專利名稱：新的o－超家族芋螺毒素肽，其編碼多核苷酸及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的O-超家族芋螺毒素肽、其編碼多核苷酸及用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是由生活在熱帶海洋中的肉食性軟體動物芋螺(Conus)分泌出來的，用于麻醉獵物的小肽類毒素。它們是由6-41個氨基酸殘基組成的，富含半胱氨酸(Cys)的動物神經(jīng)肽毒素。其毒性極大，可引起動物出現(xiàn)驚厥、顫抖、甚至麻痹死亡。芋螺毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，生物活性強，作用靶位的選擇性高。既可直接用作天然藥物，又可作為藥物設(shè)計的先導(dǎo)化合物。鑒于其分子小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、對受體作用范圍大、特異性強、可化學(xué)合成；又是基因表達的產(chǎn)物，還可在體外重組表達獲得較大量毒素。每種芋螺毒液中有約50-200種不同的芋螺毒素(Conotoxin，CTX)，且不同芋螺種類的毒素肽互不相同，不同的芋螺毒素在生物體內(nèi)的作用靶位完全不同，至少有幾萬種芋螺毒肽具有調(diào)節(jié)各種離子通道的特殊功能，從而組成了一系列的神經(jīng)藥物源。食蟲芋螺毒素對多種蠕蟲有致死作用，可開發(fā)為多肽殺蟲劑，或轉(zhuǎn)化植物培育抗蟲作物新品種。因此，芋螺毒素已躍居動物神經(jīng)毒素研究的首位，成為藥理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的有力工具和新藥開發(fā)的新來源，引起了全世界科學(xué)家們的廣泛重視。我國芋螺資源豐富，是我國海南特有的藥用海洋生物，絕大多數(shù)芋螺種類的毒素研究尚未開展，我國更應(yīng)加緊開展具有自主知識產(chǎn)權(quán)的芋螺毒素基因資源的研究開發(fā)工作，對海洋制藥工業(yè)具有特別重要的意義。本發(fā)明內(nèi)容正是適應(yīng)當(dāng)前海洋藥物芋螺毒素研究的發(fā)展趨勢和需要而取得的，具有廣闊的應(yīng)用前景。
根據(jù)芋螺毒素作用于生物體內(nèi)的不同靶位可分為3類(1)作用于電壓門控離子通道的CTX，電壓門控離子通道又稱電壓敏感性通道，常以通透離子(如Na+，K+，Ca2+等)命名。(2)作用于配體門控離子通道的CTX，包括煙堿受體、5HT3受體、NMDA受體。配體門控通道又稱化學(xué)門控通道或遞質(zhì)依賴性通道，后者按相應(yīng)的受體命名。(3)作用于其他受體的CTX，CTX除了作用于離子通道以外，還有以G-蛋白為靶標(biāo)的，如芋螺加壓素和芋螺惰性素，以及2種磷脂(conodipineM和PLA2)，它們基本上不含有二硫鍵。按其作用的受體靶可將芋螺毒素分為α、ω、μ、δ等多種亞型。根據(jù)芋螺毒素基因及其前體蛋白信號肽的保守性，可將芋螺毒素分為A、O、T、M、P、I等多個超家族。每個超家族根據(jù)受體靶類型，又可分為α、αA、κA(A-超家族)，ω、δ、κ、μO(O-超家族)，μ、ψ、KM(M-超家族)等家族(亞型)(見表1，引自J.Michael McIntosh，et al.CONUS PEPTIDES TARGETED TOSPECIFIC NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR SUBTYPES.AnnualReview of Biochemistry.1999，(68)59-88.)與受體有關(guān)的過程是生命調(diào)節(jié)過程中的重要環(huán)節(jié)，受體蛋白的研究鑒定，與具有特異作用和高親和性結(jié)合能力的毒素密切相關(guān)。芋螺毒素通過與神經(jīng)和肌肉細(xì)胞膜多種受體(鈉通道、鈣通道和乙酰膽堿受體等)特異性結(jié)合，影響與受體有關(guān)的一系列細(xì)胞調(diào)節(jié)過程，使受體研究從推測分析水平進入闡明分子機理水平，成為神經(jīng)科學(xué)研究鑒定受體及其調(diào)控細(xì)胞活動分子機理的重要工具，并在頑痛、癲癇癥、心臟血管疾病、精神病、運動失調(diào)、痙攣、癌癥、艾滋病、神經(jīng)保護、中風(fēng)等疑難雜癥的治療中顯示出誘人的應(yīng)用前景。多種芋螺毒素已進入臨床試驗(見表2，引自LAURA NELSON.Venomous snailsOne slip，andyou′re dead....Nature，2004，429798-799).
