檢測(cè)mmp-13活性的fret融合熒光探針、檢測(cè)方法、dna和表達(dá)載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白酶生物活性檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)MMP-13活性的 FRET融合熒光探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 而在細(xì)胞內(nèi)眾多生命活動(dòng)中，膠原酶-3也即基質(zhì)金屬蛋白酶13 (MMP - 13)在膠 原原纖雛的降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用，明膠酶和間質(zhì)溶素1主要降解軟骨基質(zhì)中的非腔原 成分。目前研宄認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶13在軟骨中表達(dá)水平升高是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨 退變的主要因素之一?；|(zhì)金屬蛋白酶13 (MMP - 13)所主導(dǎo)的II型膠原的降解和破壞會(huì)導(dǎo) 致軟骨支架結(jié)構(gòu)的崩塌，軟骨細(xì)胞賴(lài)以發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)遭到破壞，軟骨基質(zhì)代謝的平 衡破壞進(jìn)一步加劇，激發(fā)進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)和軟骨組織破壞，造成炎癥與破壞的惡性循環(huán)。 因此MMP - 13的濃度變化，活性高低能夠及時(shí)反應(yīng)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變的進(jìn)展情況和嚴(yán) 重程度，對(duì)其濃度的測(cè)定可以更有利地掌握病變進(jìn)展和施治時(shí)機(jī)。臨床上檢測(cè)滑膜組織中 MMP - 13的表達(dá)有助于指導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎的治療及病情的評(píng)估，將MMP - 13和與其他的生物 學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)可以更高效率地確定OA的進(jìn)展情況，有利于OA的早期診斷和預(yù)防。
[0003] 而在現(xiàn)有滑膜組織中的MMP - 13的表達(dá)水平的檢測(cè)的試劑盒多采用雙抗體夾心 法測(cè)定。其過(guò)程多是用純化的人基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)抗體包被微孔板，制成固相抗 體，往包被單抗的微孔中依次加入基質(zhì)金屬蛋白酶13 (MMP-13)，再與HRP標(biāo)記的基質(zhì)金屬 蛋白酶13 (MMP-13)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的 深淺和樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸 光度（0D值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)濃度。
[0004] 但是上述現(xiàn)有的方法，受限于抗體的特異結(jié)合性以及檢測(cè)靈敏度的限制，且操作 步驟過(guò)程繁瑣，并且無(wú)法檢測(cè)到活性MMP-13的含量，因此暫無(wú)法滿(mǎn)足簡(jiǎn)便、高精度快速檢 測(cè)的使用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能夠簡(jiǎn)捷快速和能 更加準(zhǔn)確地檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0007] -種用于檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針，包括FRET熒光供體蛋白、FRET 焚光受體蛋白；
[0008] 所述FRET熒光供體蛋白和FRET熒光受體蛋白之間通過(guò)MMP-13特異性識(shí)別降解 多肽底物連接。
[0009] 本發(fā)明的上述探針，其利用FRET熒光供體蛋白、FRET熒光受體蛋白分別作為能量 共振轉(zhuǎn)移的熒光供體和受體，并通過(guò)一段能被待測(cè)的MMP-13特異性識(shí)別和降解的多肽底 物連接，使其能產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。在檢測(cè)的過(guò)程中，探針的上述多肽底物被MMP-13 特異性識(shí)別和降解，那么FRET熒光供體蛋白和FRET熒光受體蛋白之間由于失去連接，產(chǎn)生 相互分離，因此導(dǎo)致FRET現(xiàn)象消失，此時(shí)根據(jù)熒光信號(hào)的變化情況，便可以得到待測(cè)的樣 品中MMP-13的含量，從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)捷快速和能更加準(zhǔn)確地檢測(cè)MMP-13活性的目的。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種利用上述FRET融合熒光探針進(jìn)行MMP-13活性的檢測(cè)方 法，包括如下步驟：
[0011] 獲取待測(cè)蛋白樣品；
[0012] 將所述待測(cè)蛋白樣品與所述的FRET融合熒光探針進(jìn)行孵育，并檢測(cè)熒光信號(hào)。
