠與多種配偶體融合的其他易位相一致，對Zhan等的多發(fā)性骨粒細胞瘤數(shù)據(jù)組(Dhanasekaran等,Nature 412,822 (2001))進行了檢查。免疫球蛋白重鏈啟動子分別與CCNDl或FGFR3、t (11，14)或t (4，14)的復(fù)現(xiàn)性融合，表征了多發(fā)性骨髓瘤的特定亞組(Wigle等，Cancer Res 62, 3005 (2002)) 這些易位反映在異常值譜分析中(圖1C)，因為CCNDl在75th百分位數(shù)處是分值最高的異常值，F(xiàn)GFR3在95th百分位數(shù)處是分值第三高的異常值(表I)。除了兩個病例之外，骨髓瘤樣品顯示出CCNDl或FGFR3的排他性過表達(圖1C，右圖)。合在一起，在多種前列腺癌數(shù)據(jù)組中ERG和ETVl的異常值譜與各種人類惡性腫瘤中的其他致病突變相一致。這種在個體前列腺癌樣品中ERG或ETVl的排他性過表達與其中活化基因能夠與生物學(xué)冗余配偶體基因融合的其他腫瘤、例如多發(fā)性骨髓瘤相一致。在前列腺癌中TMPRSS2與ERG或ETVl的復(fù)現(xiàn)性基因融合體的發(fā)現(xiàn)接下來研究了 ERG和ETVl在個體前列腺癌樣品中過表達的機制。通過執(zhí)行定量PCR(QPCR)鑒定了過表達ERG或ETVl的前列腺癌細胞系和臨床樣本(圖2A)。通過QPCR發(fā)現(xiàn)，LNCaP前列腺癌細胞系和從死于激素抗拒性轉(zhuǎn)移前列腺癌的患者獲得的兩個樣本(MET-26RP，前列腺中的殘余原發(fā)癌，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤MET-26LN)顯著過表達ETVl (圖2A)。通過DNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，來自該患者的不同解剖位置的5個獨立的轉(zhuǎn)移病灶以及前列腺中的殘余癌也過表達ETVl (Welsh等，同上)，表明ETVl活化發(fā)生在廣泛轉(zhuǎn)移之前的原發(fā)腫瘤中。在來自死于激素抗拒性轉(zhuǎn)移前列腺癌的第二個患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤 (MET-28LN)和兩個前列腺癌細胞系VCaP和DuCaP中，也鑒定到了過表達的ERG (圖2A)。這些細胞系從患有激素抗拒性前列腺癌的第三個患者的椎骨轉(zhuǎn)移腫瘤(VCaP)和硬膜轉(zhuǎn)移腫瘤(DuCaP)獨立分離(Golub 等,Science 286, 531 (1999) ;Rosenwald 等,Cancer Cell 3,185(2003))。在這兩個細胞系中ERG的共同過表達，再一次表明ERG活化發(fā)生在廣泛轉(zhuǎn)移之前。合在一起，這些結(jié)果表明在前列腺腫瘤發(fā)生期間，特定遺傳事件可能活化了個體樣品中的ERG或ETVl。為了嘗試對這些遺傳事件進行表征，試驗了具有高ERG或ETVl表達的樣品在其相應(yīng)基因座處(7p21. 2和21q22. 3)的染色體擴增。通過對基因組DNA進行QPCR，在樣品中沒有發(fā)現(xiàn)ERG或ETVl的擴增以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物過表達(Sotiriou等,Proc Natl Acad Sci US A 100,10393(2003))。接下來，檢測了 DNA重排的發(fā)生。因為用于上述QPCR的引物位于尤文氏肉瘤中ERG和ETVl的已知斷點的5’端，因此在前列腺癌中不可能發(fā)生相同的易位。因此，在上面鑒定到的表現(xiàn)出ETVl過表達的樣品中通過外顯子步移QPCR測量了 ETVl外顯子的表達水平。使用了跨越ETVl外顯子2到7的5個引物對，并且LNCaP細胞顯示了所有測量到的ETVl外顯子的基本上一致的過表達，并且兩個MET26樣本都顯示出ETVl外顯子2和3與外顯子4-7相比表達降低>90% (圖2B)。該結(jié)果的可能解釋包括可變剪接、新的癌癥特異性同種型或未報道的重排。為了對全長ETVl轉(zhuǎn)錄物進行表征，對LNCaP細胞和MET26-LN進行了 5’ RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴增(RLM-RACE)。此外，進行了 RLM-RACE以獲得MET28-LN中ERG的全長轉(zhuǎn)錄物。為了從RLM-RACE cDNA對ETVl進行PCR擴增，使用了與連接到完整轉(zhuǎn)錄物的5’末端的RNA-寡核苷酸互補的正向引物和在LNCaP細胞和MET26-LN兩者中過表達的最靠近5’端的外顯子一外顯子4中的反向引物。利用與上述相似的策略，確定了 ERG的外顯子4在MET28-LN中過表達。使用該外顯子中的反向引物對RLM-RACE cDNA進行PCR擴增?？