專(zhuān)利名稱(chēng)：芋螺毒素mvii a基因的gst融合表達(dá)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程，涉及化學(xué)合成多肽，尤其涉及ω-芋螺毒素MVIIA基因的GST融合表達(dá)及其在藥物中的應(yīng)用。
ω型CTX是近年來(lái)芋螺毒素的重要研究方向，具有廣闊的藥物開(kāi)發(fā)前景[3]。其中，ω-芋螺毒素MVIIA(CTX MVIIA)是電壓敏感型鈣離子通道的抑制劑，其組成序列為CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC，它由25個(gè)氨基酸組成，含6個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基，形成三對(duì)全交叉二硫鍵(即二硫鍵連接方式為Cys1-Cys16，Cys8-Cys20，Cys15-Cys25)[3]。它們具有很高的鎮(zhèn)痛活性且無(wú)成癮性，作為替代嗎啡等成癮止痛劑的候選藥物，目前已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)[3]。
目前，ω-芋螺毒素MVIIA可以用化學(xué)合成的方法獲得，但因?yàn)榉肿又杏?個(gè)半胱氨酸(Cys)需要準(zhǔn)確配對(duì)形成二硫鍵，需要20多步反應(yīng)，得率很低，工藝十分困難，質(zhì)量不穩(wěn)定，而且成本較高。因此，尋找一種合適的方法獲得ω-芋螺毒素MVIIA成為需要。
231 GAKCSRLMYD CCTGSCRSGKC(融合蛋白質(zhì)分子中C227與C242、C234與C246、C241與C251分別形成三對(duì)二硫鍵)該融合蛋白共由251個(gè)氨基酸組成；其中，小寫(xiě)部分為GST的序列，大寫(xiě)部分為芋螺毒素MVIIA的序列，有下劃線(xiàn)的氨基酸為連接部分，該融合蛋白序列中，GST和連接部分的氨基酸序列允許有多種突變，但芋螺毒素MVIIA的序列不變。SEQ ID NO2和3為GST-CTX MVIIA重組融合蛋白的另二種氨基酸序列SEQ ID NO2(246個(gè)氨基酸)1 mspilgywki kglvqptrll leyleekyee hlyerdegdk wrnkkfelgl efpnlpyyid61 gdvkltqsma iiryiadkhn mlggcpkera eismlegavl dirygvsria yskdfetlkv121 dflsklpeml kmfedrlchk tulngdhvth pdfmlydald vvlymdpmcl dafpklvcfk181 krieaipqid kylksskyia wplqgwqatf gggdhppksd pCKGKGAKCS231 RLMYDCCTGS CRSGKCSEQ ID NO3(253個(gè)氨基酸)1 mspilgywki kglvqptrll leyleekyee hlyerdegdk wrnkkfelgl efpnlpyyid61 gdvkltqsma iiryiadkhn mlggcpkera eismlegavl dirygvsria yskdfetlkv121 dglsklpeml kmfedrlchk tylngdhvth pdfmlydald vvlymdpmcl dafpklvcfk181 krieaipqid kylksskyia wplqgwqatf gggdhppksdliegrgipCK231 GKGAKCSRLM YDCCTGSCRS GKCGST-CTX MVIIA重組融合蛋白的表達(dá)，是把合成的CTX MVIIA基因，直接克隆到谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白表達(dá)載體pGEX-2T的BamHI和EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-2T/CTX MVIIA，經(jīng)DNA序列測(cè)定，確認(rèn)其序列的準(zhǔn)確性，然后將此重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得重組融合蛋白，用谷胱甘肽偶聯(lián)的Sepharose 4B經(jīng)親和層析一步即可獲得純化的GST-CTX融合蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是得到的純化GST-CTX MVIIA融合蛋白，在制備治療晚期癌癥和愛(ài)滋病人的頑痛藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是得到的純化GST-CTX MVIIA融合蛋白，在制備治療手術(shù)后的急性疼痛、燒傷、膽絞痛病人、難治性神經(jīng)疼痛等鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是得到的純化GST-CTX MVIIA融合蛋白，在制備治療腦缺血和腦損創(chuàng)等神經(jīng)保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明具有的特點(diǎn)是采用的表達(dá)系統(tǒng)是pGEX-2T，其特點(diǎn)是Ptac啟動(dòng)子受乳糖操縱子的控制。其上游為谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)基因，在GST和多克隆位點(diǎn)之間存在凝血酶的酶切位點(diǎn)。外源基因片段以正確閱讀框架克隆到強(qiáng)啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，在IPTG的誘導(dǎo)下能表達(dá)外源蛋白與GST形成的融合蛋白，且可顯著提高融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)率。在凝血酶作用下，GST和下上游蛋白分子分離，便于純化[5]。GST融合蛋白在水溶液中可溶，在不變性的條件下，通過(guò)親和層析得到。由于細(xì)菌誘導(dǎo)因不同蛋白而異，為了達(dá)到最佳的表達(dá)量，本研究首先對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)時(shí)的溫度進(jìn)行了摸索。經(jīng)摸索發(fā)現(xiàn)(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未列出)，在37℃，誘導(dǎo)3h時(shí)表達(dá)的量最大(可達(dá)50～60mg蛋白/L菌液)，且可溶性好。