表1 芋螺毒素超家族

表2 處于不同臨床試驗階段的芋螺毒素

O-超家族芋螺毒素(半胱氨酸模式C-C-CC-C-C)主要作用于電壓門控離子通道(又稱電壓敏感性通道)，包括Ca2+離子通道、Na+離子通道和K+離子通道等。
Ca2+通道為所有興奮性細(xì)胞膜的必要成分之一，分為L，T，N，P和Q類型，其中N類型的Ca2+通道只存在于神經(jīng)元組織(如脊椎動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及外周神經(jīng)系統(tǒng))，它主要抑制神經(jīng)遞質(zhì)尤其是去甲腎上腺素從交感神經(jīng)上釋放時Ca2+的進入。作用于Ca2+通道的CTX只有ω-CTX。ω-CTX G VI A從地紋芋螺中提取的，含有27個氨基酸、3個二硫鍵，屬于O超家族。它是選擇性抑制N類型Ca2+通道的毒素。MVIIA是從幻芋螺中提取的ω-CTX，也是首次進入臨床試驗的神經(jīng)Ca2+通道拮抗劑.ω-芋螺毒素MVIIA，用于癌癥、愛滋病晚期的頑痛治療，成本比鴉片類止痛劑大大降低，它比常用麻醉藥強萬倍以上，是珍貴的海洋藥物.ω-芋螺毒由于能特異作用于多種類型的鈣離子通道，并具有嚴(yán)格的生物活性特異性而受到神經(jīng)生物學(xué)家和藥理學(xué)家的重視，成為研究鑒定鈣離子通道的有效工具藥，同時在特異診斷試劑和新藥研制開發(fā)方面也具有潛在的應(yīng)用前景。以Na+離子通道為靶標(biāo)的有μ-CTX、μO-CTX和δ-CTX。其中μ-CTX的半胱氨酸模式與μO-CTX和δ-CTX的不同，前者屬于M超家族，后兩者屬于O超家族。以K+離子通道為靶標(biāo)的有κA-CTX和κ-CTX。κ-CTX屬于O超家族。Na+和K+通道是研究神經(jīng)信號的重要途徑，與之相結(jié)合的芋螺毒素在神經(jīng)科學(xué)研究和新藥開發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力巨大。
雖然已有多個O超家族的芋螺毒素肽被發(fā)現(xiàn)，但進行深入研究的不多。絕大多數(shù)海南產(chǎn)的芋螺毒素急待研究與開發(fā)。本發(fā)明針對的正是現(xiàn)有技術(shù)中的這一需求，對我國乃至世界海洋制藥將具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于的是從我國海南產(chǎn)的大理石芋螺(Conus marmoreusLinnaeus)、幻芋螺(Conus magus Linnaeus)、信號芋螺(Conuslittertus Linnaeus)、勇士芋螺(Conus miles Linnaeus)、獨特芋螺(Conus caracteristicus Fischer)、帝王芋螺(Conus ImperialisLinnaeus)、織錦芋螺(Conus textile Linnaeus)、桶形芋螺(Conusbetulinus Linnaeus)、疣蒿芋螺(Conus lividus Hwass)等共12個種中分別發(fā)現(xiàn)的具有藥用功能的O-超家族芋螺毒素肽(O-superfamilyConotoxin，O-CTX)。
因此，本發(fā)明在一個方面提供了新的O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX)。
本發(fā)明在另一方面提供了編碼所述肽的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了含有所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體，含有該核酸構(gòu)建體的表達載體，以及被所述核酸構(gòu)建體或表達載體轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了所述肽的人工合成與重組制備方法。
本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，所述芋螺毒素肽對蟑螂、棉鈴蟲、煙青蟲、水稻螟蟲、甘蔗螟蟲、荔枝椿象等害蟲有致死作用。因此，本發(fā)明的芋螺毒素可作為多肽殺蟲劑開發(fā)。其基因可用于轉(zhuǎn)化微生物(例如昆蟲桿狀病毒、大腸桿菌和酵母等)和植物，開發(fā)出新型生物農(nóng)藥，培育出抗蟲作物新品種。
本發(fā)明的芋螺毒素肽可通過結(jié)合電壓門控離子通道發(fā)揮作用，電壓門控離子通道又稱電壓敏感性通道，包括Ca2+離子通道、Na+離子通道、K+離子通道等受體，具有鎮(zhèn)痛活性。它們是新藥開發(fā)的候選藥物和先導(dǎo)藥物。
因此，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明所述肽的藥物組合物或殺蟲劑組合物。
具體實施例方式
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX)，其包含選自下組的氨基酸序列(1)SEQ ID NO1-35中任一所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO36-70中任一所示的氨基酸序列；(3)與上述(1)或(2)所述的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；或(4)因1-5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1-2個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加而與上述(1)或(2)所述的氨基酸序列有所不同的氨基酸序列。
優(yōu)選地，所述芋螺毒素肽具有的氨基酸序列與SEQ ID NO1-70至少大約85％相同，更優(yōu)選至少大約90％相同，尤其優(yōu)選至少大約95％相同，最優(yōu)選至少大約97％相同(在本文中稱作“同源肽”)。
為了本發(fā)明的目的，兩個或更多個氨基酸序列之間的相同程度是通過BLAST2.0蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢程序(Aaltschul等，1997，核酸研究253389-3402)并采用下列參數(shù)確定的blastall pblastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查詢文檔]-d prot_all，其中-p指程序名稱，-a指將要用到的服務(wù)器數(shù)，-e指期望值，-E指延伸缺口的代價，-v指單線描述(one-line description)數(shù)，-b指將要顯示的比對數(shù)，-I指查詢文檔，-d指用于查詢的數(shù)據(jù)庫。
同源多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO1-70任一所示的氨基酸序列不同之處可能在于取代、插入、添加和/或缺失了1或多個、優(yōu)選1-5個、更優(yōu)選1-3個、尤其優(yōu)選1-2個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基。優(yōu)選地，氨基酸改變是性質(zhì)改變較小的變化，即是不會顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大約5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸殘基；有多達大約20-25個殘基的小連接肽；或可通過改變凈電荷或者其它功能而有助于純化的小延伸如多聚組氨酸片段、抗原表位或結(jié)合區(qū)。