寺‘a(chǎn)物的測序顯示出前列腺特異性基因TMPRSS2(28) (21q22. 2)在MET26-LN中與ETVl融合，在MET28-LN中與ERG融合(圖2C)。在MET26-LN中，鑒定到兩種RLM-RACE PCR產(chǎn)物。第一種產(chǎn)物TMPRSS2: ETVla導(dǎo)致TMPRSS2的完整外顯子I與ETVl的外顯子4的開始端融合(圖2C)。第二個產(chǎn)物TMPRSS2:ETVlb導(dǎo)致TMPRSS2的外顯子I和2與ETVl的外顯子4的開始端融合(圖6)。這兩種產(chǎn)物都與上面描述的外顯子步移QPCR相一致，其中MET26-LN顯示出失去了外顯子2和3的過表達。在MET28-LN中，鑒定到單個RLM-RACE PCR產(chǎn)物，并且測序顯示TMPRSS2的完整外顯子I與ERG的外顯子4的開始端融合(TMPRSS2:ERGa)(圖 2C)。前列腺癌中TMPRSS2:ERG和TMPRSS2:ETV1基因融合體的驗證根據(jù)這些結(jié)果設(shè)計了 QPCR引物對，其中正向引物在TMPRSS2中，反向引物在ERG和ETVl的外顯子4中。使用這兩種引物對在來自于42個臨床局限性前列腺癌和轉(zhuǎn)移前列腺癌病例的一組樣品中進行了 SYBR Green QPCR，并對代表性結(jié)果進行圖示(圖2D和E)。這些結(jié)果證明，只有具有高水平ETVl或ERG的樣品才表達相應(yīng)的與TMPRSS2的融合產(chǎn)物。盡管在某些陰性樣品中，在35個循環(huán)后QPCR產(chǎn)生了可測量的產(chǎn)物，但解鏈曲線分析顯示在陽性和陰性樣品中產(chǎn)物不同，并且在40個循環(huán)的QPCR分析后產(chǎn)物的凝膠電泳顯示出在陰性融合樣品中只有引物二聚體(圖2D和E)。引物二聚體的形成可以用由于高GC含量 (80. 3% )導(dǎo)致設(shè)計在TMPRSS2的整個外顯子I中的引物的困難性來部分解釋。然而，使用Taqman QPCR，利用跨越相應(yīng)融合體的正向引物，證實了 TMPRSS2:ERGa、TMPRSS2:ETVla和TMPRSS2:ETVlb融合體的特異性表達，并且在每種情況下，只在與SYBR Green QPCR相同的病例中檢測到產(chǎn)物(Sotiriou等，同上)。為了進一步證實用于SYBR Green QPCR的引物和擴增子的特異性，使用與SYBR Green QPCR相同的引物對一組表達TMPRSS2:ERGa的樣品進行了標(biāo)準(zhǔn)的反轉(zhuǎn)錄PCR。獲得了大小相似的產(chǎn)物，并且對克隆產(chǎn)物的測序證實了TMPRSS2:ERGa的存在。鑒定到了兩個分別表達高水平ETVl或ERG、但是通過QPCR沒有顯示出易位跡象的病例PCA16和PCA17(圖2D和E)。RLM-RACE支持了這些結(jié)果，因為在PCA16中使用ETVl引物產(chǎn)生的產(chǎn)物的測序沒有顯示出融合轉(zhuǎn)錄物的跡象，并且在PCA17中使用ERG引物不能獲得產(chǎn)物。對于LNCaP細胞獲得了類似結(jié)果，通過RLMRACE或QPCR沒有獲得融合的證據(jù)，與上述的外顯子步移QPCR相一致。前列腺癌樣品中TMPRSS2與ETS家族成員融合轉(zhuǎn)錄物的證據(jù)歸納對TMPRSS2: ERG和TMPRSS2: ETVl融合轉(zhuǎn)錄物進行了三種不同測定,包括RLM-RACE產(chǎn)物的測序、QPCRJP RT-PCR產(chǎn)物的測序，結(jié)果概括在表2中。除了對TMPRSS2融合體的QPCR是在所有樣品中進行之外，使用了幾種技術(shù)在選定的樣品上證實這些融合體的存在。例如，在PCAl (前列腺癌樣品I)中，使用RLMRACE產(chǎn)物的測序、QPCR以及RT-PCR產(chǎn)物的測序來鑒定TMPRSS2:ERGa。通過QPCR解鏈曲線分析和QPCR產(chǎn)物的凝膠電泳，PCA4產(chǎn)生了比預(yù)期更大的擴增子。隨后的RLM-RACE分析證實了 TMPRSS2的完整外顯子I與ERG的外顯子2的開始端的融合(TMPRSS2:ERGb)(圖6)。使用跨越TMPRSS2:ERGb連接處的正向引物進行Taqman QPCR，證實了 TMPRSS2 :ERGb僅存在于PCA4中，使用跨越TMPRSS2 :ERGa連接處的正向引物進行Taqman QPCR，在該樣本中不產(chǎn)生產(chǎn)物(27)。TMPRSS2:ERG和TMPRSS2:ETV1融合體的證據(jù)只在通過QPCR或DNA微陣列檢測到分別過表達ERG或ETVl的病例中發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果與在異常值分析中觀察到的排他性表達相一致。