本發(fā)明采用基因工程生產(chǎn)出的GST-CTX MVIIA融合蛋白，經(jīng)熱板法測(cè)定其對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛活性，結(jié)果表明它具有很高的鎮(zhèn)痛活性。比文選報(bào)道的嗎啡(有效劑量7.5mg/kg)的鎮(zhèn)痛效果大10～20倍。因融合蛋白具有產(chǎn)量大，易于提取，純化方便，中間流程少、體內(nèi)停留的半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)，可以為開(kāi)發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物提供新的途徑。本發(fā)明為進(jìn)一步的研究芋螺毒素，開(kāi)辟了新途徑奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的融合蛋白基因工程的生產(chǎn)方法，可以得到工藝簡(jiǎn)單、質(zhì)量穩(wěn)定、成本較低的生產(chǎn)路線(xiàn)。而且得到的與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白質(zhì)，分子量較大，體內(nèi)的半衰期(t1/2)較長(zhǎng)，可以直接作為新藥進(jìn)行開(kāi)發(fā)；也可以作為中間體，經(jīng)酶切，得到活性的ω-芋螺毒素MVIIA小肽，進(jìn)行藥物開(kāi)發(fā)。
圖2為融合蛋白GST-CTX MVIIA的誘導(dǎo)表達(dá)。
圖3為融合蛋白GST-CTX MVIIA的可溶性分析和純化。
圖4為小鼠側(cè)腦室給藥后不同時(shí)間內(nèi)的痛閾提高百分率。
實(shí)施例1 芋螺毒素MVIIA基因的的一種表達(dá)材料與方法1.1材料與試劑pGEX-2T質(zhì)粒及大腸桿菌BL21菌種由本室所存；CTX基因合成由上海生工生物工程公司完成；T4多核苷酸激酶(TPK)、T4 DNA連接酶，限制性?xún)?nèi)切酶，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及中分子量Marker，還原型谷光甘肽購(gòu)于上海生工生物工程公司；Glutathione-Sepharose 4B購(gòu)于Parmacia公司；其他試劑均購(gòu)于國(guó)內(nèi)各公司。
1.2方法1.2.1 目的基因的化學(xué)合成因CTX MVIIA多肽基因長(zhǎng)度較短，所以合成更方便快捷。CTX MVIIA全序列由上海生工生物工程公司合成，在其5’端引入BamH I的酶切位點(diǎn)，3’端引入EcoR I的酶切位點(diǎn)及終止密碼子，并用T4多核苷酸激酶(TPK)使每條鏈的5’端磷酸化。把合成的CTX MVIIA基因雙鏈各取10微升混合，于95℃水浴變性，緩慢降溫直至降到45℃為止，復(fù)性完成。
1.2.2重組質(zhì)粒pGEX-2T/CTX MVIIA的構(gòu)建把退火后的CTX雙鏈插入到經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切的pGEX-2T載體中，以T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，形成重組質(zhì)粒，結(jié)果參見(jiàn)

圖1，合成的芋螺毒素MVIIA基因被插入到經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切的pGEX-2T載體中，構(gòu)成重組質(zhì)粒。圖中黑色長(zhǎng)條 代表芋螺毒素MVIIA基因。重組后的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定。SEQ ID NO1為GST-CTX MVIIA重組融合蛋白的一種氨基酸序列1 mspilgywki kglvqptrll leyleekyee hlyerdegdk wrnkkfelgl efpnlpyyid61 gdvkltqsma iiryiadkhn mlggcpkera eismlegavl dirygvsria yskdfetlkv121 dflsklpeml kmfedrlchk tylngdhvth pdfmlydald vvlymdpmcl dafpklvcfk181 krieaipqid kylksskyia wplqgwqatf gggdhppksdlvprgsCKGK231 GAKCSRLMYD CCTGSCRSGK C(融合蛋白質(zhì)分子中C227與C242、C234與C246、C241與C251分別形成三對(duì)二硫鍵)該融合蛋白共由251個(gè)氨基酸組成；其中，小寫(xiě)部分為GST的序列，大寫(xiě)部分為芋螺毒素MVIIA的序列，有下劃線(xiàn)的氨基酸為連接部分，該融合蛋白序列中，GST和連接部分的氨基酸序列允許有多種突變，但芋螺毒素MVIIA的序列不變，下面是GST-CTX MVIIA重組融合蛋白的另二種氨基酸序列(1)(246個(gè)氨基酸)1 mspilgywki kglvqptrll leyleekyee hlyerdegdk wrnkkfelgl efpnlpyyid61 gdvkltqsma iiryiadkhn mlggcpkera eismlegavl dirygvsria yskdfetlkv121 dflsklpeml kmfedrlchk tylngdhvth pdfmlydald vvlymdpmcl dafpklvcfk
