專利名稱：一種檢測(cè)基因斷裂融合的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因發(fā)生斷裂融合的檢測(cè)方法，具體地，是涉及到急性髓系白血 病相關(guān)基因AMLl、RARa、MLL等斷裂融合的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
白血病是源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，染色體異常是白血病發(fā)生的常見原 因。染色體導(dǎo)致的分子事件是兩個(gè)基因的斷裂融合，如t (15 ；17)形成PML/RARa融合基因， t(8 ；21)導(dǎo)致AML1/ET0的形成。融合基因的發(fā)現(xiàn)有助于研究白血病發(fā)生的分子機(jī)制并尋找 特定的靶向藥物。如PML/RARa導(dǎo)致AML-M3分子機(jī)制的闡明，使全反式維甲酸(ATRA)成 為治療AML-M3的成功藥物。其它一些染色體異常，盡管其致病機(jī)制尚未闡明，但臨床實(shí)踐 發(fā)現(xiàn)其已成為很好的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。例如一些染色體異常如inv(16),t(16 ；16)，t(8 ；21) 的白血病患者預(yù)后較好，另一些染色體異常，包括〖(6;9)4(9;22)，如1(5(1)和del(7q)則 預(yù)后較差，而其它染色體異常(如+8、+6、-Y)和無明顯遺傳學(xué)異常的病例預(yù)后中等?？梢?基因斷裂融合是白血病發(fā)生的主要原因，特定融合基因異常在白血病的分型診斷、治療及 預(yù)后判斷方面有重要意義。但是在急性髓系白血病中，常見融合基因斷裂位點(diǎn)存在著復(fù)雜 性及不同基因間斷裂融合的多樣性，而目前的多種檢測(cè)手段均存在著明顯的不足之處?；?因融合事件的發(fā)生通常在兩個(gè)層面進(jìn)行檢測(cè)，一是細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)，即以染色體為主體的 顯帶技術(shù)及熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence In-Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)，國(guó)外常采 用FISH方法進(jìn)行鑒定，但其對(duì)于未知染色體異常病例，常需多種探針進(jìn)行篩選，成本高，周 期長(zhǎng)，不適合常規(guī)檢測(cè)。另外一個(gè)是以mRNA為主體的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，靈敏度較好，是目前 融合基因檢測(cè)的主要方法，但由于融合基因斷裂位點(diǎn)的多樣性以及“伙伴”基因的復(fù)雜性， 使得常規(guī)RT-PCR方法無法檢測(cè)到全部的易位類型。如欲覆蓋所有融合基因類型，又需設(shè)計(jì) 許多對(duì)引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，這樣既浪費(fèi)時(shí)間又增加成本，而且難以檢測(cè)到新的未知基 因的斷裂融合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服上述已有技術(shù)的不足，提供一種快速、有效的檢測(cè)基因斷裂融合 的方法。鑒于融合基因的多樣性和復(fù)雜性以及現(xiàn)有檢測(cè)手段的不足，經(jīng)分析比較了大量已 報(bào)道的融合基因斷裂位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)雖然AMLl、RARa和MLL等基因可以與不同的“伙伴”基因 及相同“伙伴”基因的不同斷裂位點(diǎn)形成許多種不同的融合基因，但是它們自身的斷裂位點(diǎn) 卻是相對(duì)恒定的。例如，與AMLl相關(guān)的染色體易位AMLl基因斷裂點(diǎn)恒定地發(fā)生在第5、6 內(nèi)含子，與RARa相關(guān)的染色體易位RARa基因斷裂點(diǎn)恒定地發(fā)生在第2內(nèi)含子，與MLL相 關(guān)的染色體易位MLL基因斷裂點(diǎn)恒定地發(fā)生在第5-9內(nèi)含子之間。本發(fā)明即將這一發(fā)現(xiàn)作 為基礎(chǔ)進(jìn)行基因斷裂融合事件的檢測(cè)。本發(fā)明以AMLl基因?yàn)槔榻B相關(guān)的發(fā)明內(nèi)容。本發(fā)明方法是
