專利名稱：一種海洋信號(hào)芋螺毒素Lt14a熒光探針、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種海洋信號(hào)芋螺毒素Ltl4a熒光探針的制備方法及應(yīng)用，是有關(guān)藥物篩選的技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
海洋藥物的開發(fā)和研究是目前許多生物資源利用的重要組成部分，是海洋生物研究的熱點(diǎn)。其中海洋軟體動(dòng)物芋螺含有豐富的毒液，其毒液中的芋螺多肽是非常具有生物學(xué)價(jià)值的一類天然物質(zhì)。由于芋螺毒素能高度特異地識(shí)別和結(jié)合不同亞型的神經(jīng)離子通道及受體，作為天然存在最為廣泛的一類作用于神經(jīng)系統(tǒng)的多肽分子，芋螺毒素成為神經(jīng)藥理學(xué)研究不可多得的來源。有些則被設(shè)計(jì)作為藥物的導(dǎo)向化合物或直接開發(fā)為療效特異的高效新藥，因此，專家們將芋螺毒素稱之為“藥物寶庫”，這對芋螺毒素的研究也有著重要的理論和實(shí)際意義。長期以來對于毒素的生理作用最重要的方法是膜片鉗技術(shù)，但是鑒于膜片鉗技術(shù)的難度，設(shè)備要求和環(huán)境要求都有極其苛刻的要求，很難在普通的環(huán)境下得到研究數(shù)據(jù)。由于大規(guī)模的毒素篩選，采用膜片鉗技術(shù)有一定的技術(shù)制約性，因此，我們探討通過細(xì)胞膜染色定位的方法進(jìn)行毒素作用位點(diǎn)的初篩，加快了毒素篩選的步驟，簡化了方法。芋螺毒素Ltl4a，是從中國南海信號(hào)芋螺(Conus Iitteratus)的cDNA文庫中得到的一種L -超家族毒素，其半胱氨酸骨架為C-C-C- C，理論上推測應(yīng)該是配體門控乙酰膽堿受體的拮抗劑，與疼痛信號(hào)的產(chǎn)生傳導(dǎo)有關(guān)。因此我們采用細(xì)胞膜定位的方法初步檢測毒素作用的位點(diǎn)，為進(jìn)一步膜片鉗的篩選提供了有利的證據(jù)。利用氨基反應(yīng)對Ltl4a進(jìn)行突光標(biāo)記探針的制備,標(biāo)記的Alexa Fluor488_Ltl4a作用于PC12細(xì)胞表面呈現(xiàn)綠色突光，乙酰膽堿受體拮抗劑Tubocurarine chloride (TUB)和阻斷劑Hexamethonium bromide (HB)能夠抑制Alexa Fluor488_Ltl4a和細(xì)胞膜上乙酸膽堿受體的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種海洋信號(hào)芋螺毒素Ltl4a熒光探針的制備方法及應(yīng)用，采用本方法標(biāo)記的海洋芋鏍毒素Ltl4a熒光探針可以用于細(xì)胞膜受體的檢測，對毒素藥理作用的篩選具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


附圖1Alexa Fluor488_Ltl4a探針合成反相高效液相色譜圖附圖2Alexa Fluor488_Ltl4a 探針 MALD1-TOF-TOF 質(zhì)譜圖附圖3A、B、C、D四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的熒光顯微鏡鏡檢照片
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中的海洋信號(hào)芋螺毒素Ltl4a的氨基酸N端到C端序列:MCPPLCKPSCTNC。其C末端的氨基和Alexa Fluor488染料的羧基反應(yīng)制備海洋芋螺毒素?zé)晒鈽?biāo)記探針AleaxFluor488-Ltl4a實(shí)施例1:海洋芋螺毒素LtHa的熒光標(biāo)記探針的制備1、實(shí)驗(yàn)試劑\^\ Fluor'* 488carboxylic acid, succinimidyl ester 購買自 invitrogen 公司；乙睛(aceLonitrile)購自天津四友化學(xué)公司；DMS0,三氟乙酸(TFA)購買自Sigma公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。2、溶液配制標(biāo)記反應(yīng)液:將Alexa Fluori( 488carboxylic acid, succinimidyl ester 溶解于DMSO中，配成10mg/ml的母液，-20°C避光保存；反應(yīng)緩沖液:0.2M NaHCO3, PH8.3 ；Ltl4a: 15mg/ml 溶液；反應(yīng)終止液:50μI DMSO+150 μ 10.1%TFA ddH20。3、實(shí)驗(yàn)方法
(I)將Ltl4a溶液與反應(yīng)緩沖液(0.2M NaHCO3)按1:1的比列混合，使NaHCO3的終濃度為0.1M，制備成Ltl4a的反應(yīng)液；(2)將(I)配好的200μ I Ltl4a反應(yīng)液與400 μ I標(biāo)記反應(yīng)液按1:2體積比混勻，以此獲得氣基反應(yīng)體系；(3) 4°C避光，不停翻轉(zhuǎn)反應(yīng)36h ；(4)終止反應(yīng):加入反應(yīng)終止液于反應(yīng)體系中；(5)利用HPLC純化目的產(chǎn)物，即偶聯(lián)的Alexa-Fluor488_Ltl4a。HPLC洗脫條件:流動(dòng)相A:水(含0.1%TFA)，流動(dòng)相B:乙腈(含0.1%TFA)，95%流動(dòng)相A，5%流動(dòng)相B線性梯度洗脫40min至5%的流動(dòng)相A，95%流動(dòng)相B，洗脫條件見表I。表I反相高效液相色譜洗脫梯度
權(quán)利要求
1.一種海洋信號(hào)芋螺毒素Ltl4a熒光探針的制備方法，其特征在于利用氨基反應(yīng)對Ltl4a進(jìn)行熒光標(biāo)記探針的制備，并對制備方法進(jìn)行保護(hù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:將Ltl4a與反應(yīng)緩沖液0.2M NaHCO3按1:1的比例混合，使NaHCO3的終濃度為0.1M以制得Ltl4a反應(yīng)液，再將Ltl4a反應(yīng)液與Aiexa Fluor'0 488carboxylic acid, succinimidyl ester 按 1:2 的比列混勻制備突光探針。
3.一種采用如權(quán)利要求1 2任一所述的方法制備得到的海洋信號(hào)芋螺毒素Ltl4a的Alexa Fluor488_Ltl4a 突光探針。
4.一種采用如權(quán)利要求1 2任一所述的方法制備得到的海洋信號(hào)芋螺毒素Ltl4a的Alexa Fluor488-L tl4a熒光探針可以用于檢測細(xì)胞膜乙酰膽堿受體的生物學(xué)功能。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋芋螺毒素Lt14a標(biāo)記探針及其制備方法。采用該方法標(biāo)記的海洋芋螺毒素Lt14a標(biāo)記探針可與PC12細(xì)胞膜受體結(jié)合，表面出現(xiàn)明顯的綠色熒光，加入乙酰膽堿受體拮抗劑同時(shí)阻斷Lt14a和乙酰膽堿受體的作用后，可證明探針的特異性，該探針可以更好的用于藥物篩選。
文檔編號(hào)G01N33/53GK103224543SQ20131009753
公開日2013年7月31日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者任政華, 覃夢影, 王磊, 徐安龍, 周亮, 潘武廣, 元少春 申請人:中山大學(xué)