181 krieaipqid kylksskyia wplqgwqatf gggdhppksd pCKGKGAKCS232 RLMYDCCTGS CRSGKC(2)(253個(gè)氨基酸)1 mspilgywki kglvqptrll leyleekyee hlyerdegdk wrnkkfelgl efpnlpyyid61 gdvkltqsma iiryiadkhn mlggcpkera eismlegavl dirygvsria yskdfetlkv121 dflsklpeml kmfedrlchk tylngdhvth pdfmlydald vvlymdpmcl dafpklvcfk181 krieaipqid kylksskyia wplqgwqatf gggdhppksdliegrgipCK231 GKGAKCSRLM YDCCTGSCRS GKC1.2.3 GST-CTX融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)BL21感受態(tài)的制備參照文獻(xiàn)[4]，采用CaCl2法。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[4]，將GST-CTX質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，以BL21空菌和含未插入目的基因的質(zhì)粒的BL21為陰、陽(yáng)性對(duì)照。挑取重組成功的克隆接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖過(guò)夜，2％比例接種新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。取出1毫升，以作陰性對(duì)照，其余加入IPTG至終濃度為0.1mM，37℃誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)。1.2.4 GST-CTX融合蛋白的可溶性分析將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌5000rpm離心10min，棄上清，沉淀重懸于冰預(yù)冷的PBS+5mM EDTA(PH8.0)中，以超聲破碎法裂解。15000rpm離心15min，取出上清(沉淀約占總體積的2-4％)，并向沉淀中加入與上清等體積的蒸餾水。各取10微升沉淀及上清，分別加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸3-5min，進(jìn)行12％SDS-PAGE，以檢測(cè)融合蛋白的可溶性。1.2.5表達(dá)融合蛋白的純化挑取克隆成功的重組菌接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖過(guò)夜，將菌液按1∶50的比例接種于含氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600為0.8左右，加入IPTG至終濃度為0.1M，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。5000rpm，4℃離心10分鐘，收集細(xì)菌，重懸于冰預(yù)冷的含5mM的EDTA(PH8.0)的PBS中，冰上放置，超聲裂解。15000rpm，4℃離心15分鐘，取出上清。在PH6.5的5mM的PB中透析過(guò)夜。按方法[5，6]，向上清中加入50％ Glutathione-Sepharose 4B，混合，4℃輕輕振蕩30min，500g離心5min，小心去上清。用10倍體積的PBS洗滌沉淀，500g離心5min，去上清。重復(fù)3次。然后再加入還原型谷光甘肽和50mMTris-Hcl(PH8.0)，混合輕搖10min，500g離心5min，收集上清。純化后的融合蛋白經(jīng)12％SDS-PAGE鑒定。按Bradford法[7]測(cè)定融合蛋白的含量。
1.2.6 GST-CTX融合蛋白鎮(zhèn)痛活性的測(cè)定熱板法[8，9]測(cè)GST-CTX MVIIA融合蛋白對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用。挑取大小相近的雌性小鼠25只，任意分為5組，每組5只。調(diào)節(jié)熱板溫度為55±0.5℃，置小鼠于熱板上，測(cè)定各小鼠的正常痛反應(yīng)。以小鼠舔后足或抬后足并回頭為標(biāo)準(zhǔn)，痛閾時(shí)間為5～30s為正常。60s為最大值。以生理鹽水為對(duì)照，用生理鹽水倍比稀釋融合蛋白溶液，對(duì)小鼠進(jìn)行側(cè)腦室給藥，每只給藥10ul。記錄給藥后不同時(shí)間的痛閾。求出各組平均值，計(jì)算痛閾提高的百分率。