(1)基因的恒定斷裂位區(qū)域設(shè)為Breakpiont區(qū)，簡(jiǎn)稱B區(qū)；恒定表達(dá)區(qū)設(shè)為 Control區(qū)，簡(jiǎn)稱C區(qū)。兩區(qū)相對(duì)表達(dá)量之比稱為B/C比值。(2)使用引物設(shè)計(jì)軟件primer5. O在AMLl基因的mRNA上的恒定斷裂位點(diǎn)B區(qū)與 恒定表達(dá)區(qū)C區(qū)設(shè)計(jì)引物及探針。AMLl斷裂融合發(fā)生在eXon5或eXon6之后，故B區(qū)引物 需分別設(shè)計(jì)在exon5和exon7內(nèi)。C區(qū)應(yīng)在斷裂區(qū)5’側(cè)選擇，故在跨exon3和exon4區(qū)域 設(shè)計(jì)。B區(qū)和C區(qū)片段大小接近、退火溫度一致，使其可在同一條件下擴(kuò)增，擴(kuò)增效率盡可能一致。(3)熒光定量PCR方法檢測(cè)AMLl基因B區(qū)與C區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物量，由兩區(qū)相對(duì)表達(dá)量 之比(即B/C比值)判斷是否發(fā)生融合事件。理論上，對(duì)于二倍體細(xì)胞來講，B/C比值>0.5 且< 1. 0，認(rèn)為AMLl基因發(fā)生了斷裂融合，但實(shí)際上由于初發(fā)白血病細(xì)胞數(shù)量、實(shí)驗(yàn)操作手 法、PCR的敏感性等問題的影響，B/C比值會(huì)和理論上有所區(qū)別。經(jīng)大樣本統(tǒng)計(jì)分析，正常對(duì) 照組B/C比值位于0. 7260-1. 51之間，因此我們?cè)O(shè)B/C比值低于0. 60作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，即B/ C比值低于0. 60視為AMLl基因發(fā)生了斷裂融合。以0. 60作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)漏選一些 可疑病例，但可以優(yōu)先篩選出最可疑AMLl基因發(fā)生斷裂融合的病例。(4)采用 RACE (Rapid amplification of cDNA ends)方法結(jié)合克隆測(cè)序進(jìn)行新的 融合基因斷裂位點(diǎn)的鑒定。對(duì)于篩選出的可疑的基因發(fā)生斷裂融合的病例，采用RACE方法結(jié)合克隆測(cè)序進(jìn) 行新的融合基因斷裂位點(diǎn)的鑒定，可尋找到新的“伙伴”基因。本發(fā)明方法適用于以AMLl基因?yàn)榇淼淖陨頂嗔盐稽c(diǎn)恒定于某一區(qū)域，但可以 和不同基因發(fā)生融合的這類基因的斷裂融合檢測(cè)。本發(fā)明采用新的引物設(shè)計(jì)思路建立一種 更加快速、有效的檢測(cè)基因斷裂融合的方法，克服了現(xiàn)有基因融合事件檢測(cè)手段的缺陷，可 以最大限度地檢出與此類基因相關(guān)的各種融合事件，更客觀準(zhǔn)確地服務(wù)于急性髓性白血病 的診斷、治療及預(yù)后判斷。通過本方法有望尋找到新的斷裂位點(diǎn)及“伙伴”基因，新的斷裂 位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)有助于闡明基因斷裂融合發(fā)生的分子機(jī)制，新的“伙伴”基因的發(fā)現(xiàn)有助于解釋 白血病發(fā)生的異質(zhì)性，并篩選出新的白血病發(fā)生相關(guān)基因，進(jìn)而為尋找靶向藥物及實(shí)現(xiàn)個(gè) 體化治療奠定理論基礎(chǔ)。


圖1為正常二倍體細(xì)胞中B區(qū)與C區(qū)表達(dá)量。圖2為發(fā)生斷裂融合的二倍體細(xì)胞中B區(qū)與C區(qū)表達(dá)量。圖3熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖4為熒光定量PCR檢測(cè)正常對(duì)照標(biāo)本的B/C比值的結(jié)果圖。圖5為熒光定量PCR檢測(cè)AML1/ET0融合基因陽性標(biāo)本的B/C比值結(jié)果圖。圖6為RACE實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果圖。圖7為目的產(chǎn)物克隆測(cè)序圖。圖1所示由于B區(qū)未發(fā)生斷裂，兩區(qū)表達(dá)量相同，故B區(qū)與C區(qū)拷貝數(shù)之比為 2 2，B/C比值為1。圖2所示一條染色體上B區(qū)發(fā)生了斷裂融合，斷裂位點(diǎn)處無法形成擴(kuò)增產(chǎn)物，則 故B區(qū)與C區(qū)拷貝數(shù)之比為1 2，B/C比值為0.5。