保守性取代的例子是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)內(nèi)進行的取代。通常不會改變特異活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白質(zhì)》一書，Academic Press，New York中描述過。最常見的替換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向進行的替換。
本發(fā)明還包括在本發(fā)明芋螺毒素肽的N-末端和/或C-末端融合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)已知，包括連接編碼本發(fā)明肽的編碼序列與編碼所述其它肽/多肽的編碼序列，使它們在同一讀框中，并且融合多肽的表達受控于相同的啟動子和終止子。
多核苷酸本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明所述肽的核酸序列的分離多核苷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，該多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO1-35中任一所示氨基酸序列的多肽的核酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，該多核苷酸包含SEQ ID NO71-105中任一序列中所包含的成熟肽編碼序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，該多核苷酸包含SEQ ID NO71-105中任一所示的核苷酸序列。本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO1-35中任一所示氨基酸序列的多肽的核酸序列，它與SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽編碼序列之間因遺傳密碼的簡并性而有所不同。本發(fā)明的核酸序列包括基因組序列，以及相應(yīng)的cDNA和RNA序列。此處所用術(shù)語“核酸序列”應(yīng)理解為包括合成DNA在內(nèi)的所有這類變種。
本發(fā)明還涉及編碼活性芋螺毒素肽、與SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽編碼序列有一定同源性的核酸序列，同源程度至少約為70％、優(yōu)選約80％、更優(yōu)選約90％，還要優(yōu)選的是約95％，最優(yōu)選的是大約97％同源。就本發(fā)明目的而言，兩個核酸序列間的同源程度是通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur & Lipman，1983，美國國家科學(xué)院學(xué)報80726-730)用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以及相同性表和以下多重對比參數(shù)缺口罰分和缺口長度罰分均為10確定的。成對對比參數(shù)為Ktuple＝3，缺口罰分＝3，窗口＝20。
合成與本發(fā)明所述多肽基本相似的多肽時，可能有必要對編碼本發(fā)明多肽的核酸序列進行修飾。術(shù)語與所述多肽“基本相似”是指非天然形式的多肽。這些多肽可能與從天然來源分離到的多肽在某些加工方式上不同。例如，可能希望用例如定點誘變來合成多肽的變體，這些變體有不同的熱穩(wěn)定性或最適pH等?？梢栽赟EQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽編碼部分的核酸序列基礎(chǔ)上構(gòu)建出類似序列；并/或通過引入核苷酸取代而構(gòu)建，所述取代不會使產(chǎn)生的氨基酸序列與原核酸序列編碼的多肽不同，但它們符合酶制備所用宿主生物對密碼子的使用習(xí)慣；或通過引入會產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代而構(gòu)建。關(guān)于核苷酸取代的綜述，參見例如Ford等，1991，蛋白質(zhì)表達和純化295-107。
本發(fā)明還涉及包含編碼活性芋螺毒素肽、與SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽編碼序列或其互補序列可雜交的核酸序列的多核苷酸。關(guān)于多核苷酸之間的雜交，在現(xiàn)有技術(shù)中有眾多的文獻可供參考，包括例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，1989。雜交中可以應(yīng)用各種程度的嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如中度、中度-高度，或者高度嚴(yán)謹(jǐn)條件。越嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件，形成雙螺旋要求的互補程度越高?？梢酝ㄟ^溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間等等控制嚴(yán)謹(jǐn)程度。對于雙鏈DNA基因探針，雜交于低于DNA雜合體熔解溫度[melting temperature，Tm])20-25℃下在6X SSPE、5X Denhardt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中進行過夜。清洗通常如下進行于Tm-20℃在0.2X SSPE、0.1％SDS中一次15分鐘(中度嚴(yán)謹(jǐn)條件清洗)。
對于寡核苷酸探針，雜交于低于雜合體的熔解溫度Tm 10-20℃下在6X SSPE、5X Denha rdt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中進行過夜。清洗通常如下進行于雜交溫度在1X SSPE、0.1％SDS中一次15分鐘(中度嚴(yán)謹(jǐn)條件清洗)核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述核酸序列及與之可操作連接的1或多個調(diào)控序列的核酸構(gòu)建體，所述調(diào)控序列在其相容條件下能指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中進行表達。表達應(yīng)理解為包括多肽生產(chǎn)中所涉及的任何步驟，包括，但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