1 結(jié)果2.1重組質(zhì)粒pGEX-2T/CTX MVIIA的序列測(cè)定提取重組的質(zhì)粒，序列測(cè)定由上海生工生物工程公司完成。表明目的基因片段完全正確插入到載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。下列序列為表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T/CTX MVIIA的核苷酸序列，其中加濃的黑色序列為插入的CTX MVIIA基因序列1 CTCCAAAATC GGATCTGGTT CCGCGTGGAT CCTGCAAAGG TAAAGGTGCG51 AAATGCTCTC GTCTGATGTA CGACTGCTGC ACCGGTTCTT GCCGTTCTGG101 TAAATGCTGA GAATTCATCG TGACTGACTG ACGATCTGCC TCGCGCGTIT151 CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT2.2 GST-CTX MVIIA融合蛋白在宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá)各取0.5毫升誘導(dǎo)菌和未誘導(dǎo)菌菌液，以pGEX-2T空載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液為對(duì)照，與等體積的2×SDS上樣緩沖液混合，煮沸3-5min，離心后，各取10微升上樣，觀(guān)察蛋白質(zhì)是否表達(dá)。結(jié)果表明含重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)在分子量約28600處有一濃帶，與預(yù)期的GST-CTX MVIIA融合蛋白的分子量相符。作為對(duì)照的含空載體的BL21菌液經(jīng)誘導(dǎo)后沒(méi)有此分子量的濃帶，而在分子量為26000處有一濃帶，結(jié)果參見(jiàn)圖2，其中M標(biāo)準(zhǔn)分子量，1IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-2T質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液，2未用IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-2T質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液，3IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-2T/CTX重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液，4未用IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-2T/CTX MVIIA重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液。
2.3 GST-CTX融合蛋白的可溶性鑒定將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的重組菌離心，重懸，以超聲破碎法裂解。變性后各取10微升上清和沉淀上樣，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果參見(jiàn)圖3，其中M標(biāo)準(zhǔn)分子量，1未用IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-2T/CTX MVIIA重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液，2IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-2T/CTX重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液的沉淀，3IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-2T/CTX重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液的上清，4純化的GST-CTX MVIIA融合蛋白。在上清和沉淀中有粗細(xì)相近的蛋白質(zhì)條帶。因沉淀的體積僅占總體積的2％左右，故所表達(dá)的蛋白質(zhì)絕大部分是可溶的，占目的蛋白的95％以上。
2.4 GST-CTX MVIIA融合蛋白的純化收集誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌，經(jīng)超聲破碎后，取上清。用Glutathione-Sepharose 4B進(jìn)行親和純化，純化后的融合蛋白進(jìn)行12％SDS-PAGE，參見(jiàn)圖4在分子量為28600處有一單一條帶，表明純化完全，得到了純化的GST-CTX MVIIA融合蛋白。融合蛋白的含量按Bradford法測(cè)定，表明每升細(xì)菌培養(yǎng)液可得到50～60mg蛋白。
2.5 GST-CTX MVIIA融合蛋白鎮(zhèn)痛活性的測(cè)定分別測(cè)定給藥后不同時(shí)間小鼠的平均痛閾值，按以下公式計(jì)算痛閾提高的百分率痛閾提高百分率＝(用藥后平均痛閾值-用藥前平均痛閾值)/用藥前平均痛閾值根據(jù)每組不同時(shí)間的痛閾提高百分率作圖，橫坐標(biāo)代表時(shí)間，縱坐標(biāo)代表痛閾提高百分率，結(jié)果參見(jiàn)圖4，圖中的曲線(xiàn)表示不同的給藥量(ug/kg)。結(jié)果表明其鎮(zhèn)痛活性比嗎啡(有效劑量7.5mg/kg)大10～20倍左右，比MVIIA略低，具有很高的鎮(zhèn)痛活性。
實(shí)施例2由于芋螺毒素MVIIA可以阻斷神經(jīng)細(xì)胞N-型電壓敏感鈣離子通道，從而可以抑制痛覺(jué)信號(hào)傳遞，具有廣泛的鎮(zhèn)痛作用。可以用于急性與持續(xù)性疼痛，例如癌癥晚期、愛(ài)滋病、手術(shù)后的急性疼痛、燒傷、膽絞痛病人、難治性神經(jīng)疼痛等病人的鎮(zhèn)痛，其作用可以代替嗎啡類(lèi)鎮(zhèn)痛劑。我們用電板鎮(zhèn)痛(國(guó)際公認(rèn)的模型)，已經(jīng)證明了其效果。方法見(jiàn)1.2.6，結(jié)果參見(jiàn)圖4，結(jié)果表明它具有很高的鎮(zhèn)痛活性。比文選報(bào)道的嗎啡(有效劑量7.5mg/kg)的鎮(zhèn)痛效果大1000倍?？勺鳛樘娲鷨岱鹊瘸砂a止痛劑的候選藥物。