圖4所示三次重復(fù)B區(qū)和C區(qū)的CT值均相近，其B/C比值平均值為1. 17，說明B 區(qū)未發(fā)生斷裂融合事件。圖5所示，三次重復(fù)B區(qū)明顯低于C區(qū)約1個(gè)CT值，其B/C比值平均值為0. 33，比 值明顯降低，說明B區(qū)發(fā)生了斷裂融合事件。圖6所示測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast分析為1號(hào)染色體Ip33_p32. 1區(qū)域的PRP38A基因， 為AMLl基因的一種新的斷裂融合伙伴基因。
具體實(shí)施例方式AMLl基因斷裂融合的檢測(cè)(1)引物和探針的設(shè)計(jì)與合成在基因文庫(kù)中檢索AMLl基因cDNA序列(序列號(hào)為NM_001001890)，AMLl基因有 AMLla, AMLlb, AMLlc三種mRNA，又因exon6是否缺失分為6種不同的轉(zhuǎn)錄本，但統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)， 缺失eXOn6所占比例恒定約為20%，所以只針對(duì)不缺失eX0n6的轉(zhuǎn)錄本在斷裂點(diǎn)即第五 內(nèi)含子兩端設(shè)計(jì)B區(qū)引物Bi、B2，非斷裂位點(diǎn)即跨三、四外顯子設(shè)計(jì)C區(qū)引物Cl、C2，這樣 可以滿足熒光定量PCR產(chǎn)物片段小于150bp的限制。引物及探針由上?；瞪锕竞?成，去離子水溶解，濃度ΙΟμπιοΙ/L，-20°C保存。引物和探針序列及產(chǎn)物大小如下AML1B 區(qū)引物，正向 Bl:5' -ATGGGCCCCGAGAACCT-3 ‘，反向 B2 5 ‘ -GTGGGCTGACCCTCATGG-3 ‘， 探針5 ‘ -FCCTTTTCCGAGCGGCTCAGTGAACTP-3 ‘，AMLlC 區(qū)弓丨物，正向 Cl 5' -TTGTGAAGACAGTGATGGTCAGAGT-3‘，反向 C2:5' -GCTACCGCAGCCATGAAGAA-3‘，探針 5 ‘-FAGCTTTTCCCTCTTCCACTTCGACCGP-3‘。(2) RQ-RT-PCR 檢測(cè) B/C 比值1)總RNA的提取骨髓標(biāo)本2ml，EDTA抗凝，按試劑盒Triszol說明書提取白細(xì)胞總RNA，紫外分光 光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，為符合要求(A260/A280彡1.7)的標(biāo)本。2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系20 μ 1，取樣品總RNAl μ g，隨機(jī)引物250ng，加DEPC水至11 μ 1， 70°C 5min后立即冰浴，然后依次加入5 X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液2. 5 μ 1，10mmol/LdNTP2. 5 μ 1， RNAsin20U，加 DEPC 水至 19 μ 1，25°C 5min 后立即冰浴，M-Mulv 逆轉(zhuǎn)錄酶 200U，25°C IOmin, 42°C 60min,70°C lOmin，立即將反應(yīng)管冰浴，反應(yīng)產(chǎn)物于_20°C冰箱保存，用于PCR擴(kuò)增。3)標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立在AMLl基因B區(qū)、C區(qū)外側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增1例正常對(duì)照標(biāo)本的AMLl基因。將 其擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PMD18-T載體，經(jīng)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、含重組質(zhì)粒菌株的篩選和擴(kuò)增、重組 質(zhì)粒提取、鑒定、純化、測(cè)序鑒定，并將其定量，根據(jù)分子量及阿佛加德羅常數(shù)(6. 023X IO23 分子數(shù)/mol)換算為分子拷貝數(shù)，最后從IOki拷貝/ μ 1開始行10倍稀釋建立陽性模板梯 度。取稀釋為IO6-IOltl拷貝/μ 1的AMLl正常表達(dá)陽性模板各3μ1進(jìn)行熒光定量PCR反 應(yīng)。為了糾正mRNA定量、RT以及PCR擴(kuò)增效率差異對(duì)結(jié)果的影響，AMLlB區(qū)和C區(qū)的絕對(duì) 拷貝數(shù)之比，作為AMLl基因的相對(duì)表達(dá)量。