“核酸構(gòu)建體”在文中定義為單鏈或雙鏈核酸分子，它們分離自天然基因，或者經(jīng)修飾而含有以非天然方式組合和并列的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含表達本發(fā)明所述編碼序列必需的所有調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與表達盒同義。術(shù)語“編碼序列”在文中定義為核酸序列中直接確定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的部分。編碼序列的邊界通常是由緊鄰mRNA 5’端開放讀碼框上游的核糖體結(jié)合位點(對于原核細(xì)胞)和緊鄰mRNA 3’端開放讀碼框下游的轉(zhuǎn)錄終止序列確定。編碼序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。
可以以多種方式操作編碼本發(fā)明所述肽的分離的核酸序列，使其表達所述肽?？赡芷谕虮仨氃诓迦胼d體之前對核酸序列進行加工，這取決于表達載體。應(yīng)用重組DNA方法修飾核酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。
本文中術(shù)語“控制序列”定義為包括表達本發(fā)明肽所必需或有利的所有組分。每個調(diào)控序列對于編碼多肽的核酸序列可以是天然含有的或外來的。這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，調(diào)控序列要包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。為了導(dǎo)入特定的限制位點以便將調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進行連接，可以提供帶接頭的調(diào)控序列。術(shù)語“可操作連接”在文中定義為這樣一種構(gòu)象，其中調(diào)控序列位于相對DNA序列之編碼序列的適當(dāng)位置，以使調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的表達。
調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，即可被表達核酸序列的宿主細(xì)胞識別的核酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選宿主細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。
調(diào)控序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即能被宿主細(xì)胞識別從而終止轉(zhuǎn)錄的一段序列。終止序列可操作連接在編碼多肽的核酸序列的3’末端。在所選宿主細(xì)胞中可發(fā)揮功能的任何終止子都可以用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，即對宿主細(xì)胞的翻譯十分重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作連接于編碼多肽的核酸序列的5’末端。在所選宿主細(xì)胞中可發(fā)揮功能的任何前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，該區(qū)編碼一段連在多肽氨基端的氨基酸序列，能引導(dǎo)編碼多肽進入細(xì)胞分泌途徑。核酸序列編碼區(qū)的5’端可能天然含有翻譯讀框一致地與分泌多肽的編碼區(qū)片段自然連接的信號肽編碼區(qū)?；蛘?，編碼區(qū)的5’端可含有對編碼序列是外來的信號肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列在正常情況下不含有信號肽編碼區(qū)時，可能需要添加外來信號肽編碼區(qū)?；蛘?，可以用外來的信號肽編碼區(qū)簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)以增強多肽分泌。但是，任何能引導(dǎo)表達后的多肽進入所用宿主細(xì)胞的分泌途徑的信號肽編碼區(qū)都可以用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是肽原編碼區(qū)，該區(qū)編碼位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被稱為酶原或多肽原。多肽原通常沒有活性，可以通過催化或自我催化而從多肽原切割肽原而轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。
在多肽的氨基末端即有信號肽又有肽原區(qū)時，肽原區(qū)緊鄰多肽的氨基末端，而信號肽區(qū)則緊鄰肽原區(qū)的氨基末端。
添加能根據(jù)宿主細(xì)胞的生長情況來調(diào)節(jié)多肽表達的調(diào)控序列可能也是需要的。調(diào)控系統(tǒng)的例子是那些能對化學(xué)或物理刺激物(包括在有調(diào)控化合物的情況下)作出反應(yīng)，從而開放或關(guān)閉基因表達的系統(tǒng)。調(diào)控序列的其他例子是那些能使基因擴增的調(diào)控序列。在這些例子中，應(yīng)將編碼多肽的核酸序列與調(diào)控序列可操作連接在一起。
表達載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號的重組表達載體?？梢詫⑸鲜龈鞣N核酸和調(diào)控序列連接在一起來制備重組表達載體，該載體可以包括1或多個方便的限制位點，以便在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列?；蛘?，可以通過將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)表達載體而表達本發(fā)明所述核酸序列。制備表達載體時，可使編碼序列位于載體中以便與適當(dāng)?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作連接。
重組表達載體可以是任何便于進行重組DNA操作并表達核酸序列的載體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇通常取決于載體與它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制型載體(即存在于染色體外的完整結(jié)構(gòu)，可獨立于染色體進行復(fù)制)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可包含保證自我復(fù)制的任何機制?；蛘?，載體是一個當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時，將整合到基因組中并與所整合到的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可應(yīng)用單個載體或質(zhì)粒，或總體包含將導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA的兩個或多個載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
優(yōu)選本發(fā)明所述載體含有1或多個便于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是這樣一個基因，其產(chǎn)物賦予對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬的抗性，或賦予營養(yǎng)缺陷體原養(yǎng)型等。細(xì)菌選擇標(biāo)記的例子如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素的抗性標(biāo)記。
