專利名稱：一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及快速檢測微藻油脂含量的方法。
背景技術：
生物柴油是新型“綠色能源”，具有可再生和環(huán)境保護的雙重功效，符合國家“十二五”規(guī)劃節(jié)能減排和低碳經(jīng)濟發(fā)展的戰(zhàn)略需求。目前，生物柴油主要以動植物油脂(豬油、牛油、玉米、大豆、油菜籽等農(nóng)作物)以及餐飲廢油為主要生產(chǎn)原料，是替代傳統(tǒng)石化能源、減少溫室氣體排放的新型可再生能源。然而傳統(tǒng)的以農(nóng)作物為原料生物柴油生產(chǎn)技術，對農(nóng)作物需求量大，從而形成了 “與人爭糧，與糧爭地”的局面，導致糧食價格上漲。因此，積極尋找新的生物質(zhì)能源材料，緩解面臨的糧食和能源危機、促進經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展已成為世界各國決策者和研究者高度關注的問題。在生物柴油制備的各種原材料中，微藻是重要的可再生資源，同時也是生物柴油巨大的資源庫，具有分布廣泛、光合效率高、生長周期短、產(chǎn)量高、富含油脂、環(huán)境適應能力強，最重要的是不占用耕地等優(yōu)點。同時，微藻的生長能夠捕獲廢氣中的二氧化碳，既可以降低生物柴油生產(chǎn)成本又可以緩解溫室氣體效應。因此，微藻生物柴油被認為是唯一可能取代化石油的重要替代品，發(fā)展前景廣闊。目前制約微藻生物柴油規(guī)?；钠款i問題是昂貴的生產(chǎn)成本，其根本也取決于微藻藻種的含油量。因此，培育出生長迅速、環(huán)境適應力強、富油的微藻新品種是微藻生物柴油提高產(chǎn)率和降低成本的關鍵。然而用傳統(tǒng)的有機溶劑提取法測定微藻油脂含量繁瑣、費力、成本高、易造成環(huán)境污染，同時其檢測費時(通常為3 4天)，難以滿足富油微藻篩選大規(guī)模、快速、高效的要求。尼羅紅是一種疏水性較強的熒光染料，可以根據(jù)極性的不同展現(xiàn)出從黃色到紅色的熒光顏色，但在水環(huán)境中尼羅紅所發(fā)的熒光會完全淬滅。此外，由于尼羅紅具有良好的光化學穩(wěn)定性和特殊的發(fā)光波長范圍，故可排除多數(shù)生物分子在測定中的干擾。經(jīng)尼羅紅染色后微藻細胞所發(fā)的熒光強度與胞內(nèi)的油脂含量顯著相關，并且尼羅紅染色法耗時較短、所需生物樣品量少、操作步驟較為簡單，可直接用于測定微藻細胞的油脂含量，使分析測定方法明顯簡化。由于微藻的細胞壁厚且堅硬，尼羅紅不易穿透細胞與油脂粒結(jié)合，導致染色效果不理想，因此，采用有效的破壁方法以提高尼羅紅的染色效果是實現(xiàn)快速、高效油脂檢測方法的關鍵。超聲波振動時能發(fā)出并傳遞強大的能量，可以對媒質(zhì)產(chǎn)生強烈的機械振動、空化、攪拌等作用。且其具有高效、能耗低、保持胞內(nèi)物質(zhì)生物活性等特點。通過超聲波能高效的破壞細胞壁，使其中的成分溶于溶劑中，更有助于熒光染料的染色。然而，尚缺乏超聲波應用于微藻熒光染色方面的報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有檢測微藻油脂含量的方法繁瑣、費時、費力、成本高、易造成環(huán)境污染以及尼羅紅對微藻細胞染色效果不理想的問題，而提供了一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法。本發(fā)明的一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法，是由下列步驟實現(xiàn)的:一、取微藻藻液，經(jīng)離心收集固相物，加入等體積的去離子水或超純水，得重懸微藻細胞，將其分成兩份待用；二、將步驟一得到的一 份重懸微藻細胞，在溫度為O 4°C的條件下超聲破碎I 30min ；三、向步驟二超聲破碎后的重懸微藻細胞中加入尼羅紅混勻，避光染色I 30min，將染色后的微藻細胞分為兩份；四、取步驟三中的一份染色后的微藻細胞，采用三維熒光光譜對步驟三染色后的微藻細胞測定熒光強度；五、取步驟三中另一份的染色后的微藻細胞，采用二維熒光光譜測定熒光強度，將染色后的微藻細胞二維熒光光譜所測定的熒光強度數(shù)值減去尼羅紅和未進行尼羅紅染色微藻細胞在二維熒光光譜相同波長下測得的熒光強度數(shù)值之和，即得相對熒光強度，然后取步驟一中的另一份重懸微藻細胞采用有機溶劑提取法測定油脂含量，構建相對熒光強度-油脂含量標準曲線；六、根據(jù)標準曲線公式計算待測微藻的油脂含量；標準曲線公式為:y=0.0268x-l.5532 ;其中，R2=0.9957，y為油脂含量，單位為mg!/1 ;X為相對熒光強度；其中，步驟三中所述的尼羅紅加入量為加入尼羅紅至溶液中尼羅紅的濃度為0.1 5.0mgr1 ;步驟四中所述的三維熒光光譜激發(fā)波長為220 750nm，發(fā)射波長為220 750nm ;步驟五中所述的二維熒光光譜的激發(fā)波長為450 550nm，發(fā)射波長為500 700nmo本發(fā)明包含以下有益效果:本發(fā)明的方法首次采用三維熒光對微藻細胞進行油脂測定，將超聲輔助與尼羅紅熒光染色法耦合，用于定量檢測微藻細胞的油脂含量，所需樣品少、靈敏度高、易于操作，可用于富油微藻的高通量篩選及胞內(nèi)油脂含量的動態(tài)監(jiān)測等。