實(shí)施例3另外，芋螺毒素還有神經(jīng)保護(hù)作用，當(dāng)大腦局部缺血或機(jī)械性創(chuàng)傷發(fā)生時(shí)，由于芋螺毒素MVIIA可以阻斷神經(jīng)細(xì)胞N-型電壓敏感鈣離子通道，從而可以抑制刺激性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和病原性鈣離子進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，可能作為腦損傷的保護(hù)劑，可進(jìn)行大腦局部缺血或機(jī)械性創(chuàng)傷保護(hù)藥的開(kāi)發(fā)[11-13]。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻(xiàn)1.Baldomero M，Olivera，Lourdes J，Cruz Conotoxins，in retrospect Toxicon 2001；397-142.Olivera BM，Rivier J，Clark C，et al.Diversity of conus neuropeptides.J Science，1990，24913383.Olivera BM，Miljanick GP，Ramachandran J，et al.Calcium channel diversity and
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權(quán)利要求
1.芋螺毒素MVIIA基因的GST融合表達(dá)及其應(yīng)用，其特征是在大腸桿菌中克隆并表達(dá)GST-CTX MVIIA重組融合蛋白，經(jīng)GST親和層析純化，得到純化的GST-CTXMVIIA融合蛋白。SEQ ID NO1為GST-CTXMVIIA重組融合蛋白的一種氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的GST-CTX MVIIA重組融合蛋白的序列，其特征是該融合蛋白序列中，GST和連接部分的氨基酸序列允許有多種突變，但芋螺毒素MVIIA的序列不變。SEQ ID NO2和3為GST-CTX MVIIA重組融合蛋白的另二種氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的GST-CTX MVIIA重組融合蛋白的表達(dá)，其特征是把合成的CTX MVIIA基因，直接克隆到谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白表達(dá)載體pGEX-2T的BamH I和EcoR I位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-2T/CTXMVIIA，經(jīng)DNA序列測(cè)定，確認(rèn)其序列的準(zhǔn)確性，然后將此重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得重組融合蛋白，用谷胱甘肽偶聯(lián)的Sepharose4B經(jīng)親和層析獲得純化的GST-CTX融合蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的GST-CTX MVIIA重組融合蛋白的應(yīng)用，其特征是得到的純化GST-CTX MVIIA融合蛋白，在制備治療晚期癌癥和愛(ài)滋病人的頑痛藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1所述的GST-CTX MVIIA重組融合蛋白的應(yīng)用，其特征是得到的純化GST-CTX MVIIA融合蛋白，在制備治療手術(shù)后的急性疼痛、燒傷、膽絞痛病人、難治性神經(jīng)疼痛等鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求1所述的GST-CTX MVIIA重組融合蛋白的應(yīng)用，其特征是得到的純化GST-CTX MVIIA融合蛋白，在制備治療腦缺血和腦損創(chuàng)等神經(jīng)保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種芋螺毒素MVII A基因的GST融合表達(dá)及其應(yīng)用，是在大腸桿菌中克隆并表達(dá)GST－CTXMVII A重組融合蛋白，經(jīng)GST親和層析純化，得到純化的GST－CTX MVII A融合蛋白。本發(fā)明得到的融合蛋白，可在制備治療晚期癌癥和艾滋病人的頑痛藥物中應(yīng)用，也可在制備治療手術(shù)后的急性疼痛、燒傷、膽絞痛病人、難治性神經(jīng)疼痛等鎮(zhèn)痛藥物中應(yīng)用，因有神經(jīng)保護(hù)作用，還可在制備用于腦缺血和腦損創(chuàng)的治療藥物中應(yīng)用。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、質(zhì)量穩(wěn)定、成本較低，得到的融合蛋白分子量較大，體內(nèi)的半衰期(t
文檔編號(hào)A61P1/16GK1473935SQ0314205
公開(kāi)日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2003年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月30日
發(fā)明者詹金彪, 陳永對(duì) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)