優(yōu)選本發(fā)明所述載體包含能使載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中，或保證載體在細(xì)胞中獨立于細(xì)胞基因組而進行自主復(fù)制的元件。
就進行自主復(fù)制的情況而言，載體還可以包含復(fù)制起點，使載體能在目標(biāo)宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以帶有使其在宿主細(xì)胞中成為溫度敏感型的突變(參見例如，fEhrlich，1978，美國國家科學(xué)院學(xué)報751433)。
可以向宿主細(xì)胞插入1個以上拷貝的本發(fā)明核酸序列以提高該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。該核酸序列的拷貝數(shù)增加可以通過將該序列的至少1個附加拷貝插入宿主細(xì)胞基因組中，或者與該核酸序列一起插入一個可擴增的選擇標(biāo)記，通過在有合適選擇試劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞，挑選出含有擴增拷貝的選擇性標(biāo)記基因、從而含有附加拷貝核酸序列的細(xì)胞。
用于連接上述各元件來構(gòu)建本發(fā)明所述重組表達載體的操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含可用來重組生產(chǎn)多肽的本發(fā)明所述核酸序列的重組宿主細(xì)胞?？蓪景l(fā)明之核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使該載體以上述染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式得以維持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋任何由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的后代。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于多肽編碼基因及其來源。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，例如細(xì)菌或酵母細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
制備方法本發(fā)明還涉及重組制備本發(fā)明肽的方法，該方法包括(a)在適于產(chǎn)生所述肽的條件下，培養(yǎng)含有核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含編碼所述肽的核酸序列；和(b)回收該肽。
在本發(fā)明所述制備方法中，用本領(lǐng)域已知方法在合適多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以在合適的培養(yǎng)基中，在允許多肽表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批加料或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳和氮源以及無機鹽的合適的培養(yǎng)基中，采用本領(lǐng)域已知的步驟進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由供應(yīng)商提供或者可以參照公開的組成(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)來制備。如果多肽被分泌到培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以從細(xì)胞裂解物中回收。
可以用本領(lǐng)域已知方法回收所產(chǎn)生的多肽。例如，可以通過常規(guī)操作(包括，但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀)從培養(yǎng)基中回收多肽。
可以通過各種本領(lǐng)域已知的操作來純化本發(fā)明所述多肽，這些操作包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、層析聚焦、和大小排阻層析)、電泳(例如，制備性等電點聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(參見例如，蛋白質(zhì)純化，J.C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)。
轉(zhuǎn)基因動物和植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的核酸序列的動物或植物細(xì)胞，優(yōu)選小麥、玉米、水稻、大豆等植物細(xì)胞，賦予被轉(zhuǎn)化宿主新的性狀(如抗蟲性)。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，用此處公開的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化動物或植物細(xì)胞而實現(xiàn)。
用于控制害蟲的方法和制劑可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的多種方法，使用本發(fā)明的芋螺毒素肽或多核苷酸來實現(xiàn)控制害蟲。這些方法包括例如將重組微生物應(yīng)用于害蟲(或它們的所在地)、和用編碼本發(fā)明的芋螺毒素肽的基因轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)化可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)進行。此處公開了用于這些轉(zhuǎn)化的必要物質(zhì)，或者熟練的技術(shù)人員可以通過其它方法容易的獲得。
可以將配制的含有芋螺毒素肽、或包含本發(fā)明所述多核苷酸的重組微生物的制劑應(yīng)用于土壤。還可以將配制的產(chǎn)品作為種子覆料或根部處理或作物生長周期晚期的完整植株處理應(yīng)用。制劑可以包括擴散-增稠佐劑、穩(wěn)定劑、其它殺蟲添加劑、或表面活性劑。液體制劑可以是基于水的或非水的，并以泡沫、凝膠、懸浮液、可乳化濃縮物等等形式使用。成分可以包括流變劑、表面活性劑、乳化劑、分散劑、或聚合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，殺蟲劑濃度將由于特殊制劑的本性廣泛變化，特別是可作為濃縮物或直接使用。殺蟲劑將以至少1％(重量計)存在，而且可能是100％(重量計)。干燥制劑通常有大約1-95％(重量計)的殺蟲劑，而液體制劑將通常是液相中固體重量大約1-60％。含有細(xì)胞的制劑將通常含有大約102-大約104個細(xì)胞/mg。這些制劑將以每公頃大約50mg(液體的或干的)-1kg或更多的量使用。通過噴、撒、灑、等等，可以將制劑應(yīng)用于害蟲環(huán)境，例如土壤和植物。