圖1為經(jīng)超聲處理后尼羅紅染色微藻三維熒光光譜圖；圖2為經(jīng)尼羅紅染色后的二維熒光光譜圖；其中，a為超聲前二維熒光光譜圖，b為超聲后二維熒光光譜圖；圖3為相對熒光強度-油脂含量標準曲線。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一:本實施方式的一種超聲輔助突光染色檢測微藻油脂含量的方法，是由下列步驟實現(xiàn)的:—、取微藻藻液，經(jīng)離心收集固相物，加入等體積的去離子水或超純水，得重懸微藻細胞，將其分成兩份待用；二、將步驟一得到的一份重懸微藻細胞，在溫度為O 4°C的條件下超聲破碎I 30min ；三、向步驟二超聲破碎后的重懸微藻細胞中加入尼羅紅混勻，避光染色I 30min，將染色后的微藻細胞分為兩份；四、取步驟三中的一份染色后的微藻細胞，采用三維熒光光譜對步驟三染色后的微藻細胞測定熒光強度；五、取步驟三中另一份的染色后的微藻細胞，采用二維熒光光譜測定熒光強度，將染色后的微藻細胞二維熒光光譜所測定的熒光強度數(shù)值減去尼羅紅和未進行尼羅紅染色微藻細胞在二維熒光光譜相同波長下測得的熒光強度數(shù)值之和，即得相對熒光強度，然后取步驟一中的另一份重懸微藻細胞采用有機溶劑提取法測定油脂含量，構建相對熒光強度-油脂含量標準曲線；六、根據(jù)標準曲線公式計算待測微藻的油脂含量；標準曲線公式為:y=0.0268x-l.5532 ;其中，R2=0.9957，y為油脂含量，單位為mg!/1 ;X為相對熒光強度；其中，步驟三中所述的尼羅紅加入量為加入尼羅紅至溶液中尼羅紅的濃度為
0.1 5.0mgr1 ;步驟四中所 述的三維熒光光譜激發(fā)波長為220 750nm，發(fā)射波長為220 750nm ;步驟五中所述的二維熒光光譜的激發(fā)波長為450 550nm，發(fā)射波長為500 700nmo本實施方式步驟五中所述的“將染色后的微藻細胞二維熒光光譜所測定的熒光強度數(shù)值減去尼羅紅和未進行尼羅紅染色微藻細胞在二維熒光光譜相同波長下測得的熒光強度數(shù)值之和”是指先將尼羅紅和未進行尼羅紅染色微藻細胞的熒光強度數(shù)值相加，再與染色后的微藻細胞測得的熒光強度數(shù)值做差。本實施方式的方法首次采用三維熒光對微藻細胞進行油脂測定，將超聲輔助與尼羅紅熒光染色法耦合，用于定量檢測微藻細胞的油脂含量，所需樣品少、靈敏度高、易于操作，可用于富油微藻的高通量篩選及胞內(nèi)油脂含量的動態(tài)監(jiān)測等。
具體實施方式
二:本實施方式與具體實施方式
一不同的是:所取藻液的體積為3 60mL。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三:本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟一中所述的微藻藻液所用微藻為小球藻、柵藻、娃藻、隱甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻或金藻。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四:本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是:步驟二中所述的超聲條件為:超聲時間為3 30s，間隔時間為2 6s，超聲功率為15 150W。其它
與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五:本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是:步驟三中所述的尼羅紅加入量為加入尼羅紅至溶液中尼羅紅的濃度為1.0 3.0mgL'其它與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六:本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是:步驟五中所述的二維熒光光譜的激發(fā)波長為530 540nm，發(fā)射波長為565 575nm。其它與具體實施
方式一至五之一相同。
具體實施方式
七:本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是:步驟五中所述的有機溶劑提取法為氯仿-甲醇法、索氏抽提法、正己烷-異丙醇法、正己烷-乙醇法或乙醚-石油醚法。其它與具體實施方式