熒光原位雜交(FISH)證實TMPRSS2: ETVl易位和ERG重排在證實了 TMPRSS2:ETV1和TMPRSS2:ERG融合轉(zhuǎn)錄物的存在之后，在福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣本上使用間期熒光原位雜交(FISH)獲得了染色體水平上這些重排的證據(jù)。使用了兩種不同的探針策略雙色融合信號方法用于檢測TMPRSS2:ETV1易位，以及雙色分離信號方法用于檢測ERG基因座的重排。在最初用于RLM-RACE的兩個病例MET26和MET28上對這些探針策略進行了確認(rèn)(圖3)。使用用于TMPRSS2和ETVl的探針，正常的外周血淋巴細胞(NPL)顯示出一對紅色和一對綠色的信號(圖3A)。MET26顯示出一對信號的融合，表明探針重疊(圖3B，黃色箭頭)，與該樣品中TMPRSS2:ETV1轉(zhuǎn)錄物的表達相一致。此外，鑒定到ETVl基因座的一致的低水平擴增，正如ETVl的兩個殘留信號所指示的(圖3B，紅色箭頭)。同樣地，使用跨過ERG基 因座的5’和3’區(qū)域的探針，在NPL中觀察到一對黃色信號(圖3C)。在MET28中，一對探針分裂成單獨的綠色和紅色信號，表明了 ERG基因座處的重排(圖3D，綠色和紅色箭頭)。該結(jié)果與該病例中TMPRSS2:ERG轉(zhuǎn)錄物的表達相一致。根據(jù)這些結(jié)果，對含有來自13個局域性前列腺癌病例和16個轉(zhuǎn)移前列腺癌病例的核心的系列組織微陣列進行了上面描述的個體FISH分析(圖3E)。正如矩陣所顯示的，29個病例中的23個(79. 3% )顯示出TMPRSS2:ETV1融合(7個病例)或ERG重排(16個病例)的跡象。此外，29個病例中的12個(41. 4% )顯示出ETVl基因座處低水平擴增的跡象。以前的報告已經(jīng)將ETVl的基因組位置7p鑒定為局域性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌中最經(jīng)常擴增的區(qū)域之一 (Slamon等，Science 235,177(1987))。然而，似乎不是7p的擴增驅(qū)動了ETVl表達，因為在6個具有ERG重排的病例中發(fā)生了 ETVl擴增，并且我們的轉(zhuǎn)錄物數(shù)據(jù)證實在19個樣品中無一具有高ERG表達，而且TMPRSS2:ERG融合體也具有高ETVl表達。此夕卜，當(dāng)通過FISH發(fā)現(xiàn)ETVl擴增和TMPRSS2:ETV1融合均存在時，只有ETVl個體信號被擴增，而沒有融合信號。然而，該FISH分析的結(jié)果在基因組水平上證實了 TMPRSS2:ETV1和ERG重排的存在，與上面描述的轉(zhuǎn)錄物數(shù)據(jù)相一致。TMPRSS2是雄激素調(diào)控基因，并且與ERG的融合導(dǎo)致了 ERG的雄激素調(diào)控。TMPRSS2最初被鑒定為前列腺特異性基因，在LNCaP細胞中其表達被雄激素增加，并且在其啟動子中也含有雄激素響應(yīng)兀件(ARE) (Huang 等，Lancet 361,1590 (2003) ；Schwartz 等，CancerRes 62,4722(2002))。隨后的研究證實了在正常和腫瘤前列腺組織中的高表達，并證明了在雄激素敏感性前列腺細胞系中TMPRSS2受雄激素調(diào)控(Schwartz等，Cancer Res62,4722(2002) ；Ferrando 等，Cancer Cell 1,75(2002) ；Chen 等，Mol Biol Cell 14，3208(2003) ;LaTulippe 等，Cancer Res 62,4499(2002))。此外，盡管在雄激素不敏感性前列腺癌細胞系PC3中雄激素不增加TMPRSS2的表達，但PC3細胞中雄激素受體的穩(wěn)定表達導(dǎo)致TMPRSS2變成雄激素響應(yīng)性(Schwartz等，同上；Ferrando等，同上；Chen等，同上；LaTulippe等，同上)。相反，用雄激素處理的LNCaP前列腺細胞系的微陣列研究沒有將ERG或ETVl鑒定為雄激素響應(yīng)性(Jain等，Cancer Res 64，3907 (2004))，并且對它們的啟動子序列進行的研究沒有揭示出共有的ARE(Sotiric)U等，同上)。DuCaP和VCaP細胞系中的TMPRSS2:ERGa融合在每種細胞系中通過三種獨立的測定方法得以證實(表2)，預(yù)期所述融合將導(dǎo)致ERG的雄激素調(diào)控。使用QPCR測定ERG表達，證實了盡管ERG在VcaP和DuCaP細胞中高表達，但用合成的雄激素R1881進行處理，導(dǎo)致與未處理的對照相比，ERG的表達在DuCaP細胞中增加2. 57倍，在VCaP細胞中增加5. 02倍(圖4)。在R1881處理后，與未處理的對照相比，ERG的表達在RffPE (I. 37倍)、LnCaP (O. 86倍)、PC3 (I. 28倍)和表達雄激素受體的PC3細胞(O. 73倍)中是最低限度的或基本上不變。