藥物組合物本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明肽和藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑的藥物組合物。所述藥物組合物可用于緩解或治療與缺血性損傷有關(guān)的疾病或病癥。在一個實施方案中，含有治療有效量的本發(fā)明肽的藥物組合物以利于藥用的方式配制和給藥，并需考慮到個體病人的臨床狀況、運送位點、給藥方法、給藥日程安排和醫(yī)生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由這些方面的考慮決定。
含治療有效量的本發(fā)明多肽的藥物組合物可口服、非腸道給藥、腦池內(nèi)給藥等?！八帉W(xué)可接受載體”指無毒的固體、半固體或液體填充物、稀釋液、膠囊材料或任何類型的配方輔助物。本文所用術(shù)語“非腸道的”表示的給藥方式包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。本發(fā)明多肽還可通過緩釋系統(tǒng)恰當(dāng)?shù)亟o藥。
還可應(yīng)用本發(fā)明的芋螺毒素肽或基因作為有用的探針，來研究鑒定動物電壓門控離子通道(包括Ca2+、Na+和K+離子通道等)受體及其調(diào)控細(xì)胞活動分子機理的重要工具；作為分子探針來確定離子通道的不同亞型；作為分子模型，設(shè)計新藥；作為多肽殺蟲劑，開發(fā)為新型生物農(nóng)藥等。在神經(jīng)科學(xué)受體研究，在頑痛、癲癇癥、心臟血管疾病、精神病、運動失調(diào)、痙攣、癌癥、艾滋病、神經(jīng)保護、中風(fēng)等疑難雜癥的治療中有廣闊的應(yīng)用前景下面參考實施例對本發(fā)明作進一步說明。給出這些實施例只是為了舉例說明，它們不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1 O-超家族芋螺毒素基因的克隆1芋螺總RNA的提取以從海南島、西沙群島等沿海采集的織錦芋螺(Conus textileLinnaeus)、桶形芋螺(Conus betulinus Linnaeus)、疣蒿芋螺(Conuslividus Hwass)、信號芋螺(Conus littertus Linnaeus)、勇士芋螺(Conus miles Linnaeus)、獨特芋螺(Conus caracteristicus Fischer)、菖蒲芋螺(Conus vexillum Gmelin)、大尉芋螺(Conus capitaneusLinnaeus)、大理石芋螺(Conus marmoreus Linnaeus)、幻芋螺(Conusmagus L.)、玉女芋螺(Conus virgo L.)、假玉女芋螺(Conus emaciatusReeve)共12種芋螺活體為材料。用小量柱離心式組織/細(xì)胞總RNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)，或用Total RNA IsolationSystem試劑盒(Promega)，按操作手冊提取總RNA。下面以上海華舜產(chǎn)的RNA抽提試劑盒為例。
先把芋螺毒腺或毒管用液氮冷凍并研成粉末，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。樣品中加500μL TCL液(RNA裂解液，上海華舜)，混勻后12000rpm離心3分鐘→轉(zhuǎn)移上清并向上清液中加入250μL 75％的乙醇徹底混勻→移入RNA吸附柱中，10000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中→加500μL RP液(去蛋白液)，10000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中→加500μL W3液(洗滌液)，10000rpm離心15秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中→同法用W3液洗兩次10000rpm離心1分鐘→將吸附柱移入另外一個干凈的1.5mL離心管中→在吸附膜中央加入50u l純水溶解RNA，室溫凈置1分鐘10000rpm離心1分鐘→將1.5mL離心管放-70℃保存。
2 cDNA的合成以步驟1提取的總RNA為模板，分別以O(shè)ligo(dT)15和3′-RACEAdapter Primer為引物，采用兩種方法合成cDNA。分述如下。
方法1、采用ThermoScriptTM RNase H-Transcriptase試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。
反應(yīng)成分3′-RACE引物(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGTAC(T)17-3’)，0.5μg，總RNA 2μg，1mmol.1-1 dNTP混合物，重蒸水，5×cDNA合成緩沖液，0.1mol.1-1 DTT，RNaseOUTTM重組核糖核酸酶抑制劑(RNaseOUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor)，ThermoScriptTM RT 20U。反應(yīng)總體積為20μl。反應(yīng)程序先將總RNA模板在65℃溫浴5min，再加入其他成分；反應(yīng)液于50℃溫育60min，85℃溫育5min終止反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放-20℃保存。
方法2、采用AMV Transcriptase試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。
反應(yīng)成分0.5μg Oligo(dT)15，2μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄緩沖液，1mmol.1-1dNTP，20U重組RNA酶抑制劑核糖核酸酶抑制劑(RecombinantRnasin Ribonuclease Inbibitor)，25U AMV反轉(zhuǎn)錄酶，重蒸水。反應(yīng)總體積為20μl。反應(yīng)程序先將總RNA在70℃溫育10min，再加入其他反應(yīng)成分；于42℃溫育1h，95℃終止反應(yīng)5min；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放-20℃保存。
取5μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行1％瓊脂糖電泳檢測。