4) PCR 反應(yīng)為提高擴(kuò)增產(chǎn)物B、C片段的可比性，反應(yīng)體系除引物、探針外均混勻后對(duì)等分配，每個(gè)標(biāo)本做三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。取模板cDNA9 μ 1，加入9份TaqMan Core Regeantsl2. 5 μ 1， CDNA5y 1，去離子水7. 5μ 1充分混勻后，取4份即100 μ 1分至兩管中。再在這兩個(gè)管中分 別加入4份B區(qū)、C區(qū)IOyM引物各0. 5μ 1，10μΜ探針1μ 1，充分混勻后平分至三個(gè)管中。 反應(yīng)條件為95°C IOS ；95°C 15S，60°C 20S，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。5)B/C比值檢測(cè)結(jié)果由于正常對(duì)照組B/C比值位于0. 7260-1. 51之間，我們?cè)O(shè)B/C比值低于0. 60作為 篩選標(biāo)準(zhǔn)，即B/C比值低于0. 60視為B區(qū)表達(dá)降低。本例B/C比值為0. 41，可認(rèn)為B區(qū)發(fā) 生了新的斷裂融合事件。本例臨床診斷為AML-M4，AMLl-ETO融合基因?yàn)殛幮裕纱私Y(jié)果分 析該患者AMLl基因可能與ETO基因外的其它伙伴基因發(fā)生了斷裂融合。(3) RACE鑒定AMLl伙伴基因1)引物設(shè)計(jì)和合成使用Primer5. 0軟件在AMLl基因的mRNA序列上分別設(shè)計(jì)巢式PCR外側(cè)及內(nèi)側(cè)引 物。RACE 鑒定實(shí)驗(yàn)弓 I物，外側(cè)弓丨物 Exo3-F 5 ‘ -CAACAAGACCCTGCCCATCGCTTTC-3 ‘，內(nèi)側(cè)引 物 Ex。5-F 5 ‘ -CTGTCTTCACAAACCCACCGCAAGT-3‘。2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 合成 cDNA。為保證實(shí)驗(yàn)的可靠性，同時(shí)設(shè)立contro 1對(duì)照與RTase-對(duì)照對(duì)照(即不添加 ReverseTranscriptase,用于檢測(cè) DNA 污染)。反應(yīng)總體積為10 μ 1，首先取樣品總 RNA200ng，12 μ M 3，RACE CDS Primer 1μ 1，72°C 2min，42°C 3min 反應(yīng)，然后依次加入 5XFirst-Strand Buffer 2 μ 1,40U/ μ 1 RNaseInhibitor 0.25 μ 1, DTT (20mM)1 μ 1,100U/μ 1 SMARTScribe Reverse Transcriptasely l(RTase-對(duì)照用 1μ 1 Sterile H2O 替代)，加 Sterile H2O 至 10 μ 1，于 42°C 90min, 70°C IOmin 條件下反應(yīng)，向上述 RT 產(chǎn)物中各加 20 μ 1 Tricine-EDTA Buffer, 稀釋后用于PCR擴(kuò)增。3) PCR 反應(yīng)使用Advantage-GC 2PCR Kit，進(jìn)行巢式 PCR 擴(kuò)增。首輪PCR擴(kuò)增用外側(cè)引物，二次PCR擴(kuò)增用外側(cè)引物。兩次擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件 均相同。反應(yīng)總體積為50μ 1，包括上述稀釋后的RT產(chǎn)物2. 5μ 1，5XGC 2PCR Buffer 10 μ 1,5Μ GC Melt 5μ 1，20μΜ F primer 0· 5 μ 1，20 μ M R primer 0. 5 μ 1，50 XdNTP Mix 1 μ 1，Advantage-GC 2Polymerase Mix 1 μ 1，加去離子水至 50 μ 1。擴(kuò)增條件為 94°C預(yù)變 性3分鐘，94°C變性30秒，68°C退火30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后68°C延伸6分鐘。將首輪PCR 產(chǎn)物稀釋50倍Tricine-EDTA Buffer，稀釋后取5 μ 1產(chǎn)物用于第二次PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物 分別取5μ 1經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。