同樣樣品的微陣列分析證實了在DuCaP和VCaP細胞中ERG只對雄激素做出響應(yīng)而上調(diào)(Sotiriou等，同上)。本發(fā)明不限于具體的機制。事實上，對于實踐本發(fā)明來說，對機制的理解不是必需的。然而，設(shè)想了這些結(jié)果表明了當(dāng)存在相應(yīng)的與TMPRSS2的融合體時，ERG或ETVl的異常表達在前列腺癌中的可能機制。表I.癌癥異常值譜分析(COPA)。顯示了已知在癌癥中經(jīng)歷致病突變的、具有強烈的異常值譜的基因。“X”表示所獲得的病理基因組易位的文獻證據(jù)?！癤X”表示特定易位以及特定研究中用于對該易位進行表征的樣品的文獻證據(jù)。“Y”表示與已知擴增相一致?！?*”表示前列腺癌中ERG和ETVl的異常值譜。表I·
權(quán)利要求
1.一種用于在患者中鑒定前列腺癌的方法，所述方法包含 (a)提供來自于患者的樣品；以及 (b)檢測樣品中具有來自于SLC45A3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’部分和來自于ERG基因的3’部分的基因融合體的存在或不存在， 其中在樣品中檢測到所述基因融合體的存在鑒定患者患有如列腺癌。
2.權(quán)利要求I的方法，其中SLC45A3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包含SLC45A3基因的啟動子區(qū)。
3.權(quán)利要求I的方法，其中步驟(b)包含檢測具有來自于SLC45A3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’ DNA部分和來自于ERG基因的3’ DNA部分的基因組DNA的染色體重排。
4.權(quán)利要求I的方法，其中步驟(b)包含檢測具有從SLC45A3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄的5’ RNA部分和從ERG基因轉(zhuǎn)錄的3’ RNA部分的嵌合mRNA轉(zhuǎn)錄物。
5.權(quán)利要求I的方法,其中樣品選自組織、血液、血漿、血清、尿液、尿液上清液、尿液細胞沉淀物、精液、前列腺分泌物和前列腺細胞。
6.一種用于在患者中鑒定前列腺癌的方法，所述方法包含 (a)提供來自于患者的樣品；以及 (b)檢測樣品中具有來自于FLJ35294基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’部分和來自于ETS家族成員基因的3’部分的基因融合體的存在或不存在， 其中在樣品中檢測到所述基因融合體的存在鑒定患者患有如列腺癌。
7.權(quán)利要求6的方法，其中FLJ35294基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包含F(xiàn)LJ35294基因的啟動子區(qū)。
8.權(quán)利要求6的方法，其中ETS家族成員基因是ETVl。
9.權(quán)利要求6的方法，其中步驟(b)包含檢測具有來自于FLJ35294基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的5’ DNA部分和來自于ETS家族成員基因的3’ DNA部分的基因組DNA的染色體重排。
10.權(quán)利要求6的方法，其中步驟(b)包含檢測具有從FLJ35294基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄的5’ RNA部分和從ETS家族成員基因轉(zhuǎn)錄的3’ RNA部分的嵌合mRNA轉(zhuǎn)錄物。
11.權(quán)利要求6的方法，其中樣品選自組織、血液、血漿、血清、尿液、尿液上清液、尿液細胞沉淀物、精液、前列腺分泌物和前列腺細胞。
12.一種用于在患者中鑒定前列腺癌的方法，所述方法包含 (a)提供來自于患者的樣品；以及 (b)檢測樣品中具有來自于DDX5基因的5’部分和來自于ETS家族成員基因的3 ’部分的基因融合體的存在或不存在， 其中在樣品中檢測到所述基因融合體的存在鑒定患者患有如列腺癌。
13.權(quán)利要求12的方法，其中ETS家族成員基因是ETV4。
14.權(quán)利要求12的方法，其中步驟(b)包含檢測具有來自于DDX5基因的5’DNA部分和來自于ETS家族成員基因的3’ DNA部分的基因組DNA的染色體重排。
15.權(quán)利要求12的方法，其中步驟(b)包含檢測具有從DDX5基因轉(zhuǎn)錄的5’RNA部分和從ETS家族成員基因轉(zhuǎn)錄的3’ RNA部分的嵌合mRNA轉(zhuǎn)錄物。
16.權(quán)利要求12的方法，其中步驟(b)包含檢測具有DDX5基因編碼的氨基端部分和ETS家族成員基因編碼的羧基端部分的嵌合蛋白。