3 反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)(RT-PCR)和3-RACE擴增以步驟2合成的cDNA為模板，根據(jù)O-超家族芋螺毒素信號肽區(qū)域保守區(qū)和3’非翻譯區(qū)序列(文獻1 Thomas F.Duda Jr，Stephen R.Palumbi.Molecular genetics of ecological diversificationDuplication and rapid evolution of toxin genes of the venomousgastropod Conus.Evolution，1999，96(12)6820-6823.文獻2Silvestro G.Conticello，Yoav Gilad et al.Mechanisms forEvolving HypervariabilityThe Case of Conopeptides.MolecularBiology and Evolution.2001，18120-131.)，設(shè)計O-超家族CTX引物共8條上游引物、3條下游引物(引物配對見下文表3)和3-RACE接頭引物(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3’)，分別進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)總體積為25ul，包括cDNA模板50ng，10×PCR buffer，200uMdNTPs，1umol上游引物與下游引物或3′-RACE接頭引物(5’GGC CACGCG TCG ACT AGT AC 3’)，2mM MgCl2，1U Taq酶和去離子水。循環(huán)程序94℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性30秒，50℃(或55℃)退火30秒，72℃延伸30秒，35個循環(huán)后，72℃再延伸2分鐘。PCR擴增產(chǎn)物取5ul點樣，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4 PCR產(chǎn)物的克隆與測序回收上述特異PCR產(chǎn)物，與T-easy載體(Promega)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1菌株(發(fā)明人實驗室保存)，利用藍白菌落和氨芐青霉素抗性挑選重組子，抽提純化重組子質(zhì)粒用于測序分析。經(jīng)序列分析比較，獲得了本發(fā)明所述的35種新型O-超家族芋螺毒素成熟肽(O-CTX，SEQ IDNO1-35)。成熟肽是根據(jù)其前肽(SEQ ID NO36-70)及芋螺毒素特點推測而來，前肽是根據(jù)前體基因(SEQ ID NO71-105)推測而來。O-CTX編號及其來源芋螺種類等情況列于表3。
35種O-超家族芋螺毒素成熟肽(O-CTX，SEQ ID NO1-35)序列見表4。35種O-CTX前肽(O-CTX，SEQ ID NO36-70)序列見表5。35種O-CTX的編碼多核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO71-105)見表6。
表3 O-超家族芋螺毒素肽(SEQ ID NO1-35)、前肽(SEQ ID NO36-70)及其編碼多核苷酸(SEQ ID NO71-105)編號和來源


注SEQ ID NO77-86；96-105的下游引物均為3’-RACE adapter(20bp)5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’
表4 O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX，SEQ ID NO1-35)的序列

表5 35種O-超家族芋螺毒素前肽序列(SEQ ID NO36-70)


表6 O-CTX編碼多核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO71-105)











實施例2 O-超家族芋螺毒素MiEr93M(SEQ ID NO10)、MgJr93M(SEQ ID NO14)和CaFr179M(SEQ ID NO33)的合成根據(jù)芋螺毒素肽MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M的氨基酸序列，采用Fmoc方法人工合成了這三種多肽。具體方法如下。
采用固相合成法中的Fmoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成儀上合成了上述三條芋螺毒素肽。Fmoc氨基酸的側(cè)鏈保護基為Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)，OBut(Asp)，Boc(Lys).采用Fmoc HOBT DCC方法，Rink樹脂及Fmoc氨基酸，合成步驟參考儀器合成手冊進行。為反應(yīng)完全，在哌啶脫保護及偶合時間上分別適當(dāng)延長，對難接氨基酸采用雙偶合?；厥站€性肽粗品，用250*4.6mm，Hypersil ODS-2柱純化，線性肽純度達70％以上，并通過質(zhì)譜(MS)鑒定。MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M的分子量分別為2732.16，2797.2和3501.0。線性肽凍干后用于氧化折疊。
實施例3 芋螺毒素MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M線性肽氧化折疊純化的還原性線性肽MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M在室溫下分別氧化折疊24h。氧化折疊緩沖液組成為0.1M醋酸銨(pH 7.8)，20μM充分還原的線性肽，還原型(GSH)和氧化型(GSSG)谷胱苷肽。緩沖液中肽∶GSH∶GSSG的濃度比例為1∶50∶5。氧化反應(yīng)結(jié)束時，用TFA(trifluoroacetic acid)調(diào)pH至23以終止氧化反應(yīng)。用液相層析系統(tǒng)(Bio-Rad)純化肽。反應(yīng)混合物載入一制備層析柱(4.6×250mm，Sinochrom ODS-BP)，流速1ml/min，用0.1％TFA洗脫，直到所有的反應(yīng)液被洗提完全。溶劑A是0.1％TFA的乙腈溶液，溶劑B是0.1％TFA的水溶液。梯度洗脫(10％→100％A，90％→0％B，30分鐘)可純化出95％的氧化折疊后的活性肽。
實施例4 MiEr93M和CaFr179M抗蟲活性的測試。
參照Xiu-hong Wang，Ross Smith et al，Structure functionstudies of ω-atracotoxin，a potent antagonist of insectvoltage-gated calcium channels.Eur.J.Biochem.264，488-494(1999)的方法，測試MiEr93M和CaFr179M的抗蟲活性.將MiEr93M和CaFr179M分別以不同的濃度注射到蟑螂(Periplaneta americana)、棉鈴蟲(Heliothis armigera Huber)、煙青蟲(Heliothis assultaGuenee)、水稻螟蟲(三化螟，Tryporyza incertulas(Walker))、甘蔗螟蟲(Chilo infuscatellus Snellen)、荔枝椿象(Tessaratomapapillosa)的幼蟲或若蟲(體重30 180mg)體內(nèi)，觀察48h內(nèi)蟲體的反應(yīng)情況。每只昆蟲用微量注射器注射5μL到腹部中央，注射前蟲體暫時置冰上防止昆蟲運動。對照同時注射5μL蒸餾水(ddH2O)或5μL昆蟲生理鹽水.兩種毒素分別用昆蟲生理鹽水(200mM NaCl，3.1mM KCl，5.4mM CaCl2，5mM MgCl2，2mM NaHCO3，0.1mM NaH2PO4，pH 7.2)配制。毒素濃度為10 103pmol(每克體重)。每組10只昆蟲，記錄注射后48h內(nèi)的死亡率。計算害蟲半致死劑量LD50。