一至六之一相同。通過以下試驗驗證本發(fā)明的有益效果:試驗I本試驗的一種超聲輔助熒光染色檢測柵藻油脂含量的方法是按照以下步驟進行的:一、取50mL柵藻藻液(Scenedesmaceae),在轉(zhuǎn)速為IOOOOrmirf1的條件下離心lOmin，收集固相物，加入等體積的超純水后，重懸藻細胞，分成兩份待用；二、將裝有步驟一中得到的一份重懸藻細胞的離心管在溫度為O 4°C的條件下在細胞破碎儀上進行超聲處理，超聲破碎儀的工作條件為:破碎時間5min，每超聲30s，間隔5s，循環(huán)，超聲波細胞破碎儀輸出功率為120W ；三、經(jīng)步驟二超聲處理后的藻液中加入尼羅紅，使溶液中尼羅紅的濃度為
1.SmgI/1,混勻后避光染色15min,將染色后的微藻細胞分為兩份；四、取步驟三中的一份染色后的微藻細胞，采用三維熒光光譜測定最適的激發(fā)波長與發(fā)射波長，其中，激發(fā)波長為220 750nm，發(fā)射波長為220 750nm ；五、取步驟三中另一份的染色后的微藻細胞，采用二維熒光光譜測定熒光強度，其中，激發(fā)波長為530 540nm，發(fā)射波長為565 575nm ;將染色后的微藻細胞二維熒光光譜測定的染色微藻細胞熒光強度數(shù)值與尼羅紅和未進行尼羅紅染色的微藻細胞在上述二維熒光光譜波長下測得的熒光強度數(shù)值之和作差，即得相對熒光強度，然后取步驟一所得的另一份重懸微藻細胞用有機溶劑提取法測定油脂含量，通過所測得的相對熒光強度與油脂含量，構建相對熒光強度-油脂含量標準曲線；六、根據(jù)標準曲線公式計算待測微藻的油脂含量；標準曲線公式為:y=0.0268x-l.5532 ;其中，R2=0.9957，y為油脂含量，單位為mgL—1 ；x為相對突光強度。本試驗步驟一中所述的柵藻，篩選方法是按以下步驟實現(xiàn):一、取微藻樣品，加入到培養(yǎng)基A中富集培養(yǎng)15 30天；二、取步驟一得到的藻液，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養(yǎng)基A中，在溫度為25°C的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 14天；三、重復步驟二 2 3次，得藻液A ;四、取步驟三得到的藻液A，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養(yǎng)基B中，在溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 14天，得藻液B ;五、取步驟四得到的藻液B以無菌水按ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—5和10_6的倍數(shù)進行稀釋，將10_5 10_6倍數(shù)稀釋后的藻液均勻涂布于固體培養(yǎng)基C平板上，在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)藻落；六、在無菌環(huán)境中，挑取生長較快、較大的單藻落，轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基B中，在溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 14天；七、重復步驟五至步驟六3 4次，即完成藻株的分離，得到微藻液；八、取步驟七得到的微藻液，用超聲波進行破碎，在破碎后的藻液中加入尼羅紅溶液，混勻染色后，測定藻液的熒光強度，選擇熒光強度最高的藻株，即得到柵藻；其中，步驟一和步驟二中所述的培養(yǎng)基A按重量分數(shù)是由I份硝酸鈉、0.075份硫酸鎂、0.04份磷酸氫二鉀、0.036份氯化鈣、0.02份碳酸鈉、0.006份檸檬酸、0.006份檸檬酸鐵銨、0.001份乙二胺四乙酸和0.00541份微量元素組成的；步驟四和步驟六中所述的培養(yǎng)基B按重量分數(shù)是由0.5份硝酸鈉、0.075份硫酸鎂、0.04份磷酸氫二鉀、0.036份氯化鈣、0.02份碳酸鈉、0.006份檸檬酸、0.006份檸檬酸鐵銨、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素和10份葡萄糖組成的；步驟五中所述的固體培養(yǎng)基C按重量分數(shù)是由0.5份硝酸鈉、0.075份硫酸鎂、0.04份磷酸氫二鉀、0.036份氯化鈣、0.02份碳酸鈉、0.006份檸檬酸、0.006份檸檬酸鐵銨、