17.權(quán)利要求12的方法，其中樣品選自組織、血液、血漿、血清、尿液、尿液上清液、尿液細胞沉淀物、精液、前列腺分泌物和前列腺細胞。
18. 一種組合物，其包含下列至少一種 (a)寡核苷酸探針，其包含與嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的連接處雜交的序列，其中嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分來自于SLC45A3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、和嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分來自于ERG基因； (b)第一個寡核苷酸探針，其包含與來自于SLC45A3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分雜交的序列，以及第二個寡核苷酸探針，其包含與來自于ERG基因的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分雜交的序列； (c)第一個擴增寡核苷酸，其包含與來自于SLC45A3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分雜交的序列，以及第二個擴增寡核苷酸，其包含與來自于ERG基因的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分雜交的序列； (d)寡核苷酸探針，其包含與嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的連接處雜交的序列，其中嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分來自于FLJ35294基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、和嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分來自于ETVl基因； (e)第一個寡核苷酸探針，其包含與來自于FLJ35294基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5 ’部分雜交的序列，以及第二個寡核苷酸探針，其包含與來自于ETVl基因的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分雜交的序列； (f)第一個擴增寡核苷酸，其包含與來自于FLJ35294基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分雜交的序列，以及第二個擴增寡核苷酸，其包含與來自于ETVl基因的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分雜交的序列； (g)寡核苷酸探針，其包含與嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的連接處雜交的序列，其中嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分來自于DDX5基因、和嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分來自于ETV4基因； (h)第一個寡核苷酸探針，其包含與來自于DDX5基因的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分雜交的序列，以及第二個寡核苷酸探針，其包含與來自于ETV4基因的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分雜交的序列； (i)第一個擴增寡核苷酸，其包含與來自于DDX5基因的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的5’部分雜交的序列，以及第二個擴增寡核苷酸，其包含與來自于ETV4基因的嵌合基因組DNA或嵌合mRNA的3’部分雜交的序列； (j)針對具有DDX5基因編碼的氨基端部分和ETV4基因編碼的羧基端部分的嵌合蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明描述了前列腺癌中雄激素調(diào)控基因或持家基因與ETS家族成員基因的復(fù)現(xiàn)性基因融合體。還提供了在前列腺癌診斷、研究和治療中有用的組合物和方法。
文檔編號C12Q1/68GK102812130SQ200980154834
公開日2012年12月5日 申請日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者阿魯·M·辛萊巖, 韓博, 昌達·庫馬爾 申請人:密歇根大學(xué)董事會