計算公式為y＝(a-b)LD50/x LD50＝xy/(a-b)y是注射后48h樣本群體的死亡百分率，x是中毒劑量(pmol·g-1)，a是最大反應(yīng)劑量，b是最小反應(yīng)劑量。LD50是害蟲半致死劑量。
結(jié)果表明(表7)，MiEr93M和CaFr179M對上述害蟲的半致死劑量LD50差異不大，MiEr93M的LD50較CaFr179M的略低。MiEr93M的LD50分別為LD50蟑螂75±6pmol·g-1、LD50棉鈴蟲81±7pmol·g-1、LD50煙青蟲66±5pmol·g-1、LD50水稻螟蟲78±7pmol·g-1、LD50甘蔗螟蟲68±6pmol·g-1、LD50荔枝椿象63±5pmol·g-1。
CaFr179M的LD50分別為LD50蟑螂103±11pmol·g-1、LD50棉鈴蟲108±12pmol·g-1、LD50煙青蟲86±7pmol·g-1、LD50水稻螟蟲94±9pmol·g-1、LD50甘蔗螟蟲88±7pmol·g-1、LD50荔枝椿象76±5pmol·g-1。當(dāng)MiEr93M濃度達到180pmol·g-1時，當(dāng)CaFr179M濃度達到220pmol·g-1時，所試?yán)ハx死亡率均為100％，而對照組死亡率不到6％，個別對照死亡多因注射操作引起。因此MiEr93M和CaFr179M對所試?yán)ハx均有很強的致死作用，且MiEr93M殺蟲力更強。
表7 MiEr93M和CaFr179M對害蟲的半致死劑量LD50(pmol·g-1)

實施例5 測試MgJr93M的鎮(zhèn)痛活性利用小鼠熱板試驗測定了來自幻芋螺(C.magus)的SEQ ID NO14MgJr93M肽的鎮(zhèn)痛活性.
測試用昆明小鼠體重為(20g±2g)。小鼠采用側(cè)腦室給藥，每只注射10μL含不同濃度MgJr93M毒素肽的鹽溶液(150mM NaCl)，用熱板法測量小鼠腳部受熱鎮(zhèn)痛后舔后足或抬后足并回頭時間為痛閾時間，60s為100％鎮(zhèn)痛。注射后觀察小鼠的反應(yīng)。設(shè)5個劑量濃度0、5、10、20、30ng/只，每劑量5只小鼠。結(jié)果表明(表8)MgJr93M劑量為5ng/只，鎮(zhèn)痛活性(熱板法)為55±20s，在60s附近，鎮(zhèn)痛活性明顯；當(dāng)劑量大于或等于10ng/只時，鎮(zhèn)痛活性大于60s，且作用4h以上。因此MgJr93M具有強大的鎮(zhèn)痛活性。
表8 O-CTX MgJr93M肽對小鼠的活性

上述實施例只是為了闡明、而不是限制本發(fā)明。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚地知道，可對本文所述的內(nèi)容作其它適當(dāng)?shù)男揎椇妥兓⒖稍诒景l(fā)明或其任何實施方案的范圍內(nèi)進行這種修飾和變化。這樣的修飾和變化都落入本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種O-超家族芋螺毒素肽，其包含選自下組的氨基酸序列(1)SEQ ID NO1-35中任一所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO36-70中任一所示的氨基酸序列；(3)與上述(1)或(2)中任一所示的氨基酸序列至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、尤其優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少97％相同的氨基酸序列；或(4)因1-5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1-2個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加而與上述(1)或(2)中任一所示的氨基酸序列有所不同的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的芋螺毒素肽，其具有選自SEQ ID NO1-70中任一所示的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述O-超家族芋螺毒素肽的多核苷酸。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸，其包含選自下組的核苷酸序列(1)編碼SEQ ID NO1-70中任一所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)EQ ID NO71-105中任一所示的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO71-105中任一所示核苷酸序列中的相應(yīng)成熟肽編碼序列；或(4)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
5.一種核酸構(gòu)建體，其中包含權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸，以及與之可操作連接、可指導(dǎo)多肽在適當(dāng)表達宿主中生產(chǎn)的一個或多個控制序列。
6.一種表達載體，其中包含權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建體。
7.一種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求6的表達載體。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，它是原核細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞，或者真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，或植物細(xì)胞，例如小麥、玉米、水稻、大豆細(xì)胞等。
9.一種藥物組合物，其中包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1或2所述芋螺毒素肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種殺蟲劑組合物，其中包含殺蟲有效量的權(quán)利要求1或2所述芋螺毒素肽以及任選的載體。
11.一種融合蛋白，其中包含權(quán)利要求1或2所述的芋螺毒素肽以及與之相融合的其它氨基酸序列。
12.一種殺滅害蟲的方法，包括對含有所述害蟲的位點使用權(quán)利要求10的殺蟲劑組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的O－超家族芋螺毒素肽(O－Conotoxin，O－CTX)，編碼所述肽的多核苷酸，含有該多核苷酸的構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以及重組生產(chǎn)所述肽的方法。本發(fā)明還涉及所述芋螺毒素肽的人工合成和用途。
文檔編號A61K38/17GK1796412SQ20041010356
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者羅素蘭, 長孫東亭, 張本, 林秋金 申請人:海南大學(xué)