0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素、10份葡萄糖和15份瓊脂組成的；步驟八中所述的藻液與尼羅紅溶液的體積比為3:1000。本試驗測得的微藻油脂含量的三維熒光光譜結(jié)果如圖1所示，由圖1可以得出最適的激發(fā)波長為530 540nm,發(fā)射波長為565 575nm ；本試驗測得的微藻油脂含量的二維熒光光譜測定結(jié)果如圖2所示，由圖2可以得出超聲破碎可以顯著提高染色藻液的熒光強度，與未經(jīng)超聲處理的染色微藻液相比，經(jīng)超聲破碎后染色微藻液的突光強度增長了 3倍多；圖3為本試驗構建的相對熒光強度-油脂含量標準曲線，從圖3中可以看出相對熒光強度與油脂含量呈顯著相關性，通過測定經(jīng)所述步驟超聲處理后的染色藻液所發(fā)的熒光強度，即可定量的得到微藻的油脂含量，達到了快速、高效測定富油微藻油脂含量的目的。試驗2本試驗與試驗I不同的是:步驟一中所采用的微藻藻液為市售柵藻，其它與試驗I相同。本試驗的測定結(jié)果為經(jīng)本方法處理的樣品熒光強度為380.965，比未經(jīng)本方法處理提高了約2.4倍。
權利要求
1.一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法，其特征在于它是按下列步驟實現(xiàn)的: 一、取微藻藻液，經(jīng)離心收集固相物，加入等體積的去離子水或超純水，得重懸微藻細胞，將其分成兩份待用； 二、將步驟一得到的一份重懸微藻細胞，在溫度為O 4°C的條件下超聲破碎I 30min ； 三、向步驟二超聲破碎后的重懸微藻細胞中加入尼羅紅混勻，避光染色I 30min，將染色后的微藻細胞分為兩份； 四、取步驟三中的一份染色后的微藻細胞，采用三維熒光光譜對步驟三染色后的微藻細胞測定熒光強度； 五、取步驟三中另一份的染色后的微藻細胞，采用二維熒光光譜測定熒光強度，將染色后的微藻細胞二維熒光光譜所測定的熒光強度數(shù)值減去尼羅紅和未進行尼羅紅染色微藻細胞在二維熒光光譜相同波長下測得的熒光強度數(shù)值之和，即得相對熒光強度，然后取步驟一中的另一份重懸微藻細胞采用有機溶劑提取法測定油脂含量，構建相對熒光強度-油脂含量標準曲線； 六、根據(jù)標準曲線公式計算待測微藻的油脂含量； 標準曲線公式為:y=0.0268X-1.5532 ;其中，R2=0.9957，y為油脂含量，單位為mgL—1 ；x為相對熒光強度； 其中，步驟三中所述的尼羅紅加入量為加入尼羅紅至溶液中尼羅紅的濃度為0.1 5.0mgr1 ;步驟四中所述的三維熒光光譜激發(fā)波長為220 750nm，發(fā)射波長為220 750nm;步驟五中所述的二維熒光光譜的激發(fā)波長為450 550nm，發(fā)射波長為500 700nmo
2.根據(jù)權利要求1所述一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法，其特征在于所取藻液的體積為3 60mL。
3.根據(jù)權利要求1所述一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法，其特征在于步驟一中所述的微藻藻液所用微藻為小球藻、柵藻、硅藻、隱甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻或金藻。
4.根據(jù)權利要求1所述一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法，其特征在于步驟二中所述的超聲條件為:超聲時間為3 30s，間隔時間為2 6s，超聲功率為15 150W。
5.根據(jù)權利要求1所述一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法，其特征在于步驟三中所述的尼羅紅加入量為加入尼羅紅至溶液中尼羅紅的濃度為1.0 3.0mgL'
6.根據(jù)權利要求1所述一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法，其特征在于步驟五中所述的二維突光光譜的激發(fā)波長為530 540nm,發(fā)射波長為565 575nm。
7.根據(jù)權利要求1所述一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法，其特征在于步驟五中所述的有機溶劑提取法為氯仿-甲醇法、索氏抽提法、正己烷-異丙醇法、正己烷-乙醇法或乙醚-石油醚法。
全文摘要
一種超聲輔助熒光染色檢測微藻油脂含量的方法，它涉及快速檢測微藻油脂含量的方法。本發(fā)明針對微藻藻種細胞壁較厚，熒光染料難以穿透其細胞壁和細胞膜與胞內(nèi)脂質(zhì)有效結(jié)合的技術難點。本方法將微藻液利用超聲波進行處理后采用脂溶性染料尼羅紅進行染色。所用的激發(fā)波長為530～540nm，發(fā)射波長為565～575nm，建立了相對熒光強度-油脂含量標準曲線，用于定量檢測微藻細胞的油脂含量。本方法所需樣品量少、靈敏度高、易于操作，可用于富油微藻的高通量篩選及胞內(nèi)油脂含量的動態(tài)監(jiān)測等。
文檔編號G01N21/64GK103163113SQ20131009732
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權日2013年3月25日
發(fā)明者劉冰峰, 任宏宇, 任南琪, 謝國俊, 趙磊, 馬超 申請人:哈爾濱工業(yè)大學