目的產(chǎn)物純化并進(jìn)行克隆測(cè)序分析。4)克隆測(cè)序分析將上述目的基因切膠、回收并純化后進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast分析為1號(hào) 染色體Ip33-p32. 1區(qū)域的PRP38A基因。本實(shí)施方式僅用于舉例說明本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)內(nèi)容的限制。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)基因斷裂融合的方法，其特征是(1)基因的恒定斷裂位區(qū)域設(shè)為Breakpiont區(qū)，簡(jiǎn)稱B區(qū)；恒定表達(dá)區(qū)設(shè)為Control區(qū)，簡(jiǎn)稱C區(qū)；兩區(qū)相對(duì)表達(dá)量之比稱為B/C比值；(2)使用引物設(shè)計(jì)軟件primer5.0在AML1基因的mRNA上的恒定斷裂位點(diǎn)B區(qū)與恒定表達(dá)區(qū)C區(qū)設(shè)計(jì)引物及探針；AML1斷裂融合發(fā)生在exon5或exon6之后，故B區(qū)引物需分別設(shè)計(jì)在exon5和exon7內(nèi)；C區(qū)應(yīng)在斷裂區(qū)5’側(cè)選擇，故在跨exon3和exon4區(qū)域設(shè)計(jì)；B區(qū)和C區(qū)片段大小接近、退火溫度一致，使其可在同一條件下擴(kuò)增，擴(kuò)增效率盡可能一致；(3)熒光定量PCR方法檢測(cè)AML1基因B區(qū)與C區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物量，由B/C比值來判斷是否發(fā)生融合事件；經(jīng)大樣本統(tǒng)計(jì)分析，正常對(duì)照組B/C比值位于0.7260-1.51之間，因此設(shè)B/C比值低于0.60作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，即B/C比值低于0.60視為AML1基因發(fā)生了斷裂融合；(4)采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)方法結(jié)合克隆測(cè)序進(jìn)行新的融合基因斷裂位點(diǎn)的鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)基因斷裂融合的方法，其特征是對(duì)于篩選出的可疑的基因 發(fā)生斷裂融合的病例，采用RACE方法結(jié)合克隆測(cè)序進(jìn)行新的融合基因斷裂位點(diǎn)的鑒定，尋 找到新的“伙伴”基因。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)基因斷裂融合的方法，其特征是檢測(cè)對(duì)象是以AMLl基因 為代表的自身斷裂位點(diǎn)恒定于某一區(qū)域，但可以和不同基因發(fā)生融合的這類基因的斷裂融合 O
全文摘要
一種檢測(cè)基因斷裂融合的方法，目的是快速、有效；本發(fā)明將基因的恒定斷裂位區(qū)域設(shè)為Breakpiont區(qū)，簡(jiǎn)稱B區(qū)；恒定表達(dá)區(qū)設(shè)為Control區(qū)，簡(jiǎn)稱C區(qū)；兩區(qū)相對(duì)表達(dá)量之比稱為B/C比值；使用引物設(shè)計(jì)軟件primer5.0在AML1基因的mRNA上的恒定斷裂位點(diǎn)B區(qū)與恒定表達(dá)區(qū)C區(qū)設(shè)計(jì)引物及探針；B區(qū)引物分別設(shè)計(jì)在exon5和exon7內(nèi)；C區(qū)在跨exon3和exon4區(qū)域設(shè)計(jì)；采用熒光定量PCR方法檢測(cè)AML1基因B區(qū)與C區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物量，由B/C比值來判斷是否發(fā)生融合事件；設(shè)B/C比值低于0.60作為篩選標(biāo)準(zhǔn)；采用RACE方法結(jié)合克隆測(cè)序進(jìn)行新的融合基因斷裂位點(diǎn)的鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101886119SQ20101011136
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者徐智芳, 王宏偉, 覃艷紅, 陳秀花, 齊喜玲 申請(qǐng)人:王宏偉