[0013] 檢測(cè)的過(guò)程中，先將待測(cè)蛋白樣品與所述的FRET融合熒光探針進(jìn)行孵育，使探針 的上述多肽底物被MMP-13特異性識(shí)別和降解，從而破壞FRET熒光供體蛋白和FRET熒光受 體蛋白之間的能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，使其熒光信號(hào)產(chǎn)生變化，通過(guò)檢測(cè)的熒光信號(hào)變化的情 況，即可便可以得到待測(cè)的樣品中MMP-13的含量，從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)捷快速和能更加準(zhǔn)確地檢測(cè) MMP-13活性的目的。
[0014] 基于上述，本申請(qǐng)進(jìn)一步提出一種用于編碼FRET融合熒光探針的組合氨基酸序 列的DNA和表達(dá)該DNA的表達(dá)載體，所述DNA具有SEQ. ID. No. 6的核苷酸堿基序列。
[0015] 本發(fā)明的通過(guò)上述編碼FRET融合熒光探針的組合氨基酸序列的DNA，可以進(jìn)一步 構(gòu)建表達(dá)載體，便可以在大腸桿菌或者其他的等等原核系統(tǒng)大量表達(dá)FRET熒光探針，進(jìn)行 大量的生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中：
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例用于檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針的示意圖；
[0018] 圖2為FRET融合熒光探針與MMP-13孵育被降解后導(dǎo)致FRET變化示意圖；
[0019] 圖3為FRET融合熒光探針被MMP-13降解前后的SDS-PAGE分析電泳圖；
[0020] 圖4為采用FRET融合熒光探針檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)濃度MMP-13的熒光變化示意圖；
[0021] 圖5為采用FRET融合熒光探針檢測(cè)不同標(biāo)樣濃度MMP-13的熒光變化示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0023] 本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針，可以參見(jiàn)圖1 所示；包括FRET熒光供體蛋白10、FRET熒光受體蛋白20、以及連接在FRET熒光供體蛋白 10和FRET熒光受體蛋白20之間的MMP-13特異性識(shí)別降解多肽底物30。
[0024] 本發(fā)明的上述FRET融合焚光探針基于FRET設(shè)計(jì)，F(xiàn)RET (fluorescence resonance energy transfer)即焚光能量共振轉(zhuǎn)移，是距離很近的兩個(gè)焚光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn) 移現(xiàn)象。當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)分子的距 離在IOnm范圍以?xún)?nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光 強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）。 其基于生物大分子納米級(jí)距離和納米級(jí)距離變化的有力工具，常利用FRET可以解決超過(guò) 光學(xué)顯微鏡分辨率限制的分子相對(duì)鄰近度問(wèn)題，來(lái)用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)空動(dòng)力學(xué)，監(jiān)測(cè)二個(gè) 蛋白質(zhì)成份間分子相互作用及檢測(cè)一個(gè)分子內(nèi)部（如酶活動(dòng)能力、DNA/RNA形態(tài)）的結(jié)構(gòu) 變化等。
[0025] 本發(fā)明中設(shè)計(jì)上述探針，F(xiàn)RET熒光供體蛋白10、FRET熒光受體蛋白20分別作為 能量共振轉(zhuǎn)移的熒光供體和受體，并通過(guò)一段能被待測(cè)的MMP-13特異性識(shí)別和降解的多 肽底物30連接，使其能產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移。在檢測(cè)的過(guò)程中，探針的上述多肽底物30被 MMP-13特異性識(shí)別和降解，可以參見(jiàn)圖2所示，那么FRET熒光供體蛋白和FRET熒光受體蛋 白之間由于失去連接，產(chǎn)生相互分離，因此導(dǎo)致FRET現(xiàn)象極大降低或者消失，導(dǎo)致熒光信 號(hào)發(fā)生變化從而根據(jù)熒光信號(hào)的變化情況，便可以得到待測(cè)的樣品中MMP-13的含量，實(shí)現(xiàn) 簡(jiǎn)捷快速和能更加準(zhǔn)確地檢測(cè)MMP-13活性的目的。
[0026] 進(jìn)一步，其中針對(duì)待測(cè)的MMP-13的酶結(jié)合的作用細(xì)節(jié)，以及對(duì)其檢測(cè)的靈敏度 的。本發(fā)明中上述能被待測(cè)的MMP-13特異性識(shí)別和降解的多肽底物30設(shè)計(jì)，其具有序列 表SEQ. ID. No. 1氨基酸序列多肽序列。從序列表中可以看出，多肽底物的氨基酸序列為 GPLGMRGL，具有8個(gè)氨基酸的殘基長(zhǎng)度，特異針對(duì)MMP-13的作用的識(shí)別降解序列位點(diǎn)進(jìn)行 設(shè)計(jì)，相比其他的類(lèi)型可降解底物在特異性的識(shí)別的靈敏度和被MMP-13降解的可降解性 上，能有較高的保障。
[0027] 在上述實(shí)施方式中，在FRET中通常作為熒光供體和受體的FRET對(duì)為青色熒光 蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)、黃色焚光蛋白(yellow fluorescent protein， YFP)，且兩個(gè)蛋白距離越近，CFP所發(fā)出的